Ce projet a été financé par le Land de Bade-Wurtemberg ainsi que par l&#39;Union européenne, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Les auteurs remercient Rainer Wittig (ILM Ulm) pour fournir la lignée cellulaire U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 et Claudia Hintze d&#39;assistance technique habile.

1 cellule en croissance sphéroïde et incubation <ol><li> Expérience 1: cellules sphéroïdes incubées avec un médicament chimiothérapeutique <ol><li> Préparer agarose à 1,5% dans du milieu de culture par addition de 0,45 g d&#39;agarose à 30 milieu de culture ml (suffisamment pour plaques 6). </li><li> Chauffer le mélange de l&#39;étape 1.1.1 à au moins 80 ° C en agitant de temps en temps. </li><li> Remplissez 50 pi du mélange chauffé de l&#39;étape 1.1.2 dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits et laisser solidifier dans 1-2 heures. Conserver les plaques fermés et couverts dans le réfrigérateur à 5 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Graine environ 150 cellules MCF-7 du cancer du sein dans chaque puits de la plaque préparée de 96 puits en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec du milieu F-12 culture de Ham supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS) et 1% de pénicilline / streptomycine . </li><li> Cultiver sphéroïdes de 5-7 jours jusqu&#39;à un diamètre d&#39;environ 200 à 300 um dans un incubateur à 5% de CO 2 et 3776; C. </li><li> Incuber les sphéroïdes de cellules avec le chlorhydrate de doxorubicine antibiotique anthracycline pendant 6 heures à une concentration comprise entre 2 et 8 uM uM (dans du milieu de culture) dans un incubateur à 5% de CO 2 et 37 ° C. </li><li> Laver les sphéroïdes de cellules avec du milieu de culture ou solution saline équilibrée de Earle (EBSS) avant à la microscopie. </li></ol></li><li> Expérience 2: Procédé d&#39;oxydation sphéroïdes exprimant un capteur redox <ol><li> Graine environ 400 cellules de glioblastome U251 MG-L106-transfectées de manière permanente avec la sonde redox du glutathion fluorescent sensible au vert Grx1-roGFP2 dans des puits revêtues de gel d&#39;agarose (procédé décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.3) d&#39;une plaque à 96 puits dans du DMEM milieu de culture supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline / streptomycine et l&#39;hygromycine B (150 ug / ml). </li><li> Cultivez sphéroïdes pour 5-7 jours jusqu&#39;à un diamètre d&#39;environ 200-300 um dans un incubateur à 5% de CO 2 et 37 ° C. </li><li> Ajouter 10 &amp; #181; l de solution de peroxyde d&#39;hydrogène (purum pa, ≥ 30%) à 990 de l&#39;eau bi-distillée ul de créer un mM solution 100 à être utilisé dans les 12 heures. </li><li> Diluer la solution mère de l&#39;étape 1.2.3 à 50 uM dans EBSS juste avant l&#39;expérience. </li><li> Incuber les sphéroïdes de cellules par l&#39;intermédiaire du système microfluidique lors de la mesure avec le peroxyde d&#39;hydrogène à 50 uM EBSS pour l&#39;oxydation de la sonde redox. </li></ol></li><li> Expérience 3: Initiation et l&#39;étiquetage de la nécrose cellulaire dans sphéroïdes <ol><li> Semences environ 400 cellules (par exemple, les cellules de glioblastome U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) dans les puits revêtues de gel d&#39;agarose (procédure décrite dans les étapes 1.1.1-1.1.3) d&#39;une plaque de 96 puits dans un milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de SVF, 1% de pénicilline / streptomycine et l&#39;hygromycine B (150 mg / ml). </li><li> Cultivez sphéroïdes pour 5-7 jours jusqu&#39;à un diamètre d&#39;environ 200-300 um dans un incubateur à 5% de CO 2 et 37 ° C. </li><li> Incuber les cellulessphéroïdes avec le transport d&#39;électrons mitochondriale inhibiteur roténone pendant 3 heures à une concentration de 1 uM dans du milieu de culture pour induire une nécrose cellulaire. En outre, la co-incuber avec un colorant vert de cytotoxicité pendant 3 heures à une concentration de 1 ul à 1 ml de milieu de culture pour marquer les cellules nécrotiques. </li><li> Laver les sphéroïdes de cellules avec du milieu de culture ou EBSS avant à la microscopie. </li></ol></li></ol> 2. nappe de lumière Réglage NOTE: Pour la réalisation de meilleurs résultats, il faut veiller à ce que la taille du faisceau de la nappe de lumière est dans le plan de mise au point de l&#39;objectif. La position