Ce travail a été financé par des subventions du NIH AI56168, AI71142, AI87541 et AI100631 au MDP. Maurizio Del Poeta est Burroughs Wellcome chercheur en maladies infectieuses.

1. cholestérol déplétion des cellules J774A.1 avec MβCD <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, semences des cellules de type macrophage 10 5 J774A.1 par puits sur une plaque à 96 puits de culture de cellules dans 200 ul de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% pénicilline / streptomycine (P / S). Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 O / N. </li><li> Retirez le support de la monocouche cellulaire et laver les cellules deux fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) qui a été passé à l&#39;autoclave ou par filtration. </li><li> Ajouter 200 ul de solution MβCD à la concentration désirée (10 mM ou 30 mM dans du PBS) ou 1x PBS comme témoin et incuber pendant 30 min à 37 ° C avec agitation par secousses. Retirer le surnageant et réserve à la température ambiante pour l&#39;analyse quantitative avec un kit disponible dans le commerce immédiatement après la procédure. </li><li> Laver les cellules de deux à trois fois avec PBS 1x ou DMEM dépourvu de sérum et continuer avec une infection ou une lyse des cellules par pipetting deux à trois fois avec H 2 O déminéralisée pour l&#39;analyse par Chromatographie sur couche mince ou d&#39;un kit. REMARQUE: Suite à une déplétion en cholestérol cholestérol kit de quantification disponible dans le commerce peut être utilisé. Voir la section des matériaux pour plus de détails. Suivez les instructions du fabricant à la lettre. </li></ol> 2. Observation du cholestérol contenu par chromatographie sur couche mince (CCM) <ol><li> Laver un réservoir TLC deux fois avec de l&#39;acétone et une fois avec une solution d&#39;éther de pétrole: éther diéthylique: acide acétique (65: 30: 1 en volume). Saturer la cuve avec de l&#39;éther de pétrole: éther diéthylique: acide acétique (65: 30: 1 en volume) et de laisser la solution O / N. NOTE: solvants organiques devraient toujours être utilisés sous une hotte pour éviter l&#39;inhalation de vapeur. Gants et une blouse de laboratoire doivent être portés à tout moment. L&#39;acide acétique est un acide fort et doit être utilisé avec prudence. </li><li> Dans une enceinte de biosécurité, des semences stériles 10 6 J774A.1 cellules de type macrophage par puits sur un CE 6 puitsll plaque de culture dans un volume de 5 ml de DMEM chaud additionné de 10% de FBS et 1% P / S. Incuber à 37 ° C, 5% CO 2 H / N. </li><li> Appauvrissent macrophages de cholestérol en suivant les étapes 1.2 à 1.4, en remplaçant 1 ml pour 200 pi le cas échéant pour tenir compte de la taille de bien plus grande. </li><li> Ajouter 500 ul de trypsine-EDTA à chaque puits, incuber pendant 3 minutes à 37 ° C, et gratter doucement les cellules avec un grattoir à cellules. </li><li> Transférer dans un tube de micro et ajouter un 500 pi supplémentaires de DMEM chaud complété avec 10% de FBS et 1% P / S. </li><li> Faites tourner les cellules pendant 5 min à 300 g et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter un 500 ul supplémentaires de DMEM chaud additionné de 10% de FBS et 1% P / S au culot cellulaire et remettre en suspension avec précaution par aspiration et refoulement. </li><li> Retirer 10 pi de cellules et de compter les cellules sur un hémocytomètre. Normaliser les concentrations de cellules de chaque échantillon et ajouter un nombre égal de cellules dans des tubes de verre. NOTE: A ce stade, on peutchoisir de combiner des cellules des mêmes groupes de traitement pour obtenir un extrait plus concentré lipidique final. