Nous avons développé une méthode efficace et économique pour établir des souris avec la manipulation des gènes spécifiquement dans les cellules souches hématopoïétiques, en utilisant la technologie d’édition du génome et les systèmes de livraison transgéniques à base de lentivirus. L’avantage de ce protocole est que nous pouvons créer des modèles animaux hébergeant des mutations spécifiques dans les cellules hématopoïétiques d’une manière rapide et rentable par rapport aux approches transgéniques conventionnelles de souris. Ying Wang, chercheur de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour générer des particules de lentivirus, commencez par coder une plaque de six puits avec une solution de collagène et l’incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, les graines 293T cellules sur la plaque et l’incuber pendant encore deux heures. Pendant ce temps, préparer le mélange de trois plasmides transfection en combinant 0,9 microgramme de vecteur de lentivirus, 0,6 microgrammes de psPAX2 et 0,3 microgrammes de pMD2.
G et déionisé à 10 microlitres par puits. Ajouter ensuite 50 microlitres de 1X PBS et cinq microlitres de PEI MAX dilué au mélange de plasmides, et incuber le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajouter un millilitre de DMEM.
Aspirer le média à partir de la plaque de six puits et ajouter un millilitre de mélange de plasmides à chaque puits. Incuber la plaque pendant encore trois heures. Remplacez les supports par du DMEM frais et incubez pendant 24 heures.
Ajouter un millilitre de DMEM frais et incuber 24 heures de plus. Après une incubation totale de 48 heures, transférer le supernatant dans un tube de 50 millilitres et le centrifuger à 3000 fois G pendant 15 minutes pour enlever les cellules flottantes. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre et l’ultra-centrifugeuse pendant trois heures.
Aspirez soigneusement le surnatant, en laissant derrière lui la pastille blanche. Suspendre à nouveau la pastille avec 100 microlitres de milieu d’expansion hématopoïétique sans sérum sans aération. Gardez un aliquot de 10 microlitres pour mesurer le litre viral et conserver le reste de la suspension à moins 80 Degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
Après avoir isolé les os, placez-les dans un tube conique de 50 millilitres avec RPMI et placez le tube sur la glace. Dans une armoire de biosécurité, transférer les os dans un plat stérile de culture de 100 millimètres. Saisissez ensuite un os avec des forceps contondants, et utilisez des ciseaux de dissection pour couper soigneusement les deux épiphyses.
Remplissez une seringue de 10 millilitres d’IRM glacée et utilisez une aiguille de calibre 22 pour rincer la moelle osseuse de l’arbre dans un nouveau plat de culture de 100 millimètres. Après que toute la moelle osseuse a été recueillie, faire une suspension à cellule unique en passant la moelle osseuse à travers une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.
Puis centrifuger le tube selon les instructions manuscrites et aspirer le surnatant. Suspendez à nouveau les granulés cellulaires dans un volume approprié de tampon de séparation optimisé. Pour isoler les cellules négatives de lignée, utilisez un kit d’épuisement cellulaire de lignée selon les instructions du fabricant.
Suspendre à nouveau les cellules négatives de lignée isolées dans le milieu d’expansion hématopoïétique sans sérum. Pré-incubation des cellules à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant deux heures. Ajoutez ensuite le lentivirus selon les instructions manuscrites et laissez les cellules dans l’incubateur pendant encore 16 à 20 heures.
Le lendemain, recueillir les cellules induites par le lentivirus dans un tube conique de 15 millilitres et les centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes. Selon les lignes directrices de la NHA, il est important de manipuler les vecteurs de lentivirus au niveau deux du Groupe Reece. Des précautions doivent être prises, en fonction de la réglementation des installations.
Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en 200 microlitres de RPMI par souris. Gardez les cellules à température ambiante jusqu’à la transplantation chez la souris. Après la deuxième session d’irradiation, injectez rétro-orbitalement des cellules négatives transdéliorées dans chaque souris anesthésiée à l’aide d’une seringue à insuline.
Trois à quatre semaines après la transplantation de moelle osseuse, obtenir des échantillons de sang de la veine rétro-orbitale à l’aide de tubes capillaires. Transférer 20 microlitres de sang dans des tubes à essai en polystyrène à fond rond et les placer sur de la glace. Après la lyse RBC, incuber les cellules avec un cocktail d’anticorps monoclonaux dans l’obscurité pendant 20 minutes à température ambiante.
Après incubation, laver, fixer et centrifuger les cellules et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 400 microlitres de tampon FACS. Gardez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à l’analyse par cytométrie d’écoulement. Le succès de la transduction négative de cellules de lignée peut être évalué avec la détection cytométrique de flux de DP.
Il a été démontré qu’après sept jours de culture in vitro, en moyenne, 75,7% des cellules sont transduites. La cytométrie de flux a également été employée pour analyser le sang périphérique de souris après reconstitution avec les cellules souches hématopoïétiques transduced et non transduced. En moyenne, 94,8 % des neutrophiles, 93,5 % des monocytes et 82,7 % des cellules B expriment la DP.
L’ADN génomique des cellules sanguines positives à la DP a été amplifié et sous-cloné pour l’analyse des séquences. Diverses mutations sont détectées et 69% des clones montrent des mutations d’arrêt de cadre ou prématurées. Pour réussir avec cette procédure, la préparation du stock antivirus élevé et des conditions optimisées pour la transduction et la transplantation des cellules hématopoïétiques sont exigées.
Nous avons appliqué cette technique pour étudier la loi de la maladie cardio-vasculaire. Mais il est également utile d’étudier la malignité hématologique. Cette méthode nous permet d’étudier les fonctions de nouveaux types de gènes dans le système hématopoïétique de manière très efficace et élevée.
Nous recueillons ceci au-dessus de la disponibilité des souris transgéniques.