de la taille du faisceau ne peut être alignée par l&#39;observation de la nappe de lumière dans la position verticale par rapport au capillaire (voir les étapes 2.5 à 2.8). <ol><li> Utilisation d&#39;un microscope inversé et monter le module d&#39;excitation de SPIM, comme décrit dans la réf. 16, à la plaque de base de la table de positionnement (voir figure 1A). </li><li> Équiper le microscope avec un 10X / ou 20X 0,3 / 0,5 objectif de microscope et un filtre passe-temps approprié (par exemple, λ ≥ 515 nm) dans le trajet de détection du microscope. </li><li> Monter une caméra intégrant à l&#39;orifice de détection du microscope. </li><li> Utiliser un faisceau collimaté d&#39;un laser parallèle ou une diode laser avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 470 nm de préférence et de l&#39;appliquer au module de SPIM. </li><li> Faire tourner la lentille cylindrique de 90 degrés, ce qui transfère la nappe de lumière dans une position verticale pour un réglage axial de la partie rétrécie du faisceau de lumière de la feuille. </li><li> Placer un capillaire contenant un liquide avec un colorant fluorescent dans le porte-échantillon. </li><li> Fixer le support d&#39;échantillon avec le capillaire de la table de microscope de positionnement et d&#39;aligner la position du capillaire de telle sorte qu&#39;elle est centrée et la taille du faisceau de lumière de la feuille est mise au point. </li><li> Ajuster la taille du faisceau par variation de la position axiale de la lentille cylindrique elle-même. Retournez la lentille après l&#39;annonceAJUSTEMENT. </li></ol> 3. cellulaire application de sphéroïde et Microscope RSS synchronisation <ol><li> Placer les sphéroïdes de cellules séparément ou en groupes à l&#39;intérieur borosilicate rectangulaire capillaires en verre 16 avec une section interne de 600 um x 600 um et une épaisseur de paroi de 120 pm. Deux techniques d&#39;application d&#39;un sphéroïde cellulaire ont donné de bons résultats. <ol><li> Prenez le capillaire vide verticale avec le pouce et le majeur et sceller l&#39;ouverture supérieure avec l&#39;index. Apportez l&#39;ouverture inférieure près de la sphéroïde cellulaire dans son liquide environnant (EBSS ou milieu de culture). Relâchez l&#39;index de l&#39;ouverture supérieure. Liquide avec le sphéroïde cellulaire en elle sera immédiatement trempée dans de forces capillaires. Ajuster la position du sphéroïde à l&#39;intérieur du capillaire rempli par gravitation en position verticale respective du capillaire. </li><li> En variante, appliquer le sphéroïde cellulaire à travers le capillaire pipetage. Prenez soin de that l&#39;ouverture de la pointe de la pipette est, d&#39;une part, assez grande pour la taille de l&#39;ellipsoïde et, d&#39;autre part, inférieure ou égale à la taille du diamètre interne du capillaire. </li></ol></li><li> Placer le capillaire avec le sphéroïde à elle dans un porte-échantillon pour la microscopie spécial. </li><li> Fixer le support d&#39;échantillon avec le capillaire de la table de microscope de positionnement et aligner la position de l&#39;ellipsoïde de la cellule de telle sorte qu&#39;elle est centrée et concentrée. </li><li> Régler la correspondance entre la nappe de lumière et le plan focal de l&#39;objectif de microscope dans la voie de détection en réglant la position du miroir de réflexion et la lentille cylindrique (voir la vis de réglage sur la figure 1B). </li><li> Régler la vis micrométrique (voir figure 1B) selon les indices de réfraction et l&#39;ouverture numérique de l&#39;objectif de compenser l&#39;effet aquarium. NOTE: Les différents indices de réfraction de l&#39;échantillon et les milieux environnants til lentille objectif principal d&#39;une différence entre le déplacement de la lentille d&#39;objectif et le décalage du plan focal. Etant donné que la nappe de lumière est déplacée par le revolver porte-objectifs, le décalage entre le passage de la nappe de lumière (correspondant au décalage de l&#39;objectif), et le déplacement du plan focal est compensée par un bras de levier (voir la figure 1B). La vis micrométrique permet d&#39;adapter la distance entre la partie supérieure et la broche inférieure pour régler le déplacement de la nappe de lumière selon l&#39;ouverture numérique de la lentille d&#39;objectif et les indices de réfraction. