Ce travail a été soutenu par l&#39;Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs à EFN), Fondation Voir et Entendre et la Fondation Bettencourt Schueller (subventions pour jeunes chercheurs à EFN), Centre national de la recherche scientifique (CNRS, poste permanent pour l&#39;EFN) et Le National Eye Institute des National Institutes of Health (R01-EY13295 à EFC). En outre, l&#39;Institut de la Vision est financé par l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre national de la recherche scientifique et le département de Paris.

Cette expérience de l&#39;isolement de POS prend du temps et peut nécessiter jusqu&#39;à 12 heures pour compléter si POS sont étiquetés avant le stockage. Le protocole a été adapté à partir d&#39;un document publié par RS Molday et ses collègues en 1987 31 et modifié par SC Finnemann et ses collègues en 1997 10. Les animaux ont été traités selon l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research. Des protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d&#39;éthique de l&#39;Université Charles Darwin Pierre et Marie Curie-Paris 06 et le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Université Fordham. 1. Généralités Set Up <ol><li> Obtenir 80 porcs ou de vaches fraîches yeux aussi frais dès après l&#39;abattage que possible et garder réfrigéré dans l&#39;obscurité. Fournir des instructions au fournisseur afin que l&#39;entreprise procède de la même façon. Ce protocole est optimisé pour 80 yeux. Àprocéder à plus d&#39;yeux et obtenir des stocks plus importants (par exemple, à partir de 160 yeux), doubler les quantités de solutions et effectuer deux tours de ultracentrifugation; Des échantillons de la piscine par la suite à l&#39;étape de collecte (voir étape 2.2.2). </li><li> Mis en place sur le banc la lampe inactinique rouge, tampons absorbants, lingettes (Table des matières). Préparer des plats de 15 cm et des sacs de risque biologique pour la collecte des déchets (parties de l&#39;œil vitreux, utilisé ...). Porter blouse moulante, gants, manches protectrices et des lunettes. </li><li> Précautions: <ol><li> Pré-refroidir toutes les solutions, puis les conserver au froid durant toutes les étapes. Gardez les yeux et les gradients réfrigérés sur la glace autant que possible. </li><li> Gardez les yeux et les tissus dérivés dans l&#39;obscurité autant que possible jusqu&#39;à ce que l&#39;étape de collecte après l&#39;ultracentrifugation pour éviter photoblanchiment des pigments visuels et la perte de la couleur orange-rose de la forme active des photopigments. </li></ol></li></ol> 2. Protocole Actions <ol><li> Préparer des solutions et des gradients: <ol><li> Thaw taurine stocks complètement en utilisant un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Préparer toutes les solutions de solutions d&#39;achat d&#39;actions (tableau 1, les solutions mères) et bien mélanger le saccharose et d&#39;autres ingrédients à l&#39;aide d&#39;un agitateur magnétique pour chaque solution. <ol><li> Préparer 15 ml de la solution d&#39;homogénéisation à une concentration finale de 20% de saccharose, 20 mM de Tris pH 7,2 acétate, 2 mM de MgCl2, 10 mM de glucose et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de saccharose à 25% à une concentration finale de 25% de saccharose (en utilisant 70% de saccharose actions), 20 mM d&#39;acétate de Tris pH 7,2, glucose 10 mM et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de saccharose à 60% à une concentration finale de 60% de saccharose (en utilisant une poudre de saccharose), 20 mM de Tris pH 7,2 acétate, 10 mM de glucose et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de lavage à une concentration finale de 20 mM d&#39;acétate de tris pH 7,2 et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de lavage 2à une concentration finale de 10% de saccharose, 20 mM d&#39;acétate de tris pH 7,2 et 5 mM de taurine. </li><li> Préparer la solution de lavage 3 à une concentration finale de 10% de