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et enlever médias. </li><li> Ajouter 2 ml de methanol et vortex. Ensuite, ajoutez 1 ml de chloroforme et vortex. Vérifiez l&#39;état de phase pour se assurer que la solution monophasique. REMARQUE: Tubes peut être conservé à 4 ° CO / N. </li><li> Centrifuger à 1700 g pendant 10 min à température ambiante et transférer le surnageant dans un nouveau tube </li><li> Ajouter un 1 ml supplémentaires de chloroforme suivie par 1 ml de dH 2 O. Vortex deux fois pendant 30 s. Centrifuger à 1700 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Peser un tube de verre sur une balance sensible et en utilisant une pipette Pasteur en verre pour transférer la phase inférieure dans le tube de verre de poids connu. </li><li> Séchez les lipides dans un évaporateur centrifuge à sec (environ 2 h). Peser tube avec lipides séchés et calculer le poids lipidique sec. REMARQUE: lipides sec peut être stocké dans -20 ° C jusqu&#39;au moment d&#39;effectuer TLC. </li><li> Diluer lipides séchés suffisamment chloroforme pour normaliser la concentration de lipides (généralement de 20 à 50 pi) et la charge 20 pi du lipide dilué sur une plaque de CCM de silice. Charge 20 pg de cholestérol dilué dans 20 ul de chloroforme en tant que standard. </li><li> Ajouter plaque de CCM séché pour le réservoir TLC saturés et permettre au solvant de migrer jusqu&#39;à 1 cm avant bord de la plaque. Retirer la plaque TLC du réservoir et laisser sécher environ 5 min. </li><li> Visualisez lipides en plaçant dans un réservoir de la vapeur d&#39;iode pour vérifier la migration. Retirer et laisser des taches à se estomper pendant environ 10 à 15 min sous le capot. NOTE: L&#39;iode est un danger d&#39;inhalation. Toujours utiliser sous une hotte. </li><li> Préparer une solution neutre pour la coloration des lipides en combinant 60 ml de methanol avec 60 ml d&#39;H 2 O déminéralisée, 4 ml d&#39;acide sulfurique et 630 mg de chlorure de manganèse. </li><li> Soigneusement et lentement plonger la plaque CCM dans la solution lipide neutre de coloration dans un plateau et à retirer sans desquamation de la silice layer. REMARQUE: La solution de coloration lipide neutre peut être réutilisé plusieurs fois et ainsi il peut être récupéré à partir du plateau et replacé dans une bouteille pour une utilisation ultérieure. </li><li> Laisser sécher la plaque sous le capot à la température ambiante jusqu&#39;à ce que toutes les bulles ont disparu. Chauffer la plaque de CCM sur un ensemble de blocs de chaleur à 160 ° C et de l&#39;omble à la couleur désirée. REMARQUE: Un programme de densitométrie tels que Vision d&#39;entreprise LS peut être utilisée pour quantifier les bandes carbonisés pour comparer des échantillons de lipides. </li></ol> 3. infection des macrophages avec C. neoformans (H99) <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, les graines 10 5 cellules comme les macrophages par puits sur une plaque à 96 puits de culture de cellules dans 200 ul de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% P / S. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2, 5% de CO 2 O / N. NOTE: L&#39;infection peut également se faire en fond de verre plats pour l&#39;imagerie confocale plus facile; tous les montants restent les mêmes. </li><li> Développer une culture de C. neoformans (H99)en inoculant 10 ml de YNB avec une colonie provenant d&#39;une plaque de frappe et l&#39;incubant O / N à 30 ° C avec agitation par secousses. </li><li> Laver et compter C. neoformans (H99) cellules. <ol><li> Centrifugeuse C. neoformans O / N culture à 1700 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirez le support et le jeter. Laver les cellules avec 5 ml de PBS 1x. Centrifuger à 1700 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirer PBS et laver avec 5 ml de PBS 1x filtrée. Centrifuger à 1700 xg pendant 10 min à 4 ° C. Répétez cette étape deux fois plus. </li><li> Retirer du PBS et remettre en suspension dans 5 ml de 1 x PBS. </li><li> Ajouter une dilution en série dans du PBS pour obtenir une dilution 1: 500 de la culture lavé. <ol><li> Ajouter 100 ul de l&#39;échantillon initial de 900 ul de 1 x PBS pour obtenir une dilution de 1:10. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;échantillon dilué à 1:10 900 ul de 1 x PBS pour obtenir une dilution à 1: 100. </li><li> Ajouter 200 ul de 1: 100 à échantillon dilué 800 ul de 1 x PBS pour obtenir un rapport 1: 500 dilutisur </li></ol></li><li> Prenez 10 pi de 1: 500 dilution et compter sur hémocytomètre pour calculer le nombre de cellules. </li></ol></li><li> Préparer la solution de travail pour l&#39;activation des macrophages et opsonisants C. neoformans. <ol><li> Diluer LPS et IFN 100x de solutions d&#39;achat d&#39;actions en ajoutant 10 pi à 990 pi. REMARQUE: LPS et IFN sont utilisés pour améliorer l&#39;absorption phagocytaire, mais ne sont pas nécessaires pour la phagocytose. Se il ya un intérêt dans une activité fongicide des macrophages, effectuez activation O / N à 37 ° C avec agitation avant l&#39;infection. </li><li> Par exemple combiner 7,5 ul de LPS dilué, 1,25 ul de dilution IFNy, 1,25 pi d&#39;anticorps GXM et le volume du C. neoformans culture qui donne 1,25 x 10 5 cellules. Amener le volume à 250 pi multiplié par le nombre d&#39;échantillons avec du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% P / S. </li><li> Vortexer et incuber la solution pendant 20 min à 37 ° C avec agitation par secousses. REMARQUE:Cholestérol épuisement (étapes 1.2 à 1.4) peut se faire en même temps que l&#39;étape d&#39;opsonisation. Assurez-vous de traiter les macrophages avant de combiner la solution de travail, que les cellules opsonisées devraient être utilisés de manière optimale pas plus de 20 minutes après l&#39;étape d&#39;incubation 3.4.3. </li></ol></li><li> Infecter les macrophages <ol><li> Macrophages laver deux fois avec DMEM dépourvu de sérum et ajouter 200 pi de opsonisé C. neoformans solution de travail à chaque puits. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li></ol></li><li> Fixer et colorer les cellules <ol><li> Retirez le support et laver les cellules deux fois avec DMEM. </li><li> Air sécher la monocouche cellulaire pendant 10 minutes et ajouter 200 ul de glace methanol froid pour fixer les cellules. </li><li> Incuber pendant 15 min à température ambiante et retirez tout le méthanol restant. </li><li> Ajouter 200 pl de 10x Giemsa et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Laver 2-3 fois à l&#39;eau déminéralisée et O sec / N avec capuchon. NOTE: L&#39;imagerie peut être fait le lendemain ou jusqu&#39;à un followi de semainecoloration ng. </li></ol></li><li> Visualisez et le comte <ol><li> En utilisant un microscope, compter 300 cellules par point de données (se il ya deux du même traitement compter 150 par puits) et noter le nombre de macrophages infectés et le nombre de cellules Cryptococcus englouti. REMARQUE: Pour assurer même échantillonnage pour les données par l&#39;utilisation du point 2 plaques par condition, choisir trois zones non-chevauchement par plaque et compte 50 cellules par zone. </li><li> Calculer l&#39;indice phagocytaire en multipliant le pourcentage de macrophages infectés par le nombre moyen de C. neoformans par macrophage. Normaliser indice phagocytaire en exprimant les valeurs en pourcentage de la PBS 1x traitée contrôle. Après plusieurs essais calculer la valeur moyenne et l&#39;écart type de la moyenne pour déterminer les tendances de l&#39;indice phagocytaire. Utilisez test t de Student pour déterminer la signification. </li><li> Prenez micrographies de cellules à 1,000X ou grossissement de 400X. </li></ol></li></ol> 4. Composition bleu Trypan <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, les graines 10 6 cellules de type macrophage par puits sur une 6 puits plaque de culture de cellules dans un volume de 5 ml de milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine . Incuber à 37 ° C, 5% CO 2 H / N. </li><li> Appauvrissent macrophages de cholestérol en suivant les étapes 1.2 à 1.4 en remplaçant 2 ml pour 200 pi le cas échéant pour tenir compte de la taille de bien plus grande. REMARQUE: Assurez-vous d&#39;inclure un témoin traité avec 1x PBS ainsi que un contrôle qui est grattée avant tout traitement. </li><li> Ajouter 500 ul de 1 x PBS à chaque puits et gratter doucement les cellules avec un grattoir à cellules. Transférer dans un tube de micro et de suspendre les cellules par pipetage doucement monter et descendre. </li><li> Retirer 10 pi de cellules et tache avec 1 pl de 4% bleu Trypan. </li><li> Compter les cellules sur un hémocytomètre et calculer la viabilité utilisant l&#39;équation suivante:% viabilité = [1 - (cellules bleues / cellules totales)]x 100. Les valeurs Normaliser sur le contrôle qui n&#39;a pas été traitée. Après plusieurs essais calculer la valeur moyenne et l&#39;écart type pour déterminer les tendances de la viabilité. Utilisez test t de Student pour déterminer la signification. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

