Ce travail a été financé par le Conseil suédois de la recherche médicale (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; les fondements de la Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Martha Lundqvist et Sigurd och Elsa Goljes Minne et la Société suédoise de médecine SLS-95151. Professeur Gene D. Block, UCLA, est remerciées pour leurs précieux commentaires sur le manuscrit. Nous remercions le Dr Michael Andäng et le Dr Hélène Johard pour le bloqueur des canaux HCN, et le professeur Abdel El-Manira pour fournir des vidéo-microscope. Considérations éthiques: Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Institut Karolinska et de &quot;Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Toutes les expérimentations animales sont réalisées avec l&#39;intention de minimiser tout éventuel stress ou d&#39;inconfort à l&#39;animal.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. 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Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. 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T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

Avantages et inconvénients de la technologie rapporteur de la luciférase Contrairement à l&#39;ex méthodes in vivo, comme la RT-PCR, hybridation in situ et Western blot qui nécessitent l&#39;échantillonnage des tissus à de nombreux points de temps différentes (donnant une résolution temporelle faible normalement 2-4 heures selon la fréquence d&#39;échantillonnage), afin d&#39;étudier diurnes les variations dans les expressions des gènes et des protéines, la technologie permet rapporteur de la luciférase à haute résolution (1-10 min) des études sur les oscillations circadiennes pendant plusieurs jours dans la même préparation. Des études Ainsi, le nombre d&#39;animaux utilisés est réduit au minimum et détaillée des effets sur la phase et la période du rythme sont possibles, ce qui n&#39;est normalement pas possible en utilisant des techniques d&#39;échantillonnage classiques avec une résolution temporelle faible. Cependant, bien que les mesures d&#39;amplitude relative de rythme sont possibles, il convient de souligner que la technologie journaliste n&#39;est pas quantitatif et ne peut donc pas être utilisés pour mesurer les quantités de gènes transcrits ou des protéines traduites. Les enregistrements de tissu peut être démarré et analysés immédiatement après mise en culture, un grand avantage pour étudier directement les effets du stress moléculaire in vivo, en phase de changements in vivo induite par la lumière etc La culture organotypique SCN permet à long terme (semaines) la manipulation pharmacologique du cerveau adulte tissu contenant une intactes réseau mature synaptique et la technologie rapporteur luciférase permet des enregistrements stables pendant plusieurs semaines. Ainsi, le tissu n&#39;a pas besoin d&#39;être postnatale néonatale ou tôt afin d&#39;obtenir des cultures saines, et contrairement à la tranche aiguë chronique traitements pharmacologiques peuvent être effectuées. Contrairement à un plasmide reporter de transfections dans des cultures cellulaires, ce qui ne pas conduire à l&#39;incorporation de l&#39;ADN dans le génome, la luciférase transgéniques-modèles animaux (ainsi que lenti-virus transfections) sont favorables si altérations épigénétiques sont à étudier. Il devrait dans ce contexte également être mentionné que l&#39;imagerie de luminescence est aujourd&#39;hui possible avec des caméras CCD très sensible 11, qui permet des enregistrements même en neurones SCN unique (~ 60-10 um) et d&#39;autres types cellulaires, utilisés par les grands laboratoires étudient les rythmes circadiens. Enfin, plusieurs enquêteurs circadien utilisent couramment le suivi d&#39;expression moléculaire en utilisant d&#39;autres reporters, comme la protéine fluorescente verte, afin d&#39;étudier des gènes d&#39;horloge / oscillations protéines 16-19. Aspects de l&#39;épaisseur de coupe Les épaisseurs recommandé ici de la tranche SCN (200-300 um) pourrait être réduit ou augmenté, si désiré. Cependant, bien que le tissu s&#39;aplatit sur ​​la membrane après quelques jours de culture, il est recommandé de ne pas dépasser 500 um d&#39;épaisseur de la tranche d&#39;abord coupé afin de préserver la viabilité du tissu 7. Une tranche mince de 100 um est de raisons mécaniques et pratiques difficiles à manipuler. Parce que le tissu SCN est hétérogène de l&#39;épaisseur de la tranche peut affecter la phase du signal de sortie de la luciférase, depuis les différentes régions au sein du SCN (par exemple le «noyau» par rapport à la «coquille», et les régions dorsale par rapport ventrale) oscillent avec les différentes phases 20 et différentiellement re-synchroniser après déphasages 21. L&#39;épaisseur de la tranche affecte également la base du nombre de photons, depuis plus de tissu émet un plus grand nombre de photons. L&#39;amplitude des oscillations moléculaires peuvent de cette manière être indirectement affectés par la taille de l&#39;explant. Pour ces raisons, le contrôle et les cultures traitées doivent toujours être de la taille, la même épaisseur et contenant la même région du SCN afin d&#39;osciller dans la même phase et avec la même amplitude. Les deux noyaux unilatérale, d&#39;autre part, oscillent en phase les uns avec les autres et avec des amplitudes similaires aussi longtemps que la coupe vibratome est horizontal et non incliné (qui à son tour dépend de celui de la séparation nette entre le cervelet et les deux hémisphères est perpendiculaire la surface de la table). L&#39;enquêteur qui effectue la culture SCN pourraient éprouver que les cultures SCN ne oscillent en phase les uns avec les autres. Pratiquer et la standardisation de la technique de tranchage, à savoir les tranches sont toujours coupées à la même rostro-caudale niveau de la SCN, permettra d&#39;améliorer le résultat. Les étapes critiques <ol><li> D&#39;alimentation en oxygène est critique. Parce que le cerveau a besoin de beaucoup d&#39;oxygène 22, la procédure de tranchage doit être rapide (Le plus proche est de 03/01 à 03/10 ~ 5-6 minutes, le mieux c&#39;est dans le but de garder les tissus sains). </li><li> Le SCN est sensible aux changements de température et d&#39;échange à moyen terme. Le SCN est sensible à la température et les changements de température peuvent grands déphasage du stimulateur cardiaque et provoquer des artefacts expérimentaux 23. Si le milieu ou les solutions sont échangés ou ajouté lors d&#39;une expérience en cours, par exemple lors de l&#39;application d&#39;un médicament après quelques jours de culture, le milieu ou la solution doit être préchauffée à 36-37 ° C (la température de même que dans la chambre) avant l&#39;addition. Dans les expériences pharmacologiques qui impliquent des échanges moyen, il est important de toujours travailler avec pré-conditionné milieu de culture cellulaire. Ajout / wash-out avec des produits frais, moyen inconditionnée peut potentiellement déphasage du rythme SCN 24 moléculaires ainsi que d&#39;autres cultures de cellules de type 25. </li><li> La composition du milieu. Il est important de la culture de tissus dans bon pH et l&#39;osmolalité. Le milieu de l&#39;air-tampon contient une grande quantité d&#39;HEPES, qui a une capacité tampon optimale dans la gamme de pH 6.8 à 8.2 et est également approprié pour la mise en mémoire tampon des changements de pH qui peuvent survenir à la suite de la respiration cellulaire. HEPES, d&#39;autre part, est plus sensible aux variations de température par rapport au bicarbonate de sodium, qui est inclus en petites quantités dans le milieu de culture. Le bicarbonate de sodium a une capacité plus grande mémoire tampon dans le bas du pH (05/01 au 07/01) rang 26, donc approprié dans une atmosphère de CO 2. Cependant, l&#39;augmentation des quantités de bicarbonate de sodium dans le milieu de l&#39;air-buffering (DMEM 2902) augmente significativement l&#39;osmolalité et ne peuvent pas être ajoutés sans simultanément dilution du milieu, ce qui entraîne à son tour dans la composition incorrecte d&#39;acides aminés, des vitamines et des ions. Conseils pour la préparation du milieu: <ol><li> Soyez précis et prudent quand mélanger le médium. </li><li> Utilisez des solutions stock uniquement frais ou fraîchement décongelé. </li><li> En cas d&#39;osmolalité très élevé, il ne vaut pas diluer. Plus que 5-6% de la dilution moyenne