This work was supported by a Pilot and Feasibility Grants from the Indiana University School of Medicine Center (IUSM) for Excellence in Molecular Hematology (NIDDK, 5P30DK090948). Additional funding was provided by a Biomedical Enhancement Grant from IUSM. We would like to thank Dr. Karen Cowden Dahl for commenting on the manuscript.

1. Embryoidkörper (EB) Bildung <ol><li> Gelatine-Anpassung WSR, die auf Mausembryo-Fibroblasten (MEF) gehalten wurden. Passage WSR 3 mal am 6. Gewebekulturplatte mit 0,1% Gelatine beschichtet, um MEFs entfernen. <ol><li> Wachsen Zellen im ESC Wartung Medien mit LIF, um die Zellen undifferenziert (Tabelle 1) zu halten. Stellen Sie sicher, Zellen 80% Konfluenz nie überschreiten. Verwenden Sie niedrige Durchgang (10 oder weniger Stellen nach dem Entfernen von MEF-Zellen) für die Differenzierung. </li></ol></li><li> Am Tag vor WSR sind für EB Differenzierung kultiviert, Durchgang die Zellen, so dass sie etwa 50-70% konfluent am nächsten Tag. Weiter Kultivieren von Zellen in Erhaltungsmedium ESC zu Zelle Pluripotenz behalten. </li><li> Am Tag der Differenzierung, absaugen ESC Erhaltungsmedium und Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. <ol><li> Geben Sie 200 ul von 0,25% trypsin / EDTA zu jeder Vertiefung und bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Inaktivierung des Trypsin / EDTA mit 800 ul der Differenzierung Medien. Pipette auf und ab in einem 2 ml-Pipette mit einer serologischen p200 Spitze gegen Aufbruch der Zellen in einer Einzelzellsuspension. Sicherzustellen, dass die p200 Spitze passt genau auf das Ende so Medien geht nicht zwischen der Pipettenspitze und Schnittstelle. </li><li> Pipette auf und ab ca. 5-10 mal. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren erstellen. </li></ol></li><li> Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Um das Volumen auf 10 ml mit PBS. Zentrifuge bei 315 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand entfernen. Zweimal waschen mit 5 ml PBS Reste enthält, LIF entfernen. Zentrifuge nach Schritt 1.4 für jede Waschung. <ol><li> Resuspendieren endgültige Zellpellet in 2 ml Differenzierungsmedium (Tabelle 2). </li></ol></li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzähler und Platte 6.000-10.000 Zellen / ml in einer 10 cm Petrischale(Nicht-Gewebekultur-behandelten). <ol><li> Bestimmen Sie die genaue Zellen / ml empirisch für jede Zeile ESC. Sterile Petrischalen in der Regel für die bakterielle Arbeit oder geringe Haftung Platten verwendet. HINWEIS: Die besten Ergebnisse Differenzierung, sollte das EBS Kugeln, die in Suspension bleiben, ohne Befestigung an der Platte zu bilden. Testen Sie mehrere Marken von Platten, um diejenigen mit der geringsten Einhaltung zu finden. </li><li> Die Differen WSR inkubieren bei 37 ° C Brutschrank mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lager </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> igma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES abgeschirmt) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Streptomycin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 ul </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> Leukemia Inhibitory Factor (LIF) </td><td> 10 7 Einheiten / ml </td><td> 1.000 Einheiten / ml </td><td> 50 ul </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>NHALT &quot;&gt; Tabelle 1: ESC Wartung Medien. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lager </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (User Abgeschirmte für optimale Differenzierung) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Leben TechnoloGies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Streptomycin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 uM </td><td> 4 ul </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Differenzierung Medien. 2. Vorbereitung EB Zellen für Virus-Infektion <ol><li> Bei der gewünschten Ausbaustufe (zwischen Tag 2 und Tag 3), übertragen Sie die EVG aus der Petrischale 10 cm bis 15 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und fügen Sie den zu waschen, um die konische Röhre. </li><li> Pellet die EVG bei 315 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 5 ml PBS waschen Sie die EB-Zellen. </li><li> 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung (mit proteolytischen Enzymen und kollagenolytischen) und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C warmen Wasserbad (oder Inkubator) für 30 min mit occasional Agitation (von schnippen oder Licht Vortex). </li><li> 1 ml Differenzierungsmedium. Pipette auf und ab mit einer 2-ml-Pipette mit einem p200 Pipettenspitze. Das Röhrchen wird in 37 ° C warmen Wasserbad wieder für 30-60 min. </li><li> Spin-Down der Zellen bei 315 xg für 5 min und waschen Sie die Zellen mit PBS. </li></ol> 3. Virus-Infektion <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 1,5 ml Differenzierungsmedium. Übertragen der Zellsuspension auf eine 6-Well-Gewebekultur nicht behandelten Platte. </li><li> Bereiten Sie das Retrovirus durch Standardverfahren vor der Zeit. Hinzufügen von 5 bis 100 ul Virusüberstand, um Zellen abhängig von viralen Titer. Sie Polybren nicht hinzufügen, um eine Infektion zu erhöhen, da dies hemmt die spätere Reformation der EVG. </li><li> Spinoculate der Zellen mit Virus durch Zentrifugieren bei 2.120 × g für 90 min bei Raumtemperatur. </li></ol> 4. Differenzierung Viral Infizierte EB Zellen in hängenden Tropfen <ol><li> 2 ml Differenzierungsmedium in jede Vertiefung infected EB Zellsuspension. </li><li> Pipette 3,5 ml EB infizierten Zellsuspension in ein steriles Reagenz Reservoir für multipipettors. Verwenden Sie die multipipettor 15-20 Reihen von acht 20 ul Tropfen auf dem umgekehrten Deckel des 15 cm Petrischale pipettieren. </li><li> 10 ml steriler PBS oder Wasser auf die untere Hälfte der Petrischale. Dann kehren die Deckel mit den Tropfen und Ort auf die Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen auf den Kopf von Deckel mit PBS oder Wasser unten hängen zu halten, der Kammer befeuchtet. </li><li> Die Schalen werden in den 37 ° C Brutschrank mit 5,0% CO 2. </li><li> Nach 2 Tagen sammeln EBs Tropfen durch Invertieren Deckel und Waschen mit 4,5 ml Differenzierungsmedium im hängenden gebildet. <ol><li> Übertragungsmedien und EBS zu einem neuen 10 cm nicht-Gewebekulturpetrischale. Mit 3 ml Differenzierungsmedium und Transfer zum 10 cm Teller waschen Sie den Deckel wieder. </li></ol></li><li> Ernten der Zellen für die Analyse durch Durchflusszytometrie nach insgesamt 8Tagen Kultur ausgehend von der anfänglichen Übertragung von Zellen auf Differenzierungsmedium (-LIF). </li></ol> 5. Vorbereitung Zellen für Durchflusszytometer-Analyse <ol><li> Übertragungszellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen mit einer 10-ml-Pipette. Waschen Sie die Platte mit 5 ml PBS und Transfer zum gleichen konischen Rohr. </li><li> Pellet-Zellen bei 315 x g. Pellets mit 10 ml PBS waschen. </li><li> 1 ml der aufgetauten Zellablösung Lösung und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min mit gelegentlichem Rühren. Für den Nachweis von bestimmten Zelloberflächenantigenen, kann Trypsin stattdessen verwendet werden. </li><li> 1 ml Differenzierung Medien und pipettieren nach oben und unten mit einem 2-ml-Pipette. Verwenden Sie ein p200 Spitze zum Ende der Pipette zu helfen, brechen-up verdaut EB in Einzelzellsuspension. <ol><li> Das Röhrchen wird in ein 37 ° C Wasserbad für 60 min wieder, damit die integrale Membranproteine ​​auf der Zelloberfläche zu recyceln. </li></ol></li><li> Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen with 0,1% Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA) in PBS (PBS / BSA) hergestellt und Inkubation der Zellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern. </li></ol> 6. Durchflusszytometrie-Analyse für hämatopoetische Vorläufer <ol><li> Platz 10 6 EB-abgeleiteten Zellen in einem 5 ml 12 x 75 mm Rundrohr unten. Zur Einstellung Durchflusszytometer Korrektureinstellungen verwenden Entschädigung Perlen nach Herstelleranweisungen. </li><li> Pellet-Zellen bei 315 x g. Überstand abgießen und Pellet in Rest PBS / BSA-Lösung in der Röhre. </li><li> Zum Erfassen ESC HPC, Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörper: anti-Maus-CD41-PE (R-Phycoerythrin) und Anti-Maus-CD117 (CKIT) -APC / CY7 (Allophycocyanin Cyanin 7). <ol><li> Verdünnte Antikörper 1: 100 in PBS / BSA. 100 ul des verdünnten Antikörpers zu jeder Probe. Bestimmen Sie die richtige Verdünnung des Antikörpers für jeden Lieferanten, Klon und viel oder Antikörper. Bestimmen Sie optimale Verdünnung für die Markierung von Zellen einzeln. </li&gt; </ol></li><li> Proben auf Eis inkubieren im Dunkeln für 30 min. </li><li> 2 ml PBS / BSA-und Pellet-Zellen bei 315 × g für 5 min. </li><li> Überstand wird abgesaugt und das Pellet erneut in 300 ul PBS oder einem isotonischen Puffer. </li><li> Filter resuspendierten Zellen durch eine Zelle Sieb Kappe (0,35 uM), um große Zellaggregate zu entfernen. </li><li> Analysieren Zellen mit einem Durchflusszytometer. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Wie oben diskutiert, können Klone, die ESC induzierbar ein Gen von Interesse exprimieren mit Doxycyclin Systeme erzeugt werden, jedoch ist die Erzeugung dieser Leitungen zeitaufwendig und arbeitsintensiv. In diesem Protokoll beschrieben ist eine Methode, um ein Gen von Interesse in Einzelzellsuspension von ESC vorbereitet abgeleitet EVG auszudrücken. Diese infizierten Zellen werden dann durch hängenden Tropfen auf nachfolgende Differenzierung zu untersuchen, in EBs reformiert. In dem Beispiel (Figur 3)</stron...

