This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF.&#160;We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.

<ol>
	<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system.">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development.">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons.">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes.">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).</li><li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1/2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro.">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li><li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation.">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle.">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li><li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination.">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li><li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model.">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li></ol>

The authors declare that there is no conflict of interest regarding this research.

La myélinisation des axones est un processus crucial pour le fonctionnement optimal des deux systèmes nerveux central et périphérique de vertébrés. La génération et la maintenance des axones myélinisés est un processus complexe et coordonnée impliquant des interactions moléculaires entre neuronale, gliale (à partir de cellules de Schwann ou oligodendrocytes) et protéines de la matrice extra-cellulaire. L&#39;importance et l&#39;applicabilité de ce protocole est qu&#39;il permet la manipulation des protéi...

La myélinisation des axones est crucial pour la transmission rapide et efficace des potentiels d&#39;action dans les deux les systèmes nerveux central et périphérique. Des cellules spécialisées, les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique et les oligodendrocytes dans le système nerveux central, se enroulent autour des axones et ensheathe dans la myéline, efficace isolantes du nerf et de faciliter la conduction saltatoire 1. Le procédé de la myélinisation peut être étudiée in vitro en utilisant des neurones ganglionnaires de la rétine, 2 nanofibres par génie 3, ou neurones ganglionnaires de la racine dorsale co-cultivées avec des cellules de Schwann ou des oligodendrocytes 4 7.5. Le dosage in vitro de la myélinisation est un modèle établi pour l&#39;étude du système nerveux myélinisation et il reproduit la plupart des processus fondamentaux qui se produisent pendant la myélinisation in vivo 5-8. Le test implique la co-culture des populations purifiées de ganglions de racine dorsale (DRG) neurones, avec OPC (CNS myélinisation) ou des cellules de Schwann (PNS pour la myélinisation). Dans des conditions spécifiques de ces cellules myélinisantes ensheathe axones DRG dans l&#39;ordre, structurellement vérifié, feuille multi-lamellaire ultra de la membrane plasmique qui expriment la même complément de protéines spécifiques de la myéline présents in vivo isolant. Le modèle de cellule la plus couramment utilisée de l&#39;étude de myélinisation du SNC in vitro est le co-cultures de neurones DRG et OPC, qui ont été utilisés avec succès pour étudier l&#39;effet que des facteurs exogènes tels que les neurotrophines exercent sur ​​myélinisation du SNC in vitro 5,6. Les facteurs exogènes tels que les facteurs de croissance ou de petites molécules inhibiteurs pharmacologiques ont été largement utilisés pour étudier le rôle des voies de signalisation dans la myélinisation utilisant le DRG-OPC modèle de co-culture 7,9. Cependant, dans les paramètres de co-culture mixte contenant à la fois des neurones et des oligodendrocytes, il est resté formellement possible que soit les facteurs de croissance ou du pharinhibiteurs macologique auraient exercé des effets à la fois les neurones et les oligodendrocytes (OL) DRG. Cela offre la possibilité de disséquer spécifiquement les rôles que les protéines exprimées uniquement par DRG ou oligodendroglie exerce sur la myélinisation utilisant ce système cellulaire double. Pour confirmer sans équivoque que la voie de signalisation dans oligodendrogliale régule directement la myélinisation, transduction lentiviral des OPC, avant le semis sur les neurones de DRG pour le dosage in vitro de la myélinisation, se est avéré être une manière élégante de surexpression de type sauvage et les protéines mutantes, ainsi comme knockdown expression des protéines exprimées de manière constitutive par les oligodendrocytes. Ainsi, cette approche offre une avenue pour interroger et manipuler spécifiquement les voies de signalisation au sein oligodendrocytes pour étudier la myélinisation 9,10. Dans cet article, nous présentons les méthodes que nous avons développées pour surexprimer une protéine d&#39;intérêt dans les oligodendrocytes sélective via un lentivirusapproche pour étudier la myélinisation in vitro. La technique commence avec la génération de vecteurs d&#39;expression contenant le gène d&#39;intérêt, que ce soit dans un type sauvage, forme négative constitutivement active ou dominant qui sont ensuite ensuite clone dans le vecteur pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Ce vecteur (contenant le gène d&#39;intérêt), le donneur CMV promoteur (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) et le lentivecteur de 2K7 sont combinés dans une réaction enzymatique pour produire un vecteur de 2K7 contenant le promoteur CMV, le gène d&#39;intérêt, un site interne d&#39;entrée des ribosomes et la GFP (Figure 1). Cette passerelle clone construction d&#39;2K7 combiné avec l&#39;enveloppe du virus PMD2.G et le paquet de virus pBR8.91 peut être co-transfecté dans des cellules HEK293T pour générer lentivirus qui peut ensuite être utilisé pour transduire des OPC. Une fois infectés par le lentivirus les OPC expriment un niveau élevé de la protéine d&#39;intérêt. Ces OPC peuvent ensuite être ensemencées sur les cultures de neurones DRG et l&#39;effet que l&#39;expressionles niveaux des élevés de la protéine désirée exerce sur la myélinisation peut être interrogé. Les co-cultures sont évaluées pour l&#39;expression de la protéine de myéline par analyse Western blot et visualisés pour la formation de segments axonales myélinisées par immunocytochimie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Item</td>
			<td style="width:148px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:99px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2K7 lentivector&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Suter9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115545205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies&#160;</td>
			<td>5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF (Human)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>PT450021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin (d-Biotin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6916-500ML&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CNTF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAKO fluoresence mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-375KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14155063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Entry vectors for promoter and gene of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generate as per protocols 1-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose (D-glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>GL010-500M</td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115005003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgM&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115005020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112005167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Igepal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3021-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6634&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB-Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine- 200mM (100X) liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12538-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, NEAA, no Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10370088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse &#945; &#946;III Tubulin&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse &#945;MBP (monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBuffer 4</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (mouse)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>N-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NT-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O1 antibody - Mouse anti-O1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB344</td>
			<td>Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O1 hybridoma cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O4 antibody - Mouse anti-O4</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td>Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O4 hybridoma cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot Stbl competent cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7373-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain Suspension</td>
			<td>Worthington/Cooper</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">pBR8.91</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Denham10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDGF-AA (Human)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>PT10013A500&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin- Streptomycin 100X solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pENTRY4IRES2GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11818-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylenimine (PEI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor tablet (Complete mini)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplied with Clonase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrescine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit &#945; neurofilament</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1987&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit &#945;MBP (polyclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ran2 hybridoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-119</td>
			<td>Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti CD140A/PDGFRa antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplied with competent bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium selenite&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spe I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer pH8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TNE lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace Elements B</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>99-175-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferrin (apo-Transferrin human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109878001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1</td>
			<td>Vector laboratories&#160;</td>
			<td>L-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and use of lentivirus to selectively transduce primary oligodendrocyte precursor cells for in vitro myelination assays