sera très probablement ne fonctionnera pas. Utilisez le D-glucose pour augmenter l&#39;osmolalité si elle est trop faible. </li></ol></li><li> Déphasages dus au temps de préparation Le temps de préparation de tranches est critique. Effet nul ou minime sur la phase est obtenue si la procédure de tranche est réalisée entre ZT 6 au 12 décembre. Tous les dissections tranche devrait être réalisée à la même phase du cycle circadien diurne ou afin de minimiser les erreurs dues à la variation entre la phase des préparatifs. </li></ol> D&#39;éventuelles modifications <ol><li> Pour électrophysiologie SCN aiguë, le tranchage doit être réalisé avec une sonnerie (Artificial liquide céphalorachidien; ACSF) tampon, saturée en oxygène (95% d&#39;O 2, 5% CO 2) avant le début de tranchage. En outre, l&#39;oxygène doit être ajouté en continu à la mémoire tampon pendant toute la procédure de tranchage, de l&#39;activité électrique et synaptique est directement dépendante de l&#39;apport d&#39;oxygène 22. </li><li> Tranches horizontales et sagittal peut également être préparé avec succès et cultivée de la SCN. Les auteurs ont de l&#39;expérience avec des enregistrements luciférase en tranches horizontales, ce qui, selon notre expérience donnent oscillations circadiennes avec faible amplitude par rapport à la coupe coronale. </li><li> Le SCN est d&#39;environ 1 mm de long rostro-caudales et la technique de découpage décrite ici est orientée vers l&#39;acquisition d&#39;une section SCN dans la région centrale. Cependant, plus d&#39;une section SCN peuvent être obtenus auprès de la souris et cerveaux de rats, permettant à l&#39;enquête sur circadien gène / protéine d&#39;expression à des niveaux plus rostrale par rapport caudale du noyau du RCS. </li><li> Trancher les cultures de jeunes animaux, chiots postnatale, ou même des embryons, peut également être préparé. S&#39;il vous plaît noter que le cerveau et le crâne chez les chiots très jeunes enfants sont très doux et sensible. En outre, le nerf optique est mince et pas complètement développé. Prenez garde en disséquant le cerveau des bébés afin que la région SCN n&#39;est pas endommagé. Par exemple, des outils de micro rongeur ne peut pas être utilisé pour ouvrir le crâne des bébés souris, car elles sont trop grosses. Ciseaux fins suffisent pour couper les tissus mous de jeunes chiots. </li><li> Le couvercle en verre de la culture technique basée décrites ici peuvent aussi être utilisés pour la luminescence image à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD / EM-CCD, également dans les neurones SCN unique. </li><li> Autres régions centrales du système nerveux et des tissus d&#39;organes périphériques à partir transgéniques PER2:: LUC animaux peuvent être facilement obtenus, cultivés et analysés en termes d&#39;oscillations moléculaires, comme la PER2:: expression LUC continue à osciller pendant plusieurs jours aussi dans un certain nombre d&#39;autres tissus types de cellules et 10. La plupart de ces tissus périphériques, pour le foie, par exemple, ne nécessitent pas une membrane pour la survie, mais sont plutôt cultivées directement baigné dans le milieu 11. S&#39;il vous plaît noter que le déphasage dû à la coupe, la culture et l&#39;échange moyennes peuvent ne pas suivre les mêmes principes que pour SCN. </li></ol> Signification Dans des souris transgéniques et les souches de rat (mPER2:: LUC; mPer1-Luc 8, 10, 27) l&#39;activité enzyme luciférase reflète protéines ou des rythmes expression des gènes et peut être évaluée par l&#39;enregistrement de bioluminescence. La bioluminescence luciférase produite donne un signal faible mais la luminescence de fond est proche de zéro, ce qui rend cette méthode avantageuse. Par ailleurs, parce que la molécule est instable et la luciférase rapidement dégradé il n&#39;ya pas de phototoxicité, qui peuvent apparaître pendant une longue illumination excitateurs 28. Pris ensemble, ces propriétés permettent à long terme des expériences rendant la technologie rapporteur luciférase très avantageux dans la recherche du rythme circadien.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

