L’objectif global de cette technique est l’évaluation de l’effet des manipulations d’expression génétique sur l’architecture neuronale corticale in vivo. Notre premier avantage clé de cette procédure par rapport à ceux basés sur une électroporation neutre, est le contrôle fin des niveaux d’expression des gènes. Plus précisément, ce pipeline intégré permet l’évaluation in vivo du défaut, exalté par de petits changements dans l’expression des gènes sur le contrôle de la cytoarchitecture neuronale.
En outre, la structure de paire du test de transplantation permet une réduction énorme du nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. La technique tire parti d’un bassin précurseur provenant d’embryons transgéniques Tau EGFP. Ce pool est subdivisé en deux sous-piscines qui sont alternativement infectées par deux mélanges lentiviraux.
Pour obtenir une piscine d’essai verte et un pool de contrôle jaune qui sera co-injecté. Après deux jours d’expansion in vitro, les sphères neuro résultantes sont dissociées, mélangées une à une, et injectées avec un capillaire dans l’espace ventriculaire de souris. Dix jours plus tