L&#39;auteur est un de Parkinson britannique Research Fellow (bourse F1002). Ce travail a été soutenu en partie par le Wellcome Trust / MRC Appel conjoint dans l&#39;attribution neurodégénérescence (WT089698) au Consortium la maladie de Parkinson du Royaume-Uni (UKPDC) dont les membres proviennent de l&#39;Institut UCL de la neurologie, de l&#39;Université de Sheffield et l&#39;unité MRC Protein Phosphorylation au l&#39;Université de Dundee.

Sécurité Le protocole décrit ci-dessous utilise l&#39;ATP étiquetés avec radioactifs 32 P à la position du phosphate γ de suivre l&#39;activité kinase de LRRK2. Il est basé sur les protocoles standards utilisés dans notre laboratoire, et donc à l&#39;égard de la plupart des étapes dans le processus comme la course, les gels, western blot, et cetera les matériaux et les conditions précises doivent être prises comme un guide que les équipements et les protocoles utilisée pour ces opérations varie d&#39;un laboratoire à l&#39;. Composés contenant des isotopes qui émettent des rayonnements ionisants sont potentiellement nuisibles pour la santé humaine et de licence et des règlements stricts à un contrôle de niveau institutionnel et national leur utilisation. Les expériences dans ce protocole ont été effectués après la formation en cours d&#39;utilisation source de rayonnement ouverte à l&#39;University College de Londres et en suivant le guide des bonnes pratiques de laboratoire fournis par les services de sécurité au collège (directives available au <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). L&#39;utilisation de l&#39;open source de rayonnement ne doit pas être tenté avant la formation appropriée et l&#39;approbation réglementaire. L&#39;organisme de réglementation responsable de l&#39;open source de rayonnement dans la recherche en laboratoire varie de pays à pays. En voici quelques exemples: au Royaume-Uni, le Health and Safety Executive ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ), aux États-Unis, la Nuclear Regulatory Commission ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / matériaux / miau / regs-guides-comm.html</a> ), au Canada, la Commission canadienne de sûreté nucléaire ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), et en Allemagne Das Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / BFS</a> ). Les utilisateurs d&#39;autres pays devraient confirmer les règles, les règlements et les autorités de licence avec leur responsable de la radioprotection. Précautions d&#39;emploi pertinentes à ce protocole ont été notées dans le texte, a souligné avec le symbole radioactif corniculé ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> ). 1. Préparer les réactions kinase <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Tous les mélanges de réaction préparés dans des tubes d&#39;échantillon 1.5ml avec bouchons à vis contenant un joint torique pour empêcher la propagation de la radioactivité. <ol><li> Dégel des protéines sur la glace - LRRK2 de type sauvage, D1994A, G2019S. </li><li> composent de réaction sur glace - 10 nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul de tampon kinase 10x, 50 pl effectués jusqu&#39;à l&#39;eau. </li></ol> 2. Exécution du test <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Toutes les étapes en utilisant 32 P ATP devrait prendre pdentelles dans les zones de rayonnement désigné. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Des équipements de protection individuelle doit être porté - selon la procédure d&#39;exploitation standard dans notre laboratoire, notamment blouse, des gants et des lunettes de protection à double. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Les échantillons contenant 32 P ATP doivent être protégés contre les utilisateurs d&#39;écrans en plexiglas de 6mm à minimiser l&#39;exposition. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Le cas échéant, des dispositifs de surveillance personnelle doit être utilisée - au sein de l&#39;UCL, tout utilisateur d&#39;ouvrir certifié source de rayonnement doit avoir un film badge pour contrôler l&#39;exposition aux radiations lors des expérimentations. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Toutes les surfaces d&#39;expérimentation doivent être évalués pour la contamination radioactive avant et après utilisation en utilisant une Geiger comptoir. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Tous les consommables potentiellement contaminés doivent être éliminés dans le strict respect des directives institutionnelles pour l&#39;élimination des déchets radioactifs. <ol><li> Avant de commencer essai, mis en blocs de chauffage à 30 ° C et 100 ° C respectivement </li><li> Retirer 32 P ATP à partir congélateur à -20 (à noter que les conditions de stockage vient 32p ATP peuvent varier selon le fournisseur ou le type de radionucléides utilisés). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> scan en dehors du flacon avant utilisation, décongeler derrière l&#39;écran en plexiglas. </li><li> Avec des réactions sur la glace, ajouter 1 microlitre de 32 P ATP à chaque avec 10 uM d&#39;ATP froid. </li><li> Mélangez bien avec une pipette. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Centrifugeuse impulsion d&#39;apporter liquides au fond du tube, en minimisant les risques de contamination. </li><li> Retirer aliquot 15μl pour zéro point dans le temps uneD fin de réaction dans aliquote par addition de tampon d&#39;échantillon 5uL de 4x SDS et dénaturation à 100 ° C pendant 10 minutes. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Centrifugeuse impulsion d&#39;apporter liquides au fond du tube, en minimisant les risques de contamination. </li><li> Échantillon restant placé dans le bloc de chauffage et incubées à 30 ° C pendant 60 minutes. </li><li> 15μl enlevé à 60 points de temps de réaction minute et terminée par l&#39;addition d&#39;un tampon d&#39;échantillon 5uL de 4x SDS et dénaturation à 100 ° C pendant 10 minutes. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Centrifugeuse impulsion d&#39;apporter liquides au fond du tube, en minimisant les risques de contamination. </li></ol> 3. Immunoblot les échantillons et l&#39;analyse des résultats <ol><li> Échantillons analysés sur SDS-PAGE <ol><li> 10 ainsi gel de polyacrylamide 4-12% Bis-tris préparés pour l&#39;électrophorèse en utilisant du tampon MOPS cours d&#39;exécution. </li><li> 20 pi de chaque échantillon chargé sur un gel avec 7μl de dièseséchelle de Tain protéine standard. </li><li> Gel fonctionner à 160V pendant 90 minutes, ou jusqu&#39;à l&#39;avant de teinture a atteint la fin du gel. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Tous les liquides en contact avec des radio-isotopes doivent être traités comme des déchets radioactifs et éliminés conformément aux directives institutionnelles. Réglementations UCL Etat que le liquide des déchets radioactifs doivent être jetés en versant le bas désignés lavabos avec eau radioactive évacuation copieuse. </li></ol></li><li> Protéines transférées à membrane de PVDF par western blot. <ol><li> Tampon de transfert préparé, 1x Tris Glycine, plus 20% de méthanol. Membrane PVDF et le papier filtre coupe pour corriger la taille de gel et activé avec du méthanol glaciaire dans le cas de la membrane ou de pré-mouillé avec du tampon de transfert dans le cas du papier filtre. La membrane doit être pré-étiquetées à l&#39;encre de stylo à bille pour permettre l&#39;identification de l&#39;orientation. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbole 1" /> Gel retiré de plastIC boîtier et d&#39;acrylamide plus retirés et éliminés comme des déchets radioactifs. </li><li> Le gel doit être formé dans un sandwich avec la membrane et du papier filtre, assurant qu&#39;aucune bulle existent entre la membrane et le gel, puis disposées dans l&#39;appareil western blot avec la membrane entre le gel et l&#39;anode. </li><li> Transfert effectué à 25V pendant 16 heures. </li></ol></li><li> Après le transfert de protéines pour le PVDF, la membrane doit être séché à température ambiante. Enfin, la membrane sèche doit être isolé entre deux feuilles d&#39;acétate de cellulose et exposés soit à un écran phosphore ou un film radiographique pour permettre la détection de protéines radiomarquées. Le temps d&#39;exposition peut fonctionner de plusieurs heures à plus d&#39;une semaine en fonction de l&#39;activité spécifique du radio-isotope utilisé et la cinétique enzymatique de la réaction. </li><li> Phosphoscreen numérisés / film traité. Si vous utilisez un écran fluorescent, l&#39;image doit être sauvegardé comme un fichier TIFF haute résolution ou un fichier bitmap, si vous utilisez du film, puis la résultante TRANsparency doivent être numérisés à l&#39;aide d&#39;un scanner de bureau et enregistrées au format TIFF haute résolution ou un fichier bitmap. L&#39;image peut ensuite être analysé dans ImageJ, un programme freeware disponible sur le site Web de National Institutes of Health ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La figure 1 montre des résultats représentatifs pour une analyse effectuée à l&#39;aide de type sauvage, et G2019S LRRK2 D1994A avec la protéine de myéline de base comme substrat accepteur de phosphate génériques. Autophosphorylation de LRRK2 est visible à ≈ 200kDa, avec plusieurs bandes représentant MBP phosphorylées visibles à partir de 20-40kDa. Notez l&#39;absence de l&#39;autophosphorylation dans le D1994A (kinase morts) lane, et augmenté la phosphorylation due à la mutation G2019S. Notez aussi la phosphorylation de MBP résiduelle dans la voie de la kinase morts. Cela peut être dû à l&#39;ablation incomplète de l&#39;activité kinase de LRRK2 par le mutant D1994A ou refléter la présence of traces contaminer kinases dans la réaction. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1.