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: (A) Image de la seule plan du module d&#39;éclairage monté sur la plaque de base de la table d&#39;un microscope inversé de positionnement, (B) l&#39;installation de l&#39;éclairage du plan uniquemodule et la synchronisation de l&#39;alimentation microscope pour compenser la levée ou non-concordance (effet aquarium) entre le plan focal et le plan d&#39;éclairement. Az o indique le décalage de l&#39;objectif et f Az le déplacement du plan focal et la nappe de lumière. L&#39;incrustation montre des sections de sphéroïdes contenant des capillaires. Gauche: capillaire rectangulaire avec un diamètre intérieur de 600 um (paroi 120 um). Droite: Configuration utilisée pour la rotation. Un capillaire intérieure ronde (diamètre intérieur 400 um, diamètre extérieur de 550 um) est tourné dans le capillaire rectangulaire extérieur. L&#39;espace entre les deux capillaires est rempli d&#39;un liquide d&#39;immersion. 4. mesure en dynamique liquide Environnement REMARQUE: Le protocole précédent est utilisé pour l&#39;incubation statique avant une mesure où le sphéroïde cellule a déjà été incubé puis maintenu en place dans le capillaire par simple gravitation. Il n&#39;y a pas besoin d&#39;autres FIXATIsur. Toutefois, pour les mesures dans les médias où une incubation dynamique et, par conséquent, un environnement dynamique est souhaitable de mesurer la cinétique absorption coule, on peut accomplir ce sous-protocole. Les étapes 4.5 à 4.9 sont essentielles pour éviter les bulles d&#39;air atteignant l&#39;échantillon. <ol><li> Remplir le tube capillaire avec FCS pendant 30 min plus tard, à l&#39;appui de l&#39;adhérence cellulaire d&#39;un sphéroïde cellulaire à la surface de verre interne. </li><li> Laissez le revêtement FCS restant dans le capillaire appauvri sécher pendant au moins 12 heures. </li><li> Présentez le sphéroïde cellulaire au capillaire revêtu FCS comme décrit dans l&#39;étape 3.2. </li><li> Laissez le capillaire dans l&#39;incubateur à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 2-4 heures supplémentaires pour provoquer l&#39;adhérence cellulaire de l&#39;ellipsoïde. </li><li> Mettre en place la partie afflux du système microfluidique (voir Figure 2). Utilisation d&#39;une pompe péristaltique à l&#39;afflux de remplir le tube (diamètre interne: 0,89 mm) avec un milieu de culture contenant le colorant fluorescent, un médicament ou un agent. </li><li> Connect la partie afflux du système microfluidique à un piège à bulles (voir Figure 2). </li><li> Tout d&#39;abord serrer le tube capillaire de bulle à la tubulure d&#39;afflux, puis serrer l&#39;autre côté du capillaire à la tubulure de vidange. </li><li> Tune la température du liquide du bain d&#39;eau à la valeur désirée (par exemple, 37 ° C). </li><li> Ajuster la pompe péristaltique à la vitesse désirée de la pompe (par exemple, débit: 9 pl / min; la vitesse de la pompe dans le capillaire: 25 mm / min). </li><li> Recueillir le liquide pompé soit dans un (configuration en boucle ouverte) destinataire, le nourrir à sa source (configuration en boucle fermée) ou alimenter directement dans le tube de la pompe péristaltique (configuration en boucle fermée serré). </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: configuration microfluidique (en boucle ouverte et serrée en boucle fermée); incrustation: Illumination d&#39;une spheroid l&#39;intérieur d&#39;un micro-capillaire en utilisant la microscopie optique en feuille à base de fluorescence couplé à un microscope inversé. Acquisition de données et analyse 5. <ol><li> Régler la puissance du laser et le temps d&#39;intégration pour l&#39;acquisition de l&#39;image. </li><li> Prendre garde que les paramètres définis à l&#39;étape 5.1 ne dépassent pas les valeurs de dose de lumière au sujet de 50 à 100 J / cm 2 pour les cellules natives ou de 10 à 20 J / cm 2 pour les cellules incubées avec un colorant fluorescent ou transfectées avec un plasmide fluorescent codant pour la protéine à éviter phototoxicité (pour plus de détails voir. Réf 12). </li><li> Régler l&#39;incrément pour la pile à z Az = 5-10 um ce qui est préférable pour les trois dimensions de l&#39;analyse des données en tant que l&#39;épaisseur de la nappe de lumière est d&#39;environ 10 um. </li><li> Effectuer des mesures d&#39;images simples ou z-piles par une variation du plan focal dans le sphéroïde cellulaire. </li></ol>