La myélinisation est un processus complexe qui implique à la fois les neurones et la myéline formant des cellules gliales, les oligodendrocytes dans le système nerveux central (SNC) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (SNP). Nous utilisons un test in vitro de la myélinisation, un modèle établi pour étudier myélinisation du SNC in vitro. Pour ce faire, les cellules précurseurs d&#39;oligodendrocytes (OPC) sont ajoutés aux primaires rongeurs ganglion de racine dorsale (DRG) neurones purifiés pour former des co-cultures myélinisantes. Pour interroger spécifiquement les rôles que les protéines exprimées par les oligodendrocytes particuliers exercent sur la myélinisation nous avons développé des protocoles qui transduction sélective OPC à l&#39;aide du lentivirus surexprimant type sauvage, les protéines négatives dominantes ou constitutivement active avant d&#39;être ensemencées sur les neurones DRG. Cela nous permet d&#39;interroger spécifiquement les rôles de ces protéines dans la régulation oligodendrogliales myélinisation. Les protocoles peuvent également être appliqués dans l&#39;étude des OTses types cellulaires, offrant ainsi une approche qui permet la manipulation sélective des protéines exprimées par un type cellulaire souhaité, tels que les oligodendrocytes ciblée pour l&#39;étude de la signalisation et des mécanismes de compensation. En conclusion, combinant le dosage de la myélinisation in vitro avec lentiviraux infectés OPC fournit un outil stratégique pour l&#39;analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans la myélinisation.

Le drapeau marqués kinase 1 (Flag-Erk1) liés signal construction utilisé pour la production lentivirus est vérifiée par l&#39;enzyme de restriction digérer des constructions utilisées, y compris les constructions d&#39;2K7 et les emballages et accessoires constructions nécessaires à la production de virus extracellulaire (figure 3) . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg" /> Figure 3:...

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour<em&gt; In Vitro</em&gt; Les dosages de la myélinisation

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

14.4K vues.  The University of Melbourne. Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.