This work was supported by a Pilot and Feasibility Grants from the Indiana University School of Medicine Center (IUSM) for Excellence in Molecular Hematology (NIDDK, 5P30DK090948). Additional funding was provided by a Biomedical Enhancement Grant from IUSM. We would like to thank Dr. Karen Cowden Dahl for commenting on the manuscript.

1. embryoïdes corps (EB) Formation <ol><li> Gélatine adapter CES qui ont été maintenues sur des fibroblastes d&#39;embryon de souris (MEF). CES Passage 3 fois sur 6 et la plaque de culture de tissus enduits de gélatine à 0,1% pour enlever MEF. <ol><li> Cultiver les cellules dans les médias d&#39;entretien ESC avec FRV pour maintenir les cellules indifférenciées (tableau 1). Assurez-vous que les cellules ne dépassent jamais 80% de confluence. Utilisez passage bas (10 ou moins après la suppression de passages MEF) cellules de différenciation. </li></ol></li><li> A la veille de CES sont cultivées pour la différenciation EB, passage des cellules de sorte qu&#39;ils seront environ 50-70% de confluence le lendemain. Continuer à cultiver des cellules dans le milieu de la maintenance ESC pour conserver la pluripotence cellulaire. </li><li> Le jour de la différenciation, les médias de maintenance ESC aspiration et laver avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, et 11,9 mM de tampon phosphate, pH 7,4) dans chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. <ol><li> Ajouter 200 ul de 0,25% trypsen / EDTA à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Inactiver la trypsine / EDTA avec 800 pi de milieu de différenciation. Pipette de haut en bas dans une pipette sérologique de 2 ml avec une pointe de p200 de débâcle des cellules dans une suspension de cellules isolées. Assurez-vous que la pointe de p200 s&#39;adapte parfaitement sur la fin si les médias ne vont pas entre la pipette et l&#39;interface de pointe. </li><li> Pipet haut et bas environ 5-10 fois. Prenez soin de ne pas créer des bulles au cours de la pipette. </li></ol></li><li> les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Amener le volume à 10 ml avec du PBS. Centrifuger à 315 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer le surnageant. Laver deux fois avec 5 ml de PBS pour éliminer les restes de fluides contenant des FRV. Centrifugeuse à l&#39;étape 1.4 pour chaque lavage. <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire finale dans 2 ml de milieu de différenciation (tableau 2). </li></ol></li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre ou cellulaire contre la plaque et 6,000-10,000 cellules / ml dans une plaque de 10 cm de Pétri(Culture non-tissu traité). <ol><li> Déterminer exactement les cellules / ml empiriquement pour chaque ligne ESC. Utilisez des boîtes de Pétri stériles normalement utilisés pour le travail des bactéries ou des plaques de faible adhérence. REMARQUE: Pour de meilleurs résultats de différenciation, les ballasts électroniques doivent former des sphères qui restent en suspension sans fixer à la plaque. Testez plusieurs marques de plaques de trouver ceux qui ont le moins l&#39;adhésion. </li><li> Incuber les CES de différenciation dans une culture tissulaire C incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Stock </td><td> Concentration finale </td><td> Volume </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> IGMA / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES blindé) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Acides aminés non essentiels </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / streptomycine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 pi </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> Inhibition de la leucémie Factor (LIF) </td><td> 10 7 unités / ml </td><td> 1000 unités / ml </td><td> 50 pi </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>ontenu &quot;&gt; Tableau 1: ESC Maintenance médias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Stock </td><td> Concentration finale </td><td> Volume </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (Projeté utilisateur de différenciation optimale) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Acides aminés non essentiels </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Vie Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / streptomycine </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 pi </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Différenciation des médias. 