Nous remercions Kaz Nagaosa et Akiko Shiratsuchi pour leurs conseils.

1. Préparation <ol><li> Préparation de plaques d&#39;agar de jus de raisin frais <ol><li> Ajouter 100 ml d&#39;eau à 4,4 g d&#39;agar et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l&#39;agar. </li><li> Ajouter 80 ml de jus de raisin frais, 5 mL d&#39;acide acétique et 5 mL d&#39;éthanol à la solution d&#39;agar. </li><li> Verser environ 1,5 ml de la solution avec une pipette sur chaque glissière de verre, et la laisser solidifier. </li></ol></li><li> Préparation de plaques d&#39;agarose à plat de 6 cm <ol><li> Ajouter 50 ml d&#39;eau à 0,5 g d&#39;agarose et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l&#39;agarose. </li><li> Verser environ 2,5 ml de solution d&#39;agarose sur un plat de 6 cm avec une pipette. </li></ol></li></ol> 2. Phase 16 Collection d&#39;embryons <ol><li> Recueillir des mouches adultes et ajouter 200 femelles et 200 mâles dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Mettez une assiette d&#39;agar de jus de raisin frais sur la levure dans le tube de 50 ml et fermez avec une éponge caP. </li><li> Incuber les mouches à 16 ° C dans la lumière pendant 2 à 3 jours. Changez la plaque une fois par jour. </li><li> Déplacez les mouches vers le noir à 25 ° C pendant 1 h. </li><li> Changez la vieille plaque en une nouvelle sans levure. Laisser moucher des œufs pendant 2 h. </li><li> Recueillir la plaque et incuber à 16 ° C pendant 26 h. </li><li> Recueillir des embryons de la plaque avec un pinceau dans 1 mL de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Laver les embryons deux fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Afin d&#39;éliminer le chorion, ajouter 1,2 ml de solution d&#39;hypochlorite de sodium (2,2 à 3,4% Cl) aux embryons pendant 3 min. </li><li> Laver les embryons 4 fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Placer les embryons sur des assiettes à l&#39;agarose de 6 cm. Ramassez les embryons au stade 16 sous un microscope tel que décrit par Roberts 20 . Recueillir environ 50 embryons dans un tube de test micro Treff de 1,5 ml avec une micropipette. </li></ol> 3. PrepaRation des cellules embryonnaires <ol><li> Laver les embryons deux fois avec 150 μL de PBS. </li><li> Homogénéiser les embryons 30 fois dans un tube à micro-essai de 1,5 ml et un mélangeur de pastilles en présence de 200 μl de collagénase (0,25% (p / v)) dans du PBS. </li><li> Dispersez les cellules embryonnaires en pipettant 10 fois et déplacez la suspension cellulaire vers un tube de 1,5 ml. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 min dans un bain d&#39;eau. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Ajouter 800 μL de PBS à la suspension cellulaire et centrifuger à 1400 x g à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et ajouter 200 μL de trypsine (0,25% (p / v)) dans du PBS aux cellules. Disperse les cellules embryonnaires en pipetant 50 fois. </li><li> Filtrer la suspension cellulaire avec un filtre cellulaire de 70 μm. </li><li> Afin d&#39;arrêter l&#39;activité de la trypsine, ajouter 40 μL de sérum de bovin fœtal inactivé par la chaleur à la suspension de cellules filtrées. Ajouter 800 μL de PBS et centrifuger à 1 400 x g à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Supprimer les supernataNt, suspendre les cellules précipitées dans 200 ul de PBS et centrifuger à 1400 x g à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et suspendre les cellules précipitées dans 30 μL de PBS. </li><li> Monter la suspension cellulaire préparée sur des lames de verre recouvertes de triéthoxysilane aminopropylique et attendre de 10 à 15 minutes jusqu&#39;à ce que les cellules soient fixées aux glissières de verre. </li><li> Retirez la solution restante sur les diapositives en verre avec une pipette. Montez 60 - 70 μL de PBS contenant 4% (p / v) de PFA (paraformaldéhyde) sur les cellules pendant 10 à 15 minutes pour la fixation. </li><li> Retirez la solution de fixation et placez les diapositives de verre dans du PBS pendant plus d&#39;une minute. </li></ol> 4. Coloration des hémocytes <ol><li> L&#39;immunocoloration avec un anticorps anti-Croquemort <ol><li> Tremper en série les lames de verre dans du methanol pendant 10 minutes, dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 min, puis dans du PBS pendant 10 min. </li><li> Monter 20 μL de sérum de porc entier entier à 5% (v / v) dans PBS contenirNg 0,2% (v / v) Triton X-100 sur les cellules pour le blocage. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Retirez la solution des glissières en verre et montez 20 μL d&#39;antiserès anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) dans du PBS contenant Triton X-100 à 0,2% (v / v) sur les cellules. Incuber les lames à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois. </li><li> Faire tremper les glissières de verre en PBS pendant 10 min. </li><li> Monter 20 μL d&#39;IgG anti-rat marqué à la phosphatase alcaline (0,5% (v / v)) dans du PBS contenant du Triton X-100 à 0,2% (v / v) et du sérum de porc entier entier à 5% (v / v) sur les cellules dans la pièce Température pendant 1 h. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans un tampon contenant 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 pendant 10 minutes. </li><li> Solution de substrat de phosphate de Mount contenant 0,23 mg / ml de 5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP), 0,35 mg / mL nitro bleu de tétrazolium (NBT), Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl 2 sur les cellules. </li><li> Observez les cellules sous un microscope pour une coloration appropriée. Lorsque des signaux violets forts apparaissent dans les granules d&#39;hémocytes, éliminer la solution de substrat et tremper les glissières de verre dans un tampon constitué de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,5 et 1 mM d&#39;EDTA. On recommande de colorer environ 5 à 10 min. </li></ol></li><li> L&#39;immunocoloration avec un anticorps anti-GFP (une autre option pour la coloration des hémocytes) <ol><li> Tremper en série les lames de verre dans du methanol pendant 10 minutes, PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 min et PBS pendant 10 min. </li><li> Monter 20 μL de sérum de porc entier complet à 5% (v / v) dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 sur les cellules pour le blocage. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Retirez la solution sur les lames de verre et montez 20 μL de l&#39;anticorps anti-GFP de souris (1% (v / v)) / PBS cAtteignant 0,2% (v / v) de Triton X-100 sur les cellules. Incuber les glissières à température ambiante pendant une nuit. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois. </li><li> Faire tremper les glissières de verre en PBS pendant 10 min. </li><li> Montez 20 μl d&#39;IgG anti-souris marquée par la phosphatase alcaline (0,5% (v / v)) dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 et 5% (v / v) de sérum de porc entier sur les cellules dans la pièce Température pendant 1 h. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans un tampon constitué de Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 pendant 10 minutes. </li><li> Monter la solution de substrat de phosphatase contenant 0,23 mg / ml de BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 sur les cellules. </li><li> Observez les cellules sous un microscope pour une coloration appropriée. Lorsque les signaux violets apparaissent dans des hémocytes entiers, enlevez la solution de substrat et trempez les glissières dans un tampon constituéDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 et EDTA 1 mM. Il est recommandé de colorer environ 10 à 15 minutes. </li></ol></li></ol> 5. Tacher les cellules apoptotiques par TUNEL <ol><li> Faire tremper les glissières en verre dans PBS pendant 5 min. </li><li> Répétez avec un nouveau PBS. </li><li> Mount Equilibration buffer (Voir la Table des matériaux) sur les cellules pendant 10 min. </li><li> Retirez la solution des glissières en verre et montez 20 μL de solution TdT contenant 5 μL de désoxynucléotidyl transferase terminale et 15 μL de tampon réactionnel sur les cellules à 37 ° C pendant 1 h. </li><li> Retirez la solution des glissières de verre et trempez les glissières dans un tampon constitué de 0,5 ml de STOP / tampon de lavage et 17 ml d&#39;eau. </li><li> Faire tremper les diapositives dans PBS pendant 5 minutes 3 fois. </li><li> Monter 20 μL de Anti-Digoxigenine-Peroxydase sur les cellules à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Tremper les glissières en verre dans PBS pendant 5 minutes 4 fois. </li><li> Faire tremper les lames de verre dans une solution de substrat de peroxydase consistant en 30 ml de Tris-HCl 50 mM, contenant pH7,5La micro spatule complète de 3,3&#39;-diaminobenzidine tétrahydro-chlorure (DAB) et 0,002% (v / v) d&#39;H 2 O 2 pendant 30 s. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.9 jusqu&#39;à ce que les cellules apoptotiques soient colorées au brun. Tremper les lames de verre dans l&#39;eau pour arrêter la réaction de la peroxydase. </li><li> Entourez les cellules avec de l&#39;eau pour l&#39;observation. </li></ol> 6. Mesurer le niveau de phagocytose des cellules apoptotiques <ol><li> Observer les échantillons sous microscope optique afin d&#39;évaluer le niveau de phagocytose. Les cellules positives de Count Croquemort ou les cellules positives pour la GFP comme hémocytes, les cellules TUNEL positives comme cellules apoptotiques et les cellules positives doubles comme phococytes des hémocytes. </li><li> L&#39;indice phagocytaire est défini comme le nombre de cellules double positives pour le nombre total de cellules positives à Croquemort ou de cellules GFP positives. Il est recommandé d&#39;observer plus de 300 hémocytes. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

<html> Nous avons décrit ici un test de phagocytose en utilisant des embryons de Drosophila . En utilisant des cellules embryonnaires dispersées pour mesurer quantitativement la phagocytose, les hémocytes, les phagocytes professionnels de Drosophila , sont immunostained pour le marqueur de l&#39;hémocyte Croquemort ou le GFP axé sur la MA , et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL dans ce protocole. Le niveau de phagocytose est exprimé sous forme d&#39;indice phagocytaire e...