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. 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J. 276, 466-478 (2009).</li><li>Daniels, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).</li><li>Jaleel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+phosphorylates+moesin+at+Thr558;+characterisation+of+how+Parkinson's+disease+mutants+affect+kinase+activity.">LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity.</a> Biochem. J. , (2007).</li><li>Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. 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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce document décrit un protocole de base pour le dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 en utilisant un système in vitro. Dans le souci de brièveté, ce qui a été limité à un modèle d&#39;une heure le point final en utilisant un substrat générique, mais le protocole général est applicable à une gamme de substrats potentiels et se prêtent à des analyses plus sophistiquées examiner la cinétique de l&#39;activité kinase de LRRK2 . Cela souligne l&#39;un des principaux avantages d&#39;utiliser un système in vitro pour examiner le comportement d&#39;une protéine kinase comme celui-ci: parce qu&#39;il ya un contrôle complet sur ​​les concentrations de l&#39;enzyme et le substrat, il est possible de générer des données cinétiques et de calculer K m et V les valeurs max de la réaction. Pour de plus amples évaluations détaillées cinétique ou d&#39;évaluer l&#39;impact des inhibiteurs putatifs, un système de débit plus élevé (tel que celui fourni en utilisant le substrat LRRKtide, disponible chez Invitrogen) est un supérieur alternative à l&#39;approche décrite ici. Il est important, cependant, de reconnaître que le système modèle réductionniste fournies par des essais de kinase in vitro n&#39;est qu&#39;un outil permettant d&#39;examiner la biologie de la kinase et de ses relations avec les substrats potentiels. Les données provenant de tests comme celui-ci devrait être utilisé en conjonction avec d&#39;autres approches pour obtenir une image complète de la façon dont se comporte une kinase in vitro et dans un contexte cellulaire. Par exemple, un substrat putatif phosphorylée in vitro peuvent être analysés par spectrométrie de masse pour identifier phosphosites possibles qui peuvent ensuite être manipulées par mutagenèse ciblée (par ex. Sérine ou thréonine convertissant des résidus accepteur de phosphate à aucun phosphorylable résidus tels que l&#39;alanine) pour examiner le fonctionnement conséquences de la phosphorylation ex vivo. Une considération clé dans l&#39;interprétation des données d&#39;un système de test in vitro, comme cela est probable d&#39;eitheR type I ou II (faux positif ou faux négatif) des erreurs. Le caractère réductionniste de ce système dispose malheureusement il à la fois - dans le cas de l&#39;ancien, ayant un substrat purifiés putative kinase et purifié à proximité artificiellement étroite et à forte concentration (par rapport au milieu cellulaire) peuvent entraîner des événements de phosphorylation artéfactuelle. Inversement, de nombreuses kinases fonctionner comme partie d&#39;un complexe dans le contexte de la cellule, et nécessitent des co-facteurs de la phosphorylation d&#39;un substrat donné de se produire. Comme indiqué précédemment, un résultat positif de la phosphorylation d&#39;un substrat putatif utilisant un système de dosage in vitro doivent ensuite être testés dans un système cellulaire pour valider le résultat, et un résultat négatif doit être interprété avec prudence. Dans cette optique, il est essentiel, si possible d&#39;avoir des contrôles positifs et négatifs afin de permettre une étude comparative de l&#39;activité kinase de votre intérêt. Une sélection rigoureuse d&#39;un contro positifsL qui a une activité connue vers votre protéine d&#39;intérêt, avec un contrôle négatif qui est peu probable de phosphoryler votre substrat putatif, est extrêmement précieux. Un candidat pour le contrôle LRRK2 est un récepteur kinase interagissant 3, qui a une séquence étroitement liés aux primaires du domaine kinase de LRRK2 mais a une structure très différente de domaine global 18. Ceci est disponible en tant que protéine recombinante chez Invitrogen et est utilisé comme un contrôle standard dans notre laboratoire. Il convient également de noter que le formulaire disponible dans le commerce de la LRRK2 manque la N-terminale de la protéine et est étiqueté avec la glutathion-S-transférase et cela devrait être pris en considération comme un facteur potentiel de confusion lors de la réalisation des essais avec cette protéine kinase, comme on ne sait pas quel rôle la N-terminale de LRRK2 pourraient jouer dans la fonction normale de cette protéine. Si, par exemple, la partie N-terminale de LRRK2 qui est absente dans la protéine utilisée dans le présent protocoleIl est essentiel pour le recrutement d&#39;un substrat spécifique au domaine kinase de LRRK2 alors cela aura un impact majeur sur la phosphorylation observée de ce substrat dans le système in vitro décrit ci-dessus. Même avec ces réserves, cependant, l&#39;importance attachée à la biologie de LRRK2 dans la recherche de Parkinson souligne l&#39;utilité de ce protocole comme un outil précieux pour étudier le comportement de cette protéine dans une dans la mise en vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> LRRK2 de type sauvage </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> G2019S LRRK2 </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon kinase </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> Sigma </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P g ATP </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mmol </td></tr><tr><td> 4x tampon échantillon LDS </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Normes de protéines </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> MOPS Tampon </td><td> InvitrOgen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Gel d&#39;acrylamide bis-tris </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12% 1mm 10well </td></tr><tr><td> Une membrane de PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de transfert </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs Distillée et eau désionisée a été utilisée pour toutes les étapes de dilution <table border="1"><tbody><tr><td> Type d&#39;équipement </td><td> Société </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Compteur Geiger </td><td> Instruments Mini </td><td></td></tr><tr><td> SDS-PAGE du réservoir </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Réservoir de transfert </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Blocs de chaleur (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Écran phosphorique </td><td> GE </td><td> X-ray film peut être substitué </td></tr><tr><td> Phosphore iMager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Cassette d&#39;exposition </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex blindage </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes 1.5ml </td><td> VWR </td><td> Bouchon à vis avec joint torique </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Équipement