saccharose, 20 mM de phosphate de sodium pH 7,2 et 5 mM de taurine. </li></ol></li><li> Stabiliser le fabricant de gradient sur un agitateur magnétique et d&#39;insérer une barre d&#39;agitation dans la chambre la plus proche de la sortie où la solution de 60% sera inséré. Utiliser un embout pipette P200 coupure placé à la sortie du tube pour atteindre la vitesse de coulée appropriée. </li><li> Fonte gradients linéaires délicatement en diluant et en agitant la solution de saccharose à 60% avec celui de 25% en utilisant 12 ml de chaque solution (à savoir, au total six tubes pour 80 yeux) dans des tubes d&#39;ultracentrifugation de pré-réfrigérés. Agiter la solution progressivement diluer-saccharose 60% ainsi. Stabiliser la vitesse d&#39;écoulement gradient, versant la solution en douceur et pas trop vite. NOTE: Afin d&#39;obtenir un gradient linéaire continue, gardez l&#39;ouverture de la pointe de la pipette à droite à la surface de la solution pour l&#39;ensemble de formatio de gradientn. </li><li> Laissez les gradients sont assis sur la glace pendant environ 1 h pour la stabilisation. Gardez les gradients réfrigérés jusqu&#39;à leur chargement. Ne secouez pas les tubes pour éviter la perturbation du gradient. </li></ol></li><li> collecte de tissu: <ol><li> Recueillir tissus sous faible lumière rouge. Prenez un oeil dans une main et pousser l&#39;avant avec le bord de la lame de rasoir tout en maintenant le regard loin (pour éviter les éclaboussures; Figure 1). Utilisez la lame de rasoir pour couper le globe oculaire antérieure en deux moitiés (cornée, plus au moins 5 mm dans la sclérotique). Retirez la lentille et retournez l&#39;œilleton intérieur de telle sorte qu&#39;il peut être tenu sur la pointe d&#39;un doigt exposant ainsi la rétine. </li><li> Utilisation de la lame de rasoir à un angle, grattez délicatement la rétine, détacher facilement et apparaissant comme une couche rose, sur la surface de tapetum et couper à la tête du nerf optique (Figure 1). Collecter toutes les rétines en 2 x 50 ml tubes contenant 15 ml de solution d&#39;homogénéisation sur la glace. </li><li> Homo Retinagenization: <ol><li> Secouez la suspension vigoureusement à la main pendant 2 minutes afin de perturber les différentes couches de cellules, briser POS hors le reste de la cellule de PR, fragment POS et homogénéiser la suspension rétine. </li><li> Filtre 3x par une double couche de gaze propre pour enlever de grands fragments de tissus et de recueillir l&#39;écoulement continu propres tubes de 50 ml (figure 1). La suspension de la rétine étant assez épais, afin de maximiser le rendement, appuyez doucement sur la gaze pour libérer restants tissus fragmentés après chaque filtration. </li></ol></li></ol></li><li> Photorécepteur extérieure fragment de segment (POS) l&#39;isolement: <ol><li> Posez délicatement la rétine prep brut, autour de 6-7 ml par tube, plus de 6 x 30 ml tubes d&#39;ultracentrifugation contenant chacun 24 ml de fraîches, réfrigérées continue 25 - gradient de saccharose à 60% (figure 1). Équilibrer les tubes opposés, le cas échéant pour le rotor à utiliser. Ultracentrifugeuse à 106 000 g pendant 50 min à 4 ° C. </li&gt; <li> Éliminer la majeure partie de la solution au-dessus de la bande orange-rose dans le tiers supérieur de gradient par aspiration (figure 2A). Recueillir la bande orange-rose avec une pointe de P1000 coupure dans un bécher. Jeter le reste après neutralisation en utilisant l&#39;eau de Javel (biologique des déchets). </li><li> Diluer avec ~ 4-5 volumes de glace froide Laver une solution. Séparer en autant de tubes de 30 ml au besoin. Centrifuger à 3000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Prenez soin de le surnageant. </li><li> granulés de remettre en suspension dans 10 ml Laver deux solution et tournent à 3000 g pendant 10 min comme détaillé ci-dessus. granulés de remettre en suspension dans 15 ml Laver 3 et tourner de nouveau à 3000 g pendant 10 min. Combinez suspensions