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	<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).</li><li>Webb, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+optical+microscopy.">Confocal optical microscopy.</a> Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).</li><li>Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+obtaining+optical+sectioning+by+using+structured+light+in+a+conventional+microscope.">Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope.</a> Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+SPIM.">Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high+throughput+screening:+the+multi-cellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+fluorescence+microscopy+of+living+cells.">Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells.</a> J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue.">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).</li><li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection.">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).</li><li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams.">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li><li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy.">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).</li><li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li><li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation.">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li><li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le présent manuscrit décrit une nappe de lumière ou simple microscopie plan d&#39;éclairage (SPIM) dispositif qui est optimisé pour les systèmes cellulaires en 3 dimensions, par exemple sphéroïdes multicellulaires tumorales (SCTM). Trois exemples d&#39;applications sont (1) l&#39;absorption d&#39;un médicament cytostatique et sa conversion partielle à un produit de dégradation (dont la contribution à l&#39;efficacité chimiothérapeutique reste encore à évaluer), (2) les mesures de l&#39;...

En plus des méthodes bien établies (confocale ou multi-photons microscopie à balayage laser 1-4, structuré éclairage microscopie 5,6) feuilles microscopie optique ou d&#39;éclairage de plan unique (SPIM) s&#39;est avérée être une méthode valable de l&#39;imagerie 3D 7,8, 9. Il est particulièrement intéressant de son application à des cultures de cellules en 3 dimensions, par exemple, sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM), qui sont utilisés de plus en plus à la recherche de découverte de médicaments 10,11. En outre, SPIM est une méthode préférentielle quand même lors de l&#39;exposition à long terme ou des mesures répétitives doses de faible éclairage sont nécessaires pour maintenir la viabilité de l&#39;échantillon, car pour la mesure de chaque plan de l&#39;échantillon que ce plan est exposé à la lumière. Ceci est en contraste avec d&#39;autres techniques de microscopie, où pour la détection de chaque plan focal de la totalité de l&#39;échantillon est illuminé, de sorte que lors de l&#39;enregistrement de plusieurs plans les sommes de la dose de lumière et peut endommager l&#39;échantillon 12. </p&gt; Microscopie à lumière ou SPIM feuille est basée sur un éclairage de l&#39;échantillon en direction perpendiculaire au trajet d&#39;observation, soit par l&#39;utilisation d&#39;une lentille cylindrique ou par balayage du faisceau laser d&#39;excitation (pour une revue, voir Ref. 8). Cela exige souvent des chambres d&#39;échantillons spéciaux 13,14 ou des matrices, par exemple, de l&#39;agarose 7,15, mis en œuvre dans des microscopes spéciaux à coût élevé. Comme alternative à ces systèmes un dispositif d&#39;éclairage simple, comparable à SPIM a été développée et adaptée à un microscope inversé conventionnel 16 (voir figure 1). Il se compose d&#39;un faisceau laser dilaté à un diamètre de 8 mm et focalisé par une lentille cylindrique (distance focale: 50 mm, ouverture numérique: 0,08) à une nappe de lumière de 6 à 10 um d&#39;épaisseur sur une profondeur de champ d&#39;environ 100 um . Les échantillons sont placés dans un tube capillaire rectangulaire de 600 à 900 um de diamètre interne placé à l&#39;avant de l&#39;objectif len microscopes pour la détection de fluorescence. Ces caractéristiques principales sont actuellement remplis et optimisés par l&#39;utilisation de méthodes de micro-capillaires de pointe pour maintenir et pour faire tourner les échantillons, le réglage synchrone de la feuille de lumière d&#39;éclairage (en direction axiale) et la lentille d&#39;objectif utilisé pour la détection de fluorescence (de chemin optique identique des longueurs de déplacement nécessitent une correction de la charge mécanique), et l&#39;adaptation d&#39;un système microfluidique pour l&#39;application de colorants fluorescents, des agents pharmaceutiques ou des médicaments, réduisant ainsi les quantités et les charges requises.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Un module de nappe de lumière ou un seul plan illumination microscopie (SPIM) est décrit qui est facilement adapté à un microscope à grand champ inversé et optimisée pour des cultures de cellules en 3 dimensions, par exemple, sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM). Les formes de modules SPIM d&#39;excitation et dévie la lumière de telle sorte que l&#39;échantillon est illuminé par une nappe de lumière perpendiculaire à la voie de détection du microscope. Le système est caractérisé par l&#39;utilisation d&#39;un capillaire rectangulaire pour contenir (et dans une version améliorée aussi par une méthode de micro-capillaire pour faire tourner) des échantillons, par le réglage synchrone de la feuille de lumière d&#39;éclairage et la lentille d&#39;objectif utilisé pour la détection de la fluorescence ainsi que par l&#39;adaptation d&#39;un système microfluidique pour l&#39;application de colorants fluorescents, des agents pharmaceutiques ou des médicaments dans de petites quantités. Un protocole pour travailler avec ce système est donnée, et certains détails techniques sont signalés. Les résultats représentatifs comprennent (1) la mesure de la placeprendre un médicament cytostatique (doxorubicine) et sa conversion partielle en un produit de dégradation, (2) des mesures rédox par l&#39;utilisation d&#39;un capteur de glutathion génétiquement codé lors de l&#39;addition d&#39;un agent oxydant, et (3) l&#39;initiation et l&#39;étiquetage de nécrose cellulaire sur l&#39;inhibition de l&#39; la chaîne respiratoire mitochondriale. Les différences et les avantages du module de SPIM présente en comparaison avec les systèmes existants sont discutés.