Dans les animaux métazoaires, par exemple, le nématode Caenorhabditis elegans , la mouche à fruits Drosophila melanogaster , et les souris et les humains, un grand nombre de cellules subissent une apoptose au cours du développement pour façonner leur corps et à l&#39;âge adulte pour maintenir l&#39;homéostasie 1 , 2 . Les cellules apoptotiques doivent être rapidement éliminées car elles induisent une inflammation dans les tissus environnants en libérant des matériaux intracellulaires immunogènes, sinon complètement éliminés 3 . Afin de faciliter l&#39;élimination rapide, les cellules apoptotiques présentent les signaux dits &quot;eat-me&quot; qui sont reconnus par les récepteurs d&#39;engulfment des phagocytes et sont éliminés par phagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Ainsi, la phagocytose joue un rôle crucial dans le maintien de l&#39;homéostasie de l&#39;hôte et donc, l&#39;élucidation de la molécule<html> Les mécanismes marquants sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques sont importants. Les mécanismes responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques semblent être conservés d&#39;une manière évolutive chez les espèces des nématodes, des mouches et des souris 7 . Plusieurs tests de phagocytose sont actuellement disponibles pour évaluer l&#39;absorption de cellules apoptotiques dans ces modèles d&#39;animaux. Dans C. elegans , 131 cellules somatiques subissent une mort cellulaire programmée pendant le développement, et les cadavres cellulaires sont phagocytés par des cellules voisines, qui sont des phagocytes non professionnels 8 . Ainsi, le nombre de cadavres de cellules restants dans C. elegans indique le niveau de phagocytose in vivo . En recherchant des mutants de nématodes qui montrent un nombre accru de cellules mortes, plusieurs gènes requis pour la phagocytose ont été identifiés et caractérisés génétiquement 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Des tests de phagocytose ex vivo avec des phagocytes de culture primaire, généralement des macrophages, sont souvent utilisés chez la souris. Les cellules apoptotiques sont préparées en utilisant des lignées cellulaires telles que des cellules Jurkat, et sont mélangées avec des phagocytes primaires. Après une incubation pendant plusieurs heures, le nombre total de phagocytes et de phagocytes engloutis sont comptés afin d&#39;évaluer le niveau de phagocytose. En tant que modification sophistiquée de cette méthode, le groupe de Nagata a développé un test de phagocytose ex vivo avec des cellules exprimant une ICAD résistante aux caspases (inhibiteur de la DNase activée par caspase), dans laquelle les cellules apoptotiques ne subissent pas de fragmentation de l&#39;ADN apoptotique, mais l&#39;ADN est encore clivé lorsque Les cellules sont phagocytées. Lorsque ces cellules sont utilisées comme cibles apoptotiques dans un test de phagocytose, seul l&#39;ADN des cellules apoptotiques englouties est fragmenté et coloré par un marquage de l&#39;extrémité du DUTP médié par TdT (TUNEL). Par conséquent, le niveauL de l&#39;absorption de cellule apoptotique est mesurée en comptant les signaux TUNEL dans un mélange de phagocytes et de cellules apoptotiques 13 . Dans D. melanogaster , les phagocytes professionnels appelés hémocytes, les macrophages de Drosophila , sont responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques 14 , 15 . En plus des essais de phagocytose in vitro avec des lignées cellulaires de culture, des tests de phagocytose in vivo avec des embryons complets de Drosophila sont disponibles. Les embryons de Drosophila sont un outil puissant pour examiner le niveau d&#39;absorption des cellules apoptotiques car de nombreuses cellules subissent une apoptose et sont phagocytées par des hémocytes pendant le développement embryonnaire 14 , 15 , 16 . Un exemple d&#39;un test de phagocytose in vivo est la méthode développée par le groupe de Franc. Dans leur méthode, les hémocytes sont lesProtégés par l&#39;immunocoloration de la peroxidasine, un marqueur d&#39;hémocyte, des cellules apoptotiques sont colorées en utilisant le colorant nucléaire, la 7-amino actinomycine D dans des embryons de Drosophila entiers, et le nombre de cellules posologiques doubles est considéré comme un signal de phagocytose 17 . Un autre exemple d&#39;un test de phagocytose sur des embryons est basé sur le concept de la méthode de Nagata décrit ci-dessus; Cependant, la phagocytose in vivo est évaluée à l&#39;aide des embryons de DNC ( Drosophila caspase-activase DNase) mutants flies 18 , 19 . Ces tests de phagocytose in vivo sont utiles pour observer directement la phagocytose in situ . Cependant, des difficultés sont associées à exclure tout biais possible dans l&#39;étape de compter les cellules phagocytes car il est difficile d&#39;observer tous les phagocytes et les cellules apoptotiques dans les embryons entiers en raison de leur épaisseur. Pour surmonter cette limitation, nous développonsUn nouvel essai de phagocytose dans des embryons de Drosophila . Dans notre méthode, afin de compter facilement les hémocytes phagocytants, les embryons entiers sont homogénéisés pour préparer des cellules embryonnaires dispersées. Les phagocytes sont détectés par l&#39;immunocoloration d&#39;un marqueur de phagocytes, et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL avec ces cellules embryonnaires dispersées. L&#39;utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro qui quantifie précisément le niveau de phagocytose. Tous les génotypes de mouches peuvent être utilisés dans ce dosage si elles se développent au stade 16 des embryons 20 , le stade de développement au cours duquel la clairance cellulaire apoptotique par phagocytose est la plus abondante. Cette méthode présente l&#39;avantage d&#39;évaluer quantitativement le niveau de phagocytose et peut donc contribuer à l&#39;identification de nouvelles molécules impliquées dans la phagocytose des cellules apoptotiques in vivo .