de plusieurs pastilles de réduire le nombre de tubes nécessaires avant centrifugation dans Wash 2 et 3 Lavez solutions. </li></ol></li><li> POS aliquotage sans marquage: <ol><li> Remettre en suspension POS dans 10-20 ml de DMEM. Prédilué 10 pi à 490 pi DMEM (01h50) et le comte allongé ainsi que POS tourbillonnait dans unchambre de comptage de cellules (figure 2B). Calculer le rendement et la concentration en particules POS par ml. NOTE: Le rendement varie en fonction principalement sur ​​l&#39;âge et la souche de porcs / vaches et la taille des yeux, par exemple, une bonne préparation est comprise entre 5 - yeux 8 x 10 9 POS de 80 de porcs. </li><li> Décider sur le volume de DMEM final (typiquement de 10 à 20 ml) et ajouter du saccharose pour obtenir une concentration finale de 2,5% de saccharose. </li><li> Préparer des aliquots de la taille souhaitée, par exemple, 5 x 10 7 POS par tube pour la remise en suspension d&#39;un volume de 2 ml pour une expérience de 96 puits à 40 uL / puits. Spin une aliquote pendant 5 min à 2300 xg à température ambiante et d&#39;évaluer la taille de culot. Préparer différentes tailles aliquotes pour différents volumes de la demande comme POS devrait PAS être congelé et décongelé deux fois. </li><li> Congeler aliquotes POS à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. NOTE: Des aliquotes sont stables pendant de nombreux mois. Dans nos mains, non marqué ou étiqueté POS peut être conservé pendant au moins un an. </li></ol></li><li> étiquetage POS et aliquotage: NOTE: Nous utilisons généralement FITC à étiqueter POS pour la quantification des tests de phagocytose, mais d&#39;autres colorants peuvent être utilisés aussi bien en fonction des besoins. <ol><li> Remettre en suspension 1 10 mg FITC flacon à 2,5 mg / ml de concentration de 0,1 M Na tampon carbonate pH 9,5 en mélangeant 2,6 ml 0,1 M NaHCO 3 pH 8,4 à 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tableau 2, des solutions d&#39;achat d&#39;actions). Tourner pendant une heure à température ambiante tout en protégeant de la lumière et de spin pendant 5 min à vitesse maximale pour sédimenter solides FITC non remises en suspension. </li><li> Reprendre le culot de POS dans 10 ml de solution de lavage 3 (ou DMEM) et ajouter 2 ml de solution pour 80 FITC yeux. Conservez les restes FITC congelé à -80 ° C. Tourner pendant au moins 1,5 heure à température ambiante. Protéger de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Laver POS marqué deux fois en utilisant Wash 3 solution comme décrit dans la section 2.3.4, puis une fois ou deux fois dans du DMEM jusqu&#39;à ce que presque aucune FITC libre est vu dans le surnageant fraction. Remettre en suspension dans du DMEM POS et procédez comme pour POS non marqué pour le comptage et aliquotage (section 2.4). </li></ol></li><li> Utilisation de POS dans les expériences: <ol><li> POS décongeler à température ambiante, et de les garder dans l&#39;obscurité autant que possible se ils sont marqués par fluorescence. Spin pendant 5 min à 2300 xg à température ambiante. Aspirer le surnageant. </li><li> Immédiatement remettre en suspension dans un volume approprié de la solution de dosage comme dicté par l&#39;expérience. En cas de différents moments de défi POS, POS magasin remis en suspension à la température ambiante dans l&#39;obscurité entre les points de temps pendant plusieurs heures. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Trois étapes ou conditions sont cruciales pour une purification optimisé: qualité de gradient coulée et délicate manipulation des tubes de gradient, en gardant les tissus frais et dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à l&#39;étape de la collecte, de la force de la secousse d&#39;homogénats rétiniennes pour obtenir l&#39;isolement de POS bon du reste de la PR cellule. Si certaines questions se posent à voir la bande orange correctement, ils sont très probablement due à l&#39;une des trois raisons ci-dessus (voir ?...