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

Kinase Leucine Rich Repeat 2 (LRRK2) est un acide aminé 2527 membres de la famille ROCO de protéines, possédant une structure complexe et multidomaine, y compris un domaine GTPase (appelé ROC pour Ras de protéines complexes) et un domaine kinase 1. La découverte en 2004 de mutations dans LRRK2 qui causent la maladie de Parkinson (MP) a abouti à LRRK2 être l&#39;objet d&#39;un énorme volume de recherche dans leur fonction normale et comment la protéine se passe mal dans l&#39;état 2,3 maladie. L&#39;enquête initiale sur la fonction de LRRK2 concentré sur ses activités enzymatiques 4-6. Même si une image claire n&#39;a encore émerger d&#39;une altération uniforme dans ces dues à des mutations, des données à partir d&#39;un certain nombre de groupes a souligné l&#39;importance de l&#39;activité kinase de LRRK2 dans la mort cellulaire liée à des mutations 7,8. Des publications récentes ont rapporté des inhibiteurs ciblant l&#39;activité kinase de LRRK2, fournissant un outil clé expérimentale 9-11. À la lumière de ces données, ilest probable que les propriétés enzymatiques de LRRK2 nous offrent une fenêtre importante sur la biologie de cette protéine, bien qu&#39;ils soient des cibles potentielles de médicaments pour la maladie de Parkinson est ouvert au débat. Un certain nombre d&#39;approches différentes ont été utilisées pour doser l&#39;activité kinase de LRRK2. Initialement, les analyses ont été effectuées en utilisant épitope protéine marquée surexprimé dans des lignées cellulaires de mammifères et immunoprécipité, avec les essais réalisés à l&#39;aide de cette protéine immobilisée sur des billes d&#39;agarose 4,5,7. Par la suite, purifié des fragments recombinants de LRRK2 dans la solution ont également été utilisés, par exemple un fragment TPS marqués purifiés à partir de cellules d&#39;insectes contenant des résidus 970 à 2527 de la LRRK2 12. Récemment, Daniels et al. Rapporté l&#39;isolement de la LRRK2 pleine longueur en solution à partir de cellules embryonnaires de rein, mais cette protéine n&#39;est pas largement disponible 13. En revanche, la fusion TPS tronquée forme de LRRK2 est commercialement disponibe (de Invitrogen, voir le tableau 1 pour les détails), et fournit un outil pratique pour démontrer un dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2. Plusieurs sorties différentes pour LRRK2 activité de la kinase ont été signalés. Autophosphorylation de LRRK2 lui-même, la phosphorylation de la protéine de myéline de base (MBP) comme substrat kinase générique et phosphorylation d&#39;un substrat artificiel - LRRKtide surnommé, basée sur la phosphorylation de la thréonine 558 en Moesin - ont tous été utilisés, comme l&#39;ont fait une série de substrats physiologiques putatifs y compris les α-synucléine, Moesin et 4-EBP 14-17. Le statut de ces protéines en tant que substrats pour la LRRK2 reste incertaine, et comme tel le protocole décrit ci-dessous porteront sur l&#39;utilisation de MBP comme substrat générique, en notant l&#39;utilité de ce système à l&#39;activité kinase de dosage LRRK2 dirigée contre une gamme de substrats potentiels.

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l&#39;activité kinase de cette protéine s&#39;est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce papier,<em&gt; In vitro</em&gt; Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 et une sélection de ses mutants est décrite, en fournissant un système expérimental pour examiner la phosphorylation de substrats putatifs et le dysfonctionnement potentiel de LRRK2 dans la maladie.

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

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Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.5K vues.  UCL Institute of Neurology. Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l'activité kinase de cette protéine s'est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce papier, In vitro Dosage de l'activité kinase de LRRK2 et une sélection de ses mutants est décrite, e...

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Recherche

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Détection directe de l&#39;activité Acétate de formation de l&#39;acétate kinase Enzyme

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Mesure de larves activité dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Moniteur d&#39;activité

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

Mesure<em&gt; In vitro</em&gt; Activité ATPase pour Enzymatic Caractérisation

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...