Expérience 1: cellules sphéroïdes incubées avec un médicament chimiothérapeutique Un balayage z-stack d&#39;un MCF-7 sphéroïde cellule préalablement incubées (8 uM de doxorubicine, 6 h) est représenté dans la figure 3. Elle donne des informations détaillées sur l&#39;absorption cellulaire et la distribution de la doxorubicine 17 et son produit de dégradation 18,19. Dans la couche externe de la cellule de la doxorubicine f...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Un module de plan unique éclairage microscopie (SPIM) est décrit qui est facilement adapté à un microscope à grand champ inversé et optimisée pour des cultures de cellules en 3 dimensions. L&#39;échantillon se trouve à l&#39;intérieur d&#39;un capillaire rectangulaire, et par l&#39;intermédiaire d&#39;un micro-fluidiques colorants fluorescents de système, des agents pharmaceutiques ou des médicaments peut être appliquée dans de petites quantités.

Simple Plan Illumination module et l&#39;approche micro-capillaire pour un microscope à grand champ

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Research

JoVE Journal

Engineering

9.6K vues.  Aalen University.  Un module de plan unique éclairage microscopie (SPIM) est décrit qui est facilement adapté à un microscope à grand champ inversé et optimisée pour des cultures de cellules en 3 dimensions. L'échantillon se trouve à l'intérieur d'un capillaire rectangulaire, et par l'intermédiaire d'un micro-fluidiques colorants fluorescents de système, des agents pharmaceutiques ou des médicaments peut être appliquée dans de petites quantités. 

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Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular organelles 2,3, as well as for high spatial and temporal resolution readout of their position relative to the center of the trap. The system described herein has one such "traditional" trap operating at 980 nm. It additionally provides a second optical trapping system that uses a commercially available holographic package to simultaneously create and manipulate complex trapping patterns in the field of view of the microscope 4,5 at a wavelength of 1,064 nm. The combination of the two systems allows for the manipulation of multiple refractive objects at the same time while simultaneously conducting high speed and high resolution measurements of motion and force production at nanometer and piconewton scale.

The system described herein employs a traditional optical trap as well as an independent holographic optical trapping line, capable of creating and manipulating multiple traps. This allows for the creation of complex geometric arrangements of refractive particles while also permitting simultaneous high-speed, high-resolution measurements of the activity of biological enzymes.

Construction d&#39;un microscope à haute résolution avec des capacités de piégeage optique classique et holographique

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

Recherche

Ingénierie

Analysis of Contact Interfaces for Single GaN Nanowire Devices

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit a strong degradation after annealing due to the occurrence of void formation at the contact/SiO2 interface. This void formation can cause cracking and delamination of the metal film, which can increase the resistance or lead to a complete failure of the NW device. In order to address issues associated with void formation, a technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from the substrates to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN NW devices. This procedure determines the degree of adhesion of the contact films to the substrate and NWs and allows for the characterization of the morphology and composition of the contact interface with the substrate and nanowires. This technique is also useful for assessing the amount of residual contamination that remains from the NW suspension and from photolithographic processes on the NW-SiO2 surface prior to metal deposition. The detailed steps of this procedure are presented for the removal of annealed Ni/Au contacts to Mg-doped GaN NWs on a SiO2 substrate.

A technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from their substrate to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN nanowire devices.

