This work was supported by a Pilot and Feasibility Grants from the Indiana University School of Medicine Center (IUSM) for Excellence in Molecular Hematology (NIDDK, 5P30DK090948). Additional funding was provided by a Biomedical Enhancement Grant from IUSM. We would like to thank Dr. Karen Cowden Dahl for commenting on the manuscript.

1 배아 바디 (EB) 형성 <ol><li> 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 유지 된 ESCS을 젤라틴 - 적응. 통로 ESCS MEFs을 제거하기 위해 0.1 % 젤라틴으로 코팅 여섯 잘 조직 배양 접시에 세 번. <ol><li> (표 1) 미분화 세포를 유지하기 위해 함께 LIF ESC 유지 매체를 세포 성장. 확인 세포가 결코 80 %의 합류를 초과하지합니다. 분화 세포 (MEFs에서 제거한 후 10 이하 통로) 낮은 통로를 사용합니다. </li></ol></li><li> ESCS는 EB의 분화 배양되기 전에 날, 통로 세포는 그래서 그들은 약 50-70% 합류 다음 날이 될 것입니다. 세포의 다 능성을 유지하는 ESC 유지 배지에서 세포 배양을 계속한다. </li><li> 6 웰 플레이트 잘 당 : 분화, 흡인 ESC 유지 보수 매체와의 일에 1 ㎖의 인산염 완충 생리 식염수 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 11.9 mM의 인산염 완충액 pH 7.4의 PBS)으로 씻는다. <ol><li> 0.25 %의 tryps의 200 μl를 추가/ 각 EDTA 잘에서 3 분 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 차별화 매체의 800 μL와 트립신 / EDTA를 비활성화합니다. 피펫 위아래 P200 팁 2 ㎖의 혈청 학적 피펫에서 휴식 - 최대 세포를 단일 세포 현탁액으로. 미디어 피펫 팁 인터페이스 사이에 이동되지 않도록 P200 팁 끝에 딱 맞는 있는지 확인합니다. </li><li> 피펫은 위아래로 약 5 ~ 10 배. 피펫 팅하는 동안 거품을 만들 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. PBS 10 ML에 볼륨을 가져와. 실온에서 5 분 동안 315 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거합니다. LIF를 포함 남은 용지를 제거하는 5 ㎖의 PBS로 두 번 세척 할 것. 각 세척 단계와 1.4에서와 같이 원심 분리기. <ol><li> 분화 매체 (표 2) 2 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 혈구 또는 셀 카운터 세포를 세어 10cm 페트리 접시에 6,000-10,000 세포 / ml를 판(비 조직 배양 치료). <ol><li> 각 ESC 라인에 대한 경험적으로 정확한 세포 / ml를 결정합니다. 일반적으로 세균 작업 또는 낮은 부착 판에 사용되는 멸균 페트리 접시를 사용합니다. 주 : 최상의 차별화 결과, 사채가 판에 연결하지 않고도 정지에 남아있는 구체를 형성해야한다. 최소한의 준수와 사람을 찾기 위해 판의 여러 브랜드를 테스트합니다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 차별화 ESCS을 품어. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 주식 </td><td> 최종 농도 </td><td> 볼륨 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1 배 </td><td></td><td> 410 ml의 </td><td> S<html> IGMA / 알드리치 </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES 선별) </td><td> 백퍼센트 </td><td> 15 % </td><td> 75 ML </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> 100 배 </td><td> 1 배 </td><td> 5 ML </td><td> Life 기술 </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 100 배 </td><td> 1 배 </td><td> 5 ML </td><td> Life 기술 </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / 스트렙토 마이신 </td><td> 100 배 </td><td> 1 배 </td><td> 5 ML </td><td> Life 기술 </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-머 캅토 에탄올 </td><td> 14.3 M </td><td> 114 μM </td><td> 4 μL </td><td> 시그마 / 알드리치 </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> 백혈병 억제 인자 (LIF) </td><td> 10 7 단위 / ㎖ </td><td> 1,000 개 / ㎖ </td><td> 50 μL </td><td> 밀리 포아 </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>&quot;ontent&gt; 표 1 : ESC 유지 미디어. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 주식 </td><td> 최종 농도 </td><td> 볼륨 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1 배 </td><td></td><td> 410 ml의 </td><td> 시그마 / 알드리치 </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (사용자가 최적의 차별화에 대한 검사) </td><td> 백퍼센트 </td><td> 15 % </td><td> 75 ML </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> 100 배 </td><td> 1 배 </td><td> 5 ML </td><td> Life 기술 </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 100 배 </td><td> 1 배 </td><td> 5 ML </td><td> 생활 TECHNOLOGIES </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / 스트렙토 마이신 </td><td> 100 배 </td><td> 1 배 </td><td> 5 ML </td><td> Life 기술 </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-머 캅토 에탄올 </td><td> 14.3 M </td><td> 114 μM </td><td> 4 μL </td><td> 시그마 / 알드리치 </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 차별화 미디어. 바이러스 감염에 대한 2 준비 EB 세포 <ol><li> 개발의 원하는 단계에서 (일 2 일 3 사이), 15 ML 원뿔 관에 10cm 페트리 접시에서 교환 사채를 전송합니다. 5 ㎖의 PBS로 접시를 씻고 원뿔 튜브에 세척을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 315 XG에 사채 펠렛. 5 ㎖의 PBS와 EB 세포를 씻으십시오. </li><li> 해동 세포 분리 솔루션 (포함하는 단백질 분해 및 collagenolytic 효소) 1 ㎖를 추가하고 OCC 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브 (또는 창업)을 배치(플릭 또는 빛 소용돌이로 교반부터) asional 교반. </li><li> 차별화 미디어의 한 ML을 추가합니다. 상하 피펫 P200 피펫 팁 2ml를 피펫으로. 30 ~ 60 분 동안 다시 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다. </li><li> 5 분 동안 315 XG에서 세포를 스핀 다운 및 PBS로 세포를 씻어. </li></ol> 3 바이러스 감염 <ol><li> 분화 매체의 1.5 ml의 세포를 재현 탁. 6 잘 아닌 조직 문화 처리 플레이트에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 미리의 표준 기술에 의해 레트로 바이러스를 준비합니다. 바이러스 역가에 따라 세포에 바이러스 뜨는 5-100 μl를 추가합니다. 이 사채의 후속 개혁을 억제로 감염을 향상시키기 위해 폴리 브렌를 추가하지 마십시오. </li><li> 실온에서 90 분 동안 2,120 XG에서 원심 분리하여 바이러스와 세포를 Spinoculate. </li></ol> 4 매달려 방울에 바이러스 성 감염 EB 세포 차별화 <ol><li> 난의 각 웰에 차별화 미디어의 두 ML을 추가nfected EB 세포 현탁액. </li><li> 피펫 multipipettors에 대한 멸균 시약 저수지에 감염된 EB 세포 현탁액의 3.5 ML. 팔 20 μL의 15 ~ 20 행 15cm 페트리 접시의 반전 뚜껑에 방울을 피펫하는 multipipettor를 사용합니다. </li><li> 페트리 접시의 아래쪽에 멸균 PBS 또는 물 10ml를 추가합니다. 그런 다음 페트리 접시에 방울과 장소 뚜껑을 반전. 방울 챔버 가습 유지하기 위해 거꾸로 PBS 이하 물 뚜껑 매달려되어 있는지 확인합니다. </li><li> 5.0 %의 CO 2와 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 이일 후, 차별화 미디어의 4.5 ml의 뚜껑을 세척 반전에 의해 삭제 교수형에 형성 사채를 수집합니다. <ol><li> 새 10cm가 아닌 조직 배양 페트리 접시로 전송 미디어 및 사채. 