Dans la rétine, la vision est provoquée par isomérisation des molécules photosensibles appelées opsines, avant d&#39;être transformé en un signal qui peut être transmis entre les neurones jusqu&#39;à des zones visuelles du cerveau. Ces molécules sont intégrées dans des piles de disques membraneuses ressemblant à crêpes qui constituent les parties de segments extérieurs des cellules photoréceptrices (PR). Être soumis à une exposition constante à des niveaux considérables donc du stress oxydatif et de la lumière, les PR renouveler continuellement leurs segments extérieurs à limiter les dommages oxydatifs potentiel. Photoréceptrices segments extérieurs sont en contact étroit avec microvillosités apicale des cellules voisines épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Cellules RPE constitue la partie extérieure de la barrière hémato-rétinienne et assurent de nombreuses tâches qui sont cruciaux pour photorécepteurs santé et de la fonction 1, telles que la trempe des rayons lumineux par l&#39;intermédiaire de pigments mélaniques, re-isomérisation du photoréactif rétine de composante de opsine, fournissant des nutriments et de gCROISSANCE facteurs, en participant à l&#39;élimination PR métabolite. En outre, les cellules RPE éliminent passé POS et recyclent leurs composants, une occupation quotidienne qui est réglementée par le rythme circadien dans la rétine des mammifères 2,3. La clairance du hangar POS est absolument nécessaire pour la survie de PR. Quand il est complètement abrogée, les débris se accumulent POS et PRS dégénèrent provoquant rapide de 4,5 perte de vision. Si le profil rythmique est perdu et remplacé par une activité constante, PR et RPE défauts se accumulent avec l&#39;âge de 6. Par conséquent, il est très important de caractériser la régulation moléculaire d&#39;un EPR phagocytose in vitro afin de comprendre phénotypes liés à son dysfonctionnement. Fait intéressant, la machinerie moléculaire dans les cellules RPE est très similaire à celle utilisée par les macrophages pour effacer les cellules apoptotiques et les deux dépendent de la reconnaissance de la phosphatidylsérine exposée sur les débris phagocytaire 9.7. Pourtant, les cellules macrophages et RPE réguler le pHagocytosis différemment, comme les macrophages optent pour l&#39;élimination immédiate de cellules apoptotiques au moment de la rencontre tandis que les cellules RPE engloutir rythmiquement POS seulement une fois par jour en dépit de leur contact permanent avec des segments extérieurs. Cela suggère des mécanismes de régulation spécifiques qui ne sont pas encore bien compris. Un grand nombre de molécules impliquées dans le mécanisme de phagocytose RPE ont été identifiés validé ou grâce à l&#39;utilisation de POS isolé et culture de cellules tests de phagocytose. Le récepteur d&#39;intégrine alphavbeta5 située à la surface apicale des cellules RPE, en coordination avec son ligand MFG-E8, se lie spécifiquement à POS 10-12, qui sont ensuite internalisée par l&#39;intermédiaire du récepteur de kinase de tyrosine MerTK 13-15. Le récepteur scavenger CD36 a été montré pour participer à la prise de point de vente et d&#39;influer sur sa vitesse 16,17 et peut servir de capteur de phospholipides oxydés à la surface de 18 points de vente. L&#39;internalisation doit le recrutement de F-cytosquelette d&#39;actine-assdes protéines telles que l&#39;annexine ociated 2 19, la myosine II 20 et de la myosine VIIA 21,22. POS native ou oxydée in vitro sont également utilisés pour comprendre le vieillissement phénotypes de cellules RPE in vivo liés à l&#39;accumulation de mal digéré POS oxydé 23-28. La génération de cellules RPE dérivées de cellules souches a lancé une nouvelle application pour POS isolé qui sont utilisés pour prouver la fonctionnalité des cellules avant qu&#39;elles sont transplantées à des animaux ou patients 29,30,27. Première décrit par Molday et ses collègues en 1987 31, le protocole pour l&#39;isolement de POS bovine combine une étape d&#39;ultracentrifugation d&#39;homogénats rétiniennes sur des gradients de saccharose continues avec l&#39;observation de l&#39;apparition d&#39;orange caractéristique de la rétine