Analyse des Interfaces de contact pour GaN appareils nanofils

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit  a strong degradation after annealing due to the  occurrence of void formation at the ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is presented. The SANS shear cell consists of a concentric cylinder Couette geometry that is sealed and rotating about a horizontal axis so that the vorticity direction of the flow field is aligned with the neutron beam enabling scattering from the 1-2 plane of shear (velocity-velocity gradient, respectively). This approach is an advance over previous shear cell sample environments as there is a strong coupling between the bulk rheology and microstructural features in the 1-2 plane of shear. Flow-instabilities, such as shear banding, can also be studied by spatially resolved measurements. This is accomplished in this sample environment by using a narrow aperture for the neutron beam and scanning along the velocity gradient direction. Time resolved experiments, such as flow start-ups and large amplitude oscillatory shear flow are also possible by synchronization of the shear motion and time-resolved detection of scattered neutrons. Representative results using the methods outlined here demonstrate the useful nature of spatial resolution for measuring the microstructure of a wormlike micelle solution that exhibits shear banding, a phenomenon that can only be investigated by resolving the structure along the velocity gradient direction. Finally, potential improvements to the current design are discussed along with suggestions for supplementary experiments as motivation for future experiments on a broad range of complex fluids in a variety of shear motions.

A shear cell is developed for small-angle neutron scattering measurements in the velocity-velocity gradient plane of shear and is used to characterize complex fluids. Spatially resolved measurements in the velocity gradient direction are possible for studying shear-banding materials. Applications include investigations of colloidal dispersions, polymer solutions, and self-assembled structures.

Mesure microstructure du matériau sous flux utilisant 1-2 Avion Flow-Petit Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle&#039;s Mapping and Quantification in Organ Tissue

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

Induite par laser Répartition Spectroscopy: Une nouvelle approche pour la cartographie et la quantification de nanoparticules dans les tissus d&#39;organes

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

En rupture diélectrique Situ en fonction du temps dans le microscope électronique à transmission: une possibilité de comprendre le mécanisme de panne des dispositifs microélectroniques

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Compact numérique Holographic Microscope pour les MEMS Inspection et caractérisation de Lens-moins

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building blocks in a bottom-up approach is still open. The scanning probe microscope (SPM) could be a tool of choice; however, SPM-based manipulation was until recently limited to two dimensions (2D). Binding the SPM tip to a molecule at a well-defined position opens an opportunity of controlled manipulation in 3D space. Unfortunately, 3D manipulation is largely incompatible with the typical 2D-paradigm of viewing and generating SPM data on a computer. For intuitive and efficient manipulation we therefore couple a low-temperature non-contact atomic force/scanning tunneling microscope (LT NC-AFM/STM) to a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles. This setup permits &#34;hand controlled manipulation&#34; (HCM), in which the SPM tip is moved according to the motion of the experimenter&#39;s hand, while the tip trajectories as well as the response of the SPM junction are visualized in 3D. HCM paves the way to the development of complex manipulation protocols, potentially leading to a better fundamental understanding of nanoscale interactions acting between molecules on surfaces. Here we describe the setup and the steps needed to achieve successful hand-controlled molecular manipulation within the virtual reality environment.

We demonstrate the precise manipulation of individual organic molecules on a metal surface with the tip of a scanning probe microscope driven in 3D by the experimenter's hand using a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles.

Manipulation de l&#39;unité Molécules contrôlée main via un microscope à balayage de la sonde avec une interface de réalité virtuelle 3D

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Démonstration d’un Microscope intégré Hyperlens et Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new techniques capable of characterizing their dynamics. Investigating single dopants requires sub-nanometer spatial resolution, which motivates the use of scanning tunneling microscopy (STM). However, conventional STM is limited to millisecond temporal resolution. Several methods have been developed to overcome this shortcoming, including all-electronic time-resolved STM, which is used in this study to examine dopant dynamics in silicon with nanosecond resolution. The methods presented here are widely accessible and allow for local measurement of a wide variety of dynamics at the atomic scale. A novel time-resolved scanning tunneling spectroscopy technique is presented and used to efficiently search for dynamics.

We demonstrate an all-electronic method to observe nanosecond-resolved charge dynamics of dopant atoms in silicon with a scanning tunneling microscope.

Entièrement électronique résolue en nanosecondes Tunneling microscope à balayage : Faciliter l’Investigation de la dynamique de Charge unique de Dopant

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

Lithographie de faisceau d’électrons à un seul chiffre nanomètre avec une correction de l’Aberration Transmission Microscope électronique à balayage

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...