2. préparation de cellules EB pour infection par le virus <ol><li> Au stade de développement souhaité (entre les jours 2 et 3), transférer les ballasts électroniques de la boîte de 10 cm de Pétri à 15 ml tube conique. Laver la plaque avec 5 ml de PBS et ajouter le lavage au tube conique. </li><li> Pellet les EB à 315 g à la température ambiante pendant 5 min. Laver les cellules EB avec 5 ml de PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de détachement cellulaire décongelée (protéolytique contenant des enzymes et collagénolytiques) et placer les tubes dans un bain d&#39;eau à 37 ° (ou incubateur) pendant 30 min avec occagitation asional (agitation ou de lumière vortex). </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de différenciation. Pipette de haut en bas avec une pipette de 2 ml avec une pointe p200 de la pipette. Placer le tube à 37 ° C bain d&#39;eau à nouveau pendant 30 à 60 min. </li><li> Centrifuger les cellules à 315 xg pendant 5 min et laver les cellules avec du PBS. </li></ol> 3. infection par le virus <ol><li> Remettre en suspension les cellules dans 1,5 ml de milieu de différenciation. Transférer la suspension cellulaire à un tissu non traité culture plaque à 6 puits. </li><li> Préparer le retrovirus par des techniques classiques à l&#39;avance. Ajouter 5 à 100 ul de surnageant viral dans des cellules en fonction de titre viral. Ne pas ajouter polybrene pour améliorer infection comme cela inhibe la réforme ultérieure de EB. </li><li> Spinoculate les cellules avec le virus par centrifugation à 2120 xg pendant 90 min à température ambiante. </li></ol> 4. différenciation des cellules virales EB infectés dans les baisses suspendus <ol><li> Ajouter 2 ml de milieu de différenciation à chaque puits d&#39;infected EB de suspension de cellules. </li><li> Pipeter 3,5 ml de suspension cellulaire infectée EB dans un réservoir de réactif pour multipipettors stérile. Utilisez le multipipettor à pipeter 15-20 rangées de huit 20 pi gouttes sur le couvercle inversé de la plaque 15 cm de Pétri. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS stérile ou de l&#39;eau à la partie inférieure de la plaque de Petri. Puis inverser le couvercle avec les gouttes et le lieu sur la plaque de Petri. Assurez-vous que les gouttes sont suspendus la tête en bas couvercle avec du PBS ou de l&#39;eau ci-dessous pour garder la chambre humidifiée. </li><li> Placez les plats à la 37 ° C tissu incubateur de culture avec 5,0% de CO 2. </li><li> Après 2 jours, recueillir EB formés dans le rideau de gouttes d&#39;inversion couvercle et lavage avec 4,5 ml de milieu de différenciation. <ol><li> médias de transfert et EBS pour une nouvelle culture de 10 cm non-tissu boîte de Pétri. Laver le couvercle une fois de plus avec 3 ml de milieu de différenciation et le transfert de la plaque de 10 cm. </li></ol></li><li> cellules de récolte pour l&#39;analyse par cytométrie en flux après un total de 8culture jours à compter de la cession initiale de cellules sur un support de différenciation (-LIF). </li></ol> 5. cellules Préparation pour l&#39;analyse cytomètre en flux <ol><li> Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml avec une pipette de 10 ml. Laver la plaque avec 5 ml de PBS et transférer dans le même tube conique. </li><li> cellules de granules à 315 x g. Laver pastilles avec 10 ml de PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de solution décongelée de détachement cellulaire et placer les tubes dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 30 minutes avec agitation occasionnelle. Pour la détection de certains antigènes de surface des cellules, la trypsine peut être utilisé à la place. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu de différenciation et pipette de haut en bas avec une pipette de 2 ml. Utilisez une pointe de p200 à la fin de la pipette pour aider à briser-up digéré EB en suspension de cellules isolées. <ol><li> Placer le tube dans un bain d&#39;eau à 37 C ° pendant encore 60 min pour que les protéines membranaires intégrales à recycler à la surface de la cellule. </li></ol></li><li> Pellet cellules à 315 g pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules wie 0,1% de sérum albumine bovine fraction V (BSA) préparé dans du PBS (PBS / BSA) et incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence spécifique. </li></ol> 6 Analyse des flux cytométrie de progéniteurs hématopoïétiques <ol><li> Placer 10 6 cellules EB dérivés dans 5 ml de 12 x 75 mm tube rond en bas. Pour régler cytomètre en flux réglages de compensation, utiliser des billes de rémunération selon les instructions du fabricant. </li><li> cellules de granules à 315 x g. Verser le surnageant et remettre le culot en solution résiduelle PBS / BSA dans le tube. </li><li> Pour la détection de l&#39;ESC CAH, incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence: anti-souris CD41-PE (R-phycoérythrine) et anti-CD117 de souris (cKit) -APC / CY7 (Allophycocyanine Cyanine 7). <ol><li> Diluer anticorps 1: 100 dans du PBS / BSA. Ajouter 100 ul d&#39;anticorps dilué dans chaque échantillon. Déterminer la dilution correcte des anticorps pour chaque fournisseur, clone, et beaucoup ou anticorps. Déterminer la dilution optimale pour le marquage de cellules individuellement. </li&gt; </ol></li><li> Incuber des échantillons sur la glace dans l&#39;obscurité pendant 30 min. </li><li> Ajouter 2 ml de cellules PBS / BSA et granulés à 315 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 300 pi de PBS ou un autre tampon isotonique. </li><li> Filtrer les remises en suspension des cellules à travers un bouchon de crépine de cellule (0,35 M) pour enlever les grands agrégats de cellules. </li><li> Analyser les cellules sur un cytomètre de flux. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.