Murine embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent, remaining undifferentiated and self-renewing in the presence of the cytokine Leukemia Inhibitory Factor (LIF)1. Upon withdrawal of LIF they will spontaneously differentiate into 3-dimensional (3D) structures called embryoid bodies (EBs)2. The 3D architecture allows for the development of the three germ layers ectoderm, endoderm, and mesoderm, which then later give rise to mature tissue types3. ESCs are an exceptional model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation, particularly the investigation of the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs)4. 
Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow for the determination of a role for individual molecules in development. One of the most common techniques is to use homologous recombination to generate ESC lines, which lack a gene of interest5,6. There are also a number of techniques that have been used to overexpress genes. The first technique used to modify gene expression in ESCs was to infect them with recombinant retroviruses7,8. The gene of interest however is often silenced as the ESCs differentiate into progenitor and mature cell types. Use of lentiviruses has been successful in limiting the silencing of virally expressed genes9. Other viral vectors used for overexpression include adenovirus and adeno-associated virus10. In addition standard transfection techniques to stably introduce expression plasmids are widely used for ESC transgene expression11. One difficulty with these systems is that often expression of a specific gene has different effects depending on its temporal expression. For example, the Smad1 protein affects the development of hematopoietic cells differently during different stages of EB development12,13. 
This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest. The most common system for inducibly expressing transgenes in ESCs uses the tetracycline resistance operon from E. Coli (Escherichia coli). Several different tetracycline systems have been developed. One of the more popular strategies was developed by Kyba and colleagues14. They generated an ESC line (Ainv15), which has the reverse tetracycline transactivator gene inserted into the constitutively active ROSA26 locus. A tetracycline response element (TRE), a downstream LoxP site (locus of X-over P1 from bacteriophage P1), and a promoterless neomycin cassette were introduced into the HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) locus on the X chromosome. Using a CRE recombination approach a gene of interest along with a eukaryotic promoter to drive the expression of the neomycin resistance gene can be inserted into the LoxP site. Correctly targeted ESCs are isolated by G418 selection. These targeted clones then must be tested for doxycycline (or tetracycline) inducible expression of the transgene. This approach has successfully generated ESC lines that inducibly express HoxB4, Stat5, SCL, and Smad714-17. However, generation of these inducible cell lines is time consuming. Described here is a method to disaggregate ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infect the cell suspensions at different days of development, and then reform the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is later evaluated by flow cytometry. In this article an example of how miRNA expression in EB-derived cells effects hematopoietic differentiation is shown. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="470">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:193px;">Reagent</td>
			<td style="width:144px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">DMEM</td>
			<td style="width:144px;">Sigma/ Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">D5796</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma/ Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">M3148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">FBS (ES Screened)</td>
			<td style="width:144px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">FBS (Defined)</td>
			<td style="width:144px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30070.03</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">11140</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Penn/Strep</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">LIF ESGRO</td>
			<td style="width:144px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">ESG1107</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">ACCUMAX</td>
			<td style="width:144px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">SCR006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Tissue Culture Plates 6-well</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-772-1B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Non-treated Plates 6-well</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-772-49</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Petri dish 10cm</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-757-100D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Petri dish 15cm</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-757-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Tube 5mls</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-959-11A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Tube 5mls with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-771-23</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">White sterile resevoirs</td>
			<td style="width:144px;">U.S.A. Scientific</td>
			<td style="width:133px;">111-0700</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated</td>
			<td style="width:144px;">Biolegend</td>
			<td style="width:133px;">133906</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated</td>
			<td style="width:144px;">Biolegend</td>
			<td style="width:133px;">105826</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">RW4 ESCs</td>
			<td style="width:144px;">ATCC</td>
			<td>CRL-12418</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral infection of murine embryonic stem cell derived embryoid body cells for analysis of hematopoietic differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

In diesen Studien verkleistert RW4 (abgeleitet von 129X1 / SVJ Mausstamm) WSR verwendet wurden. EBs wurden nach 3 Tagen der Differenzierung isoliert. Für beste Ergebnisse sollte das EBS kugelförmig und nicht haft (Abbildung 1A, B). Nach spinoculation mit Virus co-exprimieren, die Fluoreszenzmarker GFP zusammen mit einem Gen von Interesse wurden EBs des Hängetropfenverfahren reformiert. EBs wurden erfolgreich aus Zellsuspensionen von 2,0, 2,5 und 3,0 Tage EVG vorbereitet reformiert. Allerdings könnte...

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Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

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