차별화 미디어와 10cm 플레이트로 전송의 3 ㎖로 한 번 뚜껑을 세척 할 것. </li></ol></li><li> 세포 계측법 (8)의 총 후 흐름에 의한 분석을위한 수확 세포차별화 미디어 (-LIF)에 대한 세포의 초기 전송부터 일 문화. </li></ol> 흐름 사이토 분석을위한 5 준비 셀 <ol><li> 10 ml의 피펫과 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. 5 ㎖의 PBS로 접시를 씻고 같은 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 315 X g에서 펠렛 세포. 10 ml의 PBS와 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 해동 세포 분리 용액 1 ㎖를 추가하고 가끔 교반과 함께 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 배치합니다. 일부 세포 표면 항원의 검출을 위해, 트립신이 대신 사용될 수있다. </li><li> 1 ml의 차별화 미디어를 추가하고 최대 피펫 및 2 ml의 피펫과 함께 아래로. 도와 피펫의 끝 P200 팁을 사용하여 해체 단일 세포 현탁액으로 EB 소화. <ol><li> 세포막 단백질을 세포 표면에 재활용하기 위해서는 60 분 동안 다시 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 5 분 동안 315 XG에서 세포 펠렛. </li><li> 세포 위스콘신 씻으일 0.1 % 소 혈청 알부민 분수 PBS (PBS / BSA)에서 제조 한 V (BSA)와 특정과 세포를 배양는 형광 항체를 태그. </li></ol> 조혈 전구 세포에 대한 6 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 5 ㎖의 12 × 75 라운드 MM 하단 튜브에 열 여섯 EB 파생 된 세포를 놓습니다. 보상 설정 사이토 흐름을 조절하기위한, 제조사의 지시에 따라 보상 비드를 사용한다. </li><li> 315 X g에서 펠렛 세포. 튜브 잔류 PBS / BSA 용액에 뜨는에 resuspend 펠렛을 붓고. </li><li> ESC의 HPC를 검출, 형광 표지 된 항체와 세포를 배양 : 항 - 마우스 CD41-PE (R-Phycoerytherin) 및 항 - 마우스 CD117 (cKit) -APC / CY7 (알로 피코시 아닌 7). <ol><li> 항체 1을 희석 : PBS / BSA 100을. 각 샘플에 희석 항체의 100 μl를 추가합니다. 각 공급 업체, 복제, 로트 또는 항체에 대한 항체의 정확한 희석을 결정합니다. 개별적으로 세포를 라벨에 대한 최적의 희석을 결정합니다. </리&gt; </ol></li><li> 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 샘플을 품어. </li><li> 5 분 동안 315 XG에 2 ㎖의 PBS / BSA 및 펠릿 세포를 추가합니다. </li><li> 기음 상층 액 300 ㎕의 PBS 또는 다른 등장 버퍼에 resuspend 펠렛. </li><li> 셀 스트레이너 캡 (0.35 μM)를 통해 필터 재현 탁 세포 대 세포 집합체를 제거합니다. </li><li> 플로우 사이토에 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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상술 한 바와 같이, inducibly 관심 유전자를 발현 ESC 클론 독시사이클린 시스템을 사용하여 생성 될 수 있지만,이 라인의 생성 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 프로토콜에서 설명하는 교환 사채 파생 ESC로부터 제조 된 단일 세포 현탁액에 대한 관심의 유전자를 표현하는 방법이다. 이 감염된 세포는 이후의 차별화를 검사 할 수 드롭을 걸어서 사채로 개편된다. 예를 (그림 3)에서는</strong...

Murine embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent, remaining undifferentiated and self-renewing in the presence of the cytokine Leukemia Inhibitory Factor (LIF)1. Upon withdrawal of LIF they will spontaneously differentiate into 3-dimensional (3D) structures called embryoid bodies (EBs)2. The 3D architecture allows for the development of the three germ layers ectoderm, endoderm, and mesoderm, which then later give rise to mature tissue types3. ESCs are an exceptional model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation, particularly the investigation of the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs)4. 
Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow for the determination of a role for individual molecules in development. One of the most common techniques is to use homologous recombination to generate ESC lines, which lack a gene of interest5,6. There are also a number of techniques that have been used to overexpress genes. The first technique used to modify gene expression in ESCs was to infect them with recombinant retroviruses7,8. The gene of interest however is often silenced as the ESCs differentiate into progenitor and mature cell types. Use of lentiviruses has been successful in limiting the silencing of virally expressed genes9. Other viral vectors used for overexpression include adenovirus and adeno-associated virus10. In addition standard transfection techniques to stably introduce expression plasmids are widely used for ESC transgene expression11. One difficulty with these systems is that often expression of a specific gene has different effects depending on its temporal expression. For example, the Smad1 protein affects the development of hematopoietic cells differently during different stages of EB development12,13. 
This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest. The most common system for inducibly expressing transgenes in ESCs uses the tetracycline resistance operon from E. Coli (Escherichia coli). Several different tetracycline systems have been developed. One of the more popular strategies was developed by Kyba and colleagues14. They generated an ESC line (Ainv15), which has the reverse tetracycline transactivator gene inserted into the constitutively active ROSA26 locus. A tetracycline response element (TRE), a downstream LoxP site (locus of X-over P1 from bacteriophage P1), and a promoterless neomycin cassette were introduced into the HPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) locus on the X chromosome. Using a CRE recombination approach a gene of interest along with a eukaryotic promoter to drive the expression of the neomycin resistance gene can be inserted into the LoxP site. Correctly targeted ESCs are isolated by G418 selection. These targeted clones then must be tested for doxycycline (or tetracycline) inducible expression of the transgene. This approach has successfully generated ESC lines that inducibly express HoxB4, Stat5, SCL, and Smad714-17. However, generation of these inducible cell lines is time consuming. Described here is a method to disaggregate ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infect the cell suspensions at different days of development, and then reform the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is later evaluated by flow cytometry. In this article an example of how miRNA expression in EB-derived cells effects hematopoietic differentiation is shown. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="470">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:193px;">Reagent</td>
			<td style="width:144px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">DMEM</td>
			<td style="width:144px;">Sigma/ Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">D5796</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma/ Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">M3148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">FBS (ES Screened)</td>
			<td style="width:144px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">FBS (Defined)</td>
			<td style="width:144px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30070.03</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">11140</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Penn/Strep</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">LIF ESGRO</td>
			<td style="width:144px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">ESG1107</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">ACCUMAX</td>
			<td style="width:144px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">SCR006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Tissue Culture Plates 6-well</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-772-1B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Non-treated Plates 6-well</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-772-49</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Petri dish 10cm</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-757-100D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Petri dish 15cm</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-757-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">Falcon Tube 5mls</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-959-11A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Falcon Tube 5mls with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">08-771-23</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">White sterile resevoirs</td>
			<td style="width:144px;">U.S.A. Scientific</td>
			<td style="width:133px;">111-0700</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated</td>
			<td style="width:144px;">Biolegend</td>
			<td style="width:133px;">133906</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:193px;">Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated</td>
			<td style="width:144px;">Biolegend</td>
			<td style="width:133px;">105826</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:193px;">RW4 ESCs</td>
			<td style="width:144px;">ATCC</td>
			<td>CRL-12418</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral infection of murine embryonic stem cell derived embryoid body cells for analysis of hematopoietic differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

RW4을 젤라틴이 연구에서 사용 된 ESCS (129X1 / SVJ 마우스 변형에서 파생). 교환 사채는 차별화 삼일에 고립되었다. 최상의 결과를 위해 사채는 구형 및 비 부착 (그림 1A, B)해야한다. 바이러스가 관심의 유전자와 함께 형광 마커 GFP를 공동으로 표현하는 spinoculation 후, 교환 사채는 매달려 드롭 방식으로 개혁되었다. 사채 성공적 2.0, 2.5, 및 3.0 일 사채로부터 제조 세포 현탁액으로부터 개질...

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Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

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