En travaillant avec ce protocole, il est important d&#39;obtenir le nombre de cellules précises lors du placage des cellules de mammifères et opsonisants C. cellules neoformans. Ceci minimise la variation entre essais et assure une précision de 1: une cible de rapport d&#39;effecteur tout au long de l&#39;étude. Il est également essentiel pour coordonner la synchronisation de l&#39;épuisement du cholestérol et de prévenir l&#39;infection des cellules de levure ou des cellules opsonisées de macrophages ...

La phagocytose est un processus par lequel les entités extracellulaires sont internalisées par des cellules hôtes. Ce est une arme essentielle dans l&#39;arsenal du système immunitaire à se défendre contre les agents pathogènes, mais le processus peut souvent être subverti par des agents pathogènes pour permettre l&#39;internalisation et la diffusion dans tout le corps 1. La phagocytose est médiée par plusieurs événements de signalisation qui se traduisent par l&#39;attachement et l&#39;engloutissement par des réarrangements de cytosquelette de la cellule hôte. Phagocytes «professionnel» sont capables de reconnaître et de se lier à opsonines sur la surface de l&#39;agent pathogène envahisseur signaler pour la fixation et la formation de lamellipodes, qui engloutissent l&#39;agent pathogène et former un phagosome 2. Parmi les phagocytes dits «professionnels» sont des macrophages. Les macrophages sont des cellules hautement spécialisées qui exercent des fonctions de protection qui incluent la recherche et l&#39;élimination des agents pathogènes causant, réparation des tissus endommagés, et médiation de l&#39;inflammation, la plupart desceux-ci par le processus de phagocytose 1,2. Cryptococcus neoformans est une espèce de levure pathogène qui provoque une maladie grave appelée cryptococcose. spores de Cryptococcus sont inhalées par l&#39;hôte et entraîner une infection pulmonaire qui est généralement asymptomatique. On pense que l&#39;exposition est extrêmement répandue; un échantillon de 61 enfants des maladies infectieuses pédiatriques Clinique du Centre Hospitalier Bronx-Liban a constaté que toutes les personnes interrogées avaient des anticorps à la glucuronoxylomannan de polysaccharide cryptococcose et d&#39;autres études ont montré la prévalence dans les deux virus de l&#39;immunodéficience humaine (VIH) non infecté et les adultes infectés 3, 4. Les macrophages alvéolaires sont la première ligne de la réponse à l&#39;infection pulmonaire et dans la plupart des cas avec succès clairement l&#39;agent pathogène. Cependant, chez les sujets immunodéprimés (patients, par exemple, le VIH et le sida) la levure est capable de survivre dans les macrophages. Dans ceux-cicas, les macrophages peuvent servir un créneau pour la réplication de l&#39;agent pathogène et peuvent faciliter la diffusion du système nerveux central (SNC) où la maladie devient mortelle 5-8. On pense que les macrophages peuvent même livrer la levure directement dans les méninges, aider la levure de traverser la barrière hémato-encéphalique via le modèle de «cheval de Troie» 3,9 - 11. Ainsi, il est important de comprendre le processus de phagocytose et les facteurs qui l&#39;affectent, en particulier dans cryptococcoses. Les travaux antérieurs dans d&#39;autres systèmes de pathogènes pointer vers cholestérol et de lipides radeaux formés par le cholestérol comme ayant un rôle important à jouer dans la phagocytose 12-15. Le cholestérol est espèces de lipides les plus abondants dans les cellules de mammifère et comprend de 25 à 50% de la membrane 16 cellulaire de mammifère. Il a été trouvé à jouer un rôle dans la modulation de la BIOPPHYSIQUE propriétés des membranes en changeant leur rigidité 17. Le cholestérol et sphingolipides forment ensemble microdomaines lipidiques dans la membrane connu comme radeaux lipidiques. Les radeaux lipidiques ont été trouvés à être impliqué dans la formation des cavéoles, ainsi que de fournir un domaine isolé pour certains types de signalisation 16-18. En raison de leur petite taille, il est difficile d&#39;étudier les radeaux lipidiques in vivo. Une façon utile d&#39;étudier le rôle des radeaux lipidiques est de modifier leurs électeurs. Méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est un composé qui a été trouvé pour réduire le cholestérol des membranes de mammifère et est couramment utilisé pour étudier le rôle des radeaux lipidiques 18. Dans ce protocole, on présente un procédé pour réduire le cholestérol des membranes de cellules hôtes et de quantifier l&#39;effet de l&#39;épuisement de la capacité des cellules hôtes à phagocyter C. neoformans in vitro. Cette procédure fait appel à des cultures de cellules techniqUES sur un macrophage immortalisé comme la ligne cellulaire (J774A.1) comme un modèle pour l&#39;infection. Cholestérol épuisement a été accomplie par exposition à MβCD, qui a un coeur hydrophobe spécifique à la taille de stérols et est capable d&#39;agir comme un puits pour le cholestérol de tirer hors de la membrane 19. Le cholestérol a été mesurée quantitativement épuisement en utilisant un kit disponible dans le commerce et qualitativement en utilisant une extraction lipidique Bligh-Dyer modifié suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) 