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>whole swine serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55993</td>
			<td>For bloking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treff micro test tube(easy fit)&#160; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 4625. 9. 01</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pellet mixer&#160; 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 7339. 9. 03</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0130</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td>
			<td>27250-018</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td>
			<td>KPL</td>
			<td>475-1612</td>
			<td>secondary antibody for 
			stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro- 
			3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td>BCIP, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383213001</td>
			<td>NBT, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Croquemort antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anti-GFP 
			from mouse IgG1&#954; (clones 7.1 and 13.1)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6520</td>
			<td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S7100</td>
			<td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine 
			tetrahydrichloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>11009-41</td>
			<td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Table of Fly Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drpr&#916;5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itgbn2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described in Br&#252;ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-drpr-IR</td>
			<td>VDRC</td>
			<td>4833</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Itgbn-IR</td>
			<td>NIG-fly</td>
			<td>1762R-1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques doivent être élucidés plus en détail en raison de leur rôle dans les maladies immunitaires et intrathables. Nous avons développé ici une méthode expérimentale pour étudier quantitativement la phagocytose à l&#39;aide de la Drosophila de la mouche des fruits, dans laquelle le réseau de gènes contrôlant les réactions d&#39;absorption est conservé d&#39;évolution des mammifères. Afin de détecter et compter avec précision les phagocytes englobants et non absorbants utilisant des animaux entiers, les embryons de Drosophila ont été homogénéisés pour obtenir des cellules dispersées comprenant des phagocytes et des cellules apoptotiques. L&#39;utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro dans lequel il est possible d&#39;observer tous les phagocytes et cellules apoptotiques dans des embryons entiers et quantifier précisément le niveau de phagocytose. Nous avons confirmé que cette méthode reproduit celles d&#39;études antérieuresQui a identifié les gènes requis pour la phagocytose des cellules apoptotiques. Cette méthode permet d&#39;analyser l&#39;engourdissement des cellules mortes et, combinée à la génétique puissante de Drosophila , révélera les réactions phagocytaires complexes qui composent la migration, la reconnaissance, l&#39;engorgement et la dégradation des cellules apoptotiques par des phagocytes.

Afin d&#39;examiner la phagocytose des cellules apoptotiques, les embryons de Drosophila du stade de développement 16 ont été recueillis et préparés sous forme de cellules dispersées. Les hémocytes, les macrophages de Drosophila , ont été colorés par immunocytochimie pour le marqueur hémocytaire &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 en utilisant un anticorps spécifique 19 ,</sup...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d&#39;identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques.

Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

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9.8K vues.  Kanazawa University.  Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d'identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques. 

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Recherche

Immunologie et infection

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Purification à grande échelle d&#39;origine porcine ou bovine photorécepteur Outer Segments pour phagocytose essais sur les cellules épithélium pigmentaire rétinien

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Évaluation de la réponse immunitaire cellulaire de la drosophile, Drosophila melanogaster, à l’aide d’un test In Vivo la phagocytose

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...