Une centrale circadien (~ 24 h) coordonner l&#39;horloge rythmes quotidiens dans la physiologie et le comportement réside dans le noyau suprachiasmatique (NSC), situé dans l&#39;hypothalamus antérieur. L&#39;horloge est directement synchronisé par la lumière via la rétine et du nerf optique. Oscillations circadiens sont générés par l&#39;interaction des boucles de rétroaction négative d&#39;un certain nombre de soi-disant «gènes de l&#39;horloge» et leurs produits protéiques, y compris la période (Per) des gènes. L&#39;horloge de base est également dépendante de dépolarisation de la membrane, le calcium et le camp 1. Le SCN indique oscillations quotidiennes de l&#39;expression des gènes d&#39;horloge, l&#39;activité métabolique et activité électrique spontanée. Remarquablement, cette activité cyclique endogène persiste dans des tranches de tissu adulte du SCN 2-4. De cette façon, l&#39;horloge biologique peut facilement être étudié in vitro, permettant d&#39;enquêtes moléculaires, électrophysiologiques et métaboliques de la fonction de stimulateur cardiaque. Le RCS est un petit, bien définis structure bilatérale situé juste au-dessus du chiasma optique 5. Chez le rat qu&#39;il contient ~ 8.000 neurones dans chaque noyau et a des dimensions d&#39;environ 947 um (longueur, axe rostrocaudal) x 424 um (largeur) x 390 um (hauteur) 6. Pour disséquer le SCN, il est nécessaire de couper une tranche de cerveau au niveau spécifique du cerveau où le SCN peuvent être identifiés. Ici, nous décrivons la procédure de dissection et tranchage du SCN, qui est semblable pour les souris et les cerveaux de rats. En outre, nous montrons comment la culture des tissus disséqués organotypically sur une membrane 7, une technique développée pour la culture de tissus SCN par Yamazaki et al. 8. Enfin, nous montrons comment les tissus transgéniques peuvent être utilisés pour mesurer l&#39;expression des gènes de l&#39;horloge / protéines en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase, une méthode qui était à l&#39;origine utilisé pour les mesures du rythme circadien par la Geusz et al. 9. Nous avons ici l&#39;utilisation des tissus de la SCN transgéniques knock-in période2:: souris luciférase produite par Yoo et al 10.. Les souris contiennent une protéine de fusion de PÉRIODE (PER) 2 et l&#39;enzyme luciférase Firefly. Lorsque PER2 est traduit dans la présence du substrat de la luciférase, c&#39;est à dire la luciférine, l&#39;expression PER2 peut être contrôlé que lorsque la bioluminescence luciférase catalyse l&#39;oxydation de la luciférine. Le nombre de photons émis est positivement corrélée à la quantité de protéine produite PER2, et les rythmes de bioluminescence adapté au rythme des protéines in vivo PER2 10. De cette façon, la variation cyclique de l&#39;expression PER2 peuvent être surveillés en permanence en temps réel pendant plusieurs jours. Le protocole que nous suivons pour la culture des tissus et l&#39;enregistrement de bioluminescence en temps réel a été minutieusement décrites par Yamazaki et Takahashi 11.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

La procédure de préparation des tranches contenant les souris adulte hypothalamique suprachiasmatique noyau (SCN), et un moyen rapide de la culture des tissus SCN dans un état de culture organotypique, sont rapportés. En outre, la mesure de l&#39;expression de la protéine horloge oscillatoires gènes en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase est décrite.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.9K vues.  Karolinska Institutet. La procédure de préparation des tranches contenant les souris adulte hypothalamique suprachiasmatique noyau (SCN), et un moyen rapide de la culture des tissus SCN dans un état de culture organotypique, sont rapportés. En outre, la mesure de l'expression de la protéine horloge oscillatoires gènes en utilisant la technologie Dynamic rapporteur de la luciférase est décrite.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Enregistrement et analyse des rythmes circadiens dans la course roue-activité chez les rongeurs

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.

Stimulation à courant continu et multi-réseau d&#39;électrodes d&#39;enregistrement de la capture comme activité chez la souris Cerveau Slice Préparation