20. . La phagocytose a été mesurée en infectant la lignée cellulaire avec une culture de levure opsonisé mélangé avec un cocktail d&#39;interféron-γ et le lipopolysaccharide d&#39;activation des macrophages a été Cryptococcus opsonisé en utilisant un anticorps glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. La coloration et des expériences de microscopie permis pour la visualisation des cellules et le calcul de l&#39;indice phagocytaire pour évaluer le degré de phagocytose. Pris dans leur ensemble, ce protocole dEscribes une méthode de base qui intègre la modification de la composition lipidique avec un processus physiologique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Class II type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td style="width:120px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">3460009</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">J774A.1 cell line</td>
			<td style="width:120px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:167px;">Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082-147</td>
			<td style="width:167px;">Keep frozen at -20 &#176;C and thaw before adding to DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;">Used to suplement DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Cell culture incubator</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # 3530</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well culture dish</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Methyl-&#946;-Cyclodextrin</td>
			<td style="width:120px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">C4555-10G</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:120px;">Labline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12216</td>
			<td style="width:167px;">All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Black Assay plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FilterMax microplate reader</td>
			<td style="width:120px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model F5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TLC Chamber</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z126195-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650498-4L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34860-2L-R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TLC Paper</td>
			<td style="width:120px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">3030917</td>
			<td style="width:167px;">Cut down to size needed for TLC tank</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6-Well Plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1490</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:120px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model Alegra x-30R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Votex Mixer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-812</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balance</td>
			<td style="width:120px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # MS104S Meaures down to .1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:120px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:120px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">700000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # SPD2010&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petroleum Ether</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E139-1&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">309966&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td>
			<td style="width:120px;">Analytical Chromatograhy Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1.11845.0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodine Chips</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">376558-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Manganese Chloride</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">244589</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UVP EC3 Imaging System</td>
			<td style="width:120px;">Ultra-Violet Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Bottom Confocal Dish</td>
			<td style="width:120px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-10C</td>
			<td>www.glassbottomdishes.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cryptococcus neoformans (H99)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Obtained from Duke University Medical Center</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">YNB</td>
			<td style="width:120px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">239210</td>
			<td style="width:167px;">See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4391-1MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Interferon gamma</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I4777</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Gift from Arturo Casadevall&#39;s Lab concentration is 1.98 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Giemsa</td>
			<td style="width:120px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194591</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 &#176;C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:120px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