photopigment écrus (portant 11- rétinien cis). Au cours des 10 dernières années, en raison de précautions prises afin de minimiser le risque de maladie de la vache folle, l&#39;utilisation des yeux porcins est devenu increasingly important. Le protocole décrit ici montre comment obtenir de grandes quantités de POS de porc ou les yeux bovins qui peuvent être aliquotés et conservés pendant de longues périodes de temps. Ceci élimine la nécessité de préparer POS des regards de rongeurs, ce qui nécessite l&#39;aide d&#39;un grand nombre d&#39;animaux par la préparation de POS et le dosage 32,33,21,22. En outre, des détails concernant l&#39;étiquetage POS avant stockage en utilisant des molécules fluorescentes sont données, pour quantifier et visualiser POS de manière simplifiée et comparables pour certaines applications par rapport à l&#39;étiquetage POS après l&#39;essai de phagocytose 32,10. Par conséquent, ces stocks importants pour permettre la reproductibilité et la facilité d&#39;utilisation dans de nombreux types d&#39;expériences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

Analyse de l&#39;une des fonctions vitales de l&#39;épithélium rétinien pigmentaire (RPE) des cellules, la phagocytose des fragments passés distales âgées de segments externes des photorécepteurs (OP) peut être effectuée in vitro. Photoréceptrices segments extérieurs avec des piles de disques membraneuses contenant les machines de phototransduction sont constamment renouvelés dans la rétine. POS usés sont éliminés quotidiennement par des cellules RPE. Rongeur, porcin / bovin et cellules RPE humaines reconnaître POS partir de diverses espèces d&#39;une manière similaire. Pour faciliter l&#39;exécution grande série d&#39;expériences avec peu de variabilité, un stock important de POS peut être isolé de yeux porcins et conservé congelé en aliquotes. Ce protocole prend avantage de la caractéristique de photopigments qui affichent une couleur orange lorsqu&#39;il est maintenu dans l&#39;obscurité. Sous une lumière rouge sombre, rétines sont collectés dans un tampon d&#39;œilletons ouverts coupées en deux. La suspension de cellules de la rétine est homogénéisé, filtré et chargé sur un gradient de sucrose continu. Après centrifugation, POS sont situés dans une bande distincte dans la partie supérieure de la pente qui a une couleur orange caractéristique. POS sont ensuite collectés, filés, remises en suspension séquentielle dans des tampons de lavage, comptés et aliquotés. POS obtenus de cette manière peuvent être utilisées pour des essais et l&#39;analyse de l&#39;activation des protéines, la localisation ou l&#39;interaction à différents moments après la provocation POS phagocytose. Alternativement, POS peut être étiqueté avec des fluorophores, e. G., FITC, avant aliquotage pour la fluorescence ultérieure quantification des POS de liaison ou engloutissement. Autres applications possibles comprennent l&#39;utilisation de défi POS ou POS modifié combiné à des conditions de stress pour étudier l&#39;effet du stress oxydatif ou de vieillissement sur les cellules de l&#39;EPR.

La combinaison du gradient de saccharose linéaire et l&#39;ultracentrifugation permet la séparation des différents composants de la suspension de la rétine par densité. Les cellules RPE et les débris plus grande rétiniennes lourds tombent au ou près du bas de la pente (figure 2A). POS plus léger et plus légers des cellules individuelles ou des débris de cellules de la rétine migrent bandes distinctes pour atteindre la moitié supérieure de la pente d&#39;ici la fin de la période de centrif...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Purification à grande échelle d&#39;origine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K vues.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Vidéo: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrane externe Vésicules: Isolement et analyse de leur potentiel pro-inflammatoire sur Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Isolement des cellules épithéliales salivaires des glandes salivaires humaines pour la croissance in vitro comme Salispheres ou Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...