Comme discuté ci-dessus, les clones qui expriment de manière inductible ESC un gène d&#39;intérêt peuvent être générés en utilisant des systèmes de doxycycline, toutefois, la production de ces lignes est de temps et de main-d&#39;oeuvre. Décrite dans ce protocole est une méthode pour exprimer un gène d&#39;intérêt dans la suspension cellulaire unique préparé à partir ESC dérivé EB. Ces cellules infectées sont ensuite réformé en EB en goutte suspendue pour examiner la différenciation ultérieure. ...

Murine embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent, remaining undifferentiated and self-renewing in the presence of the cytokine Leukemia Inhibitory Factor (LIF)1. Upon withdrawal of LIF they will spontaneously differentiate into 3-dimensional (3D) structures called embryoid bodies (EBs)2. The 3D architecture allows for the development of the three germ layers ectoderm, endoderm, and mesoderm, which then later give rise to mature tissue types3. ESCs are an exceptional model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation, particularly the investigation of the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs)4. 
Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow for the determination of a role for individual molecules in development. One of the most common techniques is to use homologous recombination to generate ESC lines, which lack a gene of interest5,6. There are also a number of techniques that have been used to overexpress genes. The first technique used to modify gene expression in ESCs was to infect them with recombinant retroviruses7,8. The gene of interest however is often silenced as the ESCs differentiate into progenitor and mature cell types. Use of lentiviruses has been successful in limiting the silencing of virally expressed genes9. Other viral vectors used for overexpression include adenovirus and adeno-associated virus10. In addition standard transfection techniques to stably introduce expression plasmids are widely used for ESC transgene expression11. One difficulty with these systems is that often expression of a specific gene has different effects depending on its temporal expression. For example, the Smad1 protein affects the development of hematopoietic cells differently during different stages of EB development12,13. 
This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest. The most common system for inducibly expressing transgenes in ESCs uses the tetracycline resistance operon from E. Coli (Escherichia coli). Several different tetracycline systems have been developed. One of the more popular strategies was developed by Kyba and colleagues14. They generated an ESC line (Ainv15), which has the reverse tetracycline transactivator gene inserted into the constitutively active ROSA26 locus. A tetracycline response element (TRE), a downstream LoxP site (locus of X-over P1 from bacteriophage P1), and a promoterless neomycin cassette were introduced into the HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) locus on the X chromosome. Using a CRE recombination approach a gene of interest along with a eukaryotic promoter to drive the expression of the neomycin resistance gene can be inserted into the LoxP site. Correctly targeted ESCs are isolated by G418 selection. These targeted clones then must be tested for doxycycline (or tetracycline) inducible expression of the transgene. This approach has successfully generated ESC lines that inducibly express HoxB4, Stat5, SCL, and Smad714-17. However, generation of these inducible cell lines is time consuming. Described here is a method to disaggregate ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infect the cell suspensions at different days of development, and then reform the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is later evaluated by flow cytometry. In this article an example of how miRNA expression in EB-derived cells effects hematopoietic differentiation is shown. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="470">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:193px;">Reagent</td>
			<td style="width:144px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">DMEM</td>
			<td style="width:144px;">Sigma/ Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">D5796</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma/ Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">M3148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">FBS (ES Screened)</td>
			<td style="width:144px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">FBS (Defined)</td>
			<td style="width:144px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30070.03</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">11140</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Penn/Strep</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">LIF ESGRO</td>
			<td style="width:144px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">ESG1107</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">ACCUMAX</td>
			<td style="width:144px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">SCR006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Tissue Culture Plates 6-well</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-772-1B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Non-treated Plates 6-well</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-772-49</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Petri dish 10cm</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-757-100D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Petri dish 15cm</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-757-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Tube 5mls</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-959-11A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Tube 5mls with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-771-23</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">White sterile resevoirs</td>
			<td style="width:144px;">U.S.A. Scientific</td>
			<td style="width:133px;">111-0700</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated</td>
			<td style="width:144px;">Biolegend</td>
			<td style="width:133px;">133906</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated</td>
			<td style="width:144px;">Biolegend</td>
			<td style="width:133px;">105826</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">RW4 ESCs</td>
			<td style="width:144px;">ATCC</td>
			<td>CRL-12418</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral infection of murine embryonic stem cell derived embryoid body cells for analysis of hematopoietic differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Dans ces études gélatinisées VR4 (dérivée de la souche de souris 129X1 / SvJ) CES ont été utilisés. EB ont été isolés à 3 jours de différenciation. Pour obtenir les meilleurs résultats EBS doivent être sphériques et non-adhérente (Figure 1A, B). Après spinoculation avec le virus co-exprimant la GFP marqueur fluorescent avec un gène d&#39;intérêt, EB ont été reformé par la méthode de la goutte pendante. EB ont été réformés avec succès à partir de suspensions cellulaires pr?...

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Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

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Research

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Biology

8.4K vues.  Harper Cancer Research Institute. Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation. 