Cryptococcose est une infection mortelle provoquée par des champignons pathogènes du genre Cryptococcus. L&#39;infection se produit lors de l&#39;inhalation de spores, qui sont capables de se répliquer dans le poumon profond. Phagocytose par les macrophages de Cryptococcus est l&#39;un des moyens que la maladie est capable de se propager dans le système nerveux central pour provoquer une méningo-encéphalite mortelle. Par conséquent, l&#39;étude de l&#39;association entre Cryptococcus et macrophages est important de comprendre la progression de l&#39;infection. La présente étude décrit un protocole étape par étape pour étudier macrophages infectiosité par C. neoformans in vitro. En utilisant ce protocole, le rôle des stérols d&#39;accueil sur les interactions hôte-pathogène est étudiée. Différentes concentrations de méthyl - cyclodextrine (MCD) ont été utilisés pour épuiser le cholestérol du réticulum sarcome murin macrophage lignée cellulaire J774A.1. Cholestérol appauvrissement a été confirmée et quantifiée en utilisant à la fois un stock pour le commercee kit cholestérol quantification et chromatographie sur couche mince. cellules de cholestérol appauvri ont été activés à l&#39;aide Lipopolysacharide (LPS) et l&#39;interféron gamma (IFN) et infectés par Cryptococcus neoformans anticorps opsonisé cellules H99 de type sauvage à un rapport effecteur à cible de 1: 1. Les cellules infectées ont été surveillées après 2 h d&#39;incubation avec C. neoformans et leur indice de phagocytose a été calculé. Cholestérol épuisement a entraîné une réduction significative de l&#39;indice phagocytaire. Les protocoles présentés offrent un moyen commode pour imiter l&#39;initiation du processus d&#39;infection dans un environnement de laboratoire et d&#39;étudier le rôle de la composition lipidique de l&#39;hôte dans l&#39;infectivité.

Cholestérol épuisement Analyse du surnageant réservée à l&#39;étape 1.3 du protocole en suivant les instructions du fabricant dans le kit de dosage du cholestérol Amplex Rouge donne une concentration élevée de cholestérol dans l&#39;échantillon MβCD traité par rapport au contrôle PBS 1x. Selon le type de cellule et de la concentration utilisée MβCD cholestérol épuisement peut varier. Pour J774 traité avec 10 mM MβCD, un appauvrissement d&#39;environ 50% a été observée. L&...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K vues.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Vidéo: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

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Immunologie et infection

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

L&#39;épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

L&#39;effet synergique de la lumière visible et sur Gentamycin<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismes

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilisation de Click Chemistry pour mesurer l&#39;effet de l&#39;infection virale sur Host-Cell Synthèse des ARN

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisation non-lytique exocytose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; À partir de macrophages au moyen de Digital microscopie optique

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Haut Débit Fluorometric Technique pour l&#39;évaluation de phagocytose des macrophages et l&#39;actine polymérisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformation biolistique d&#39;un fluorescent Tagged Gene dans la opportuniste pathogène fongique<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

ARN Purification de Intracellulairement Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Dans les cellules macrophages

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters : Mesure du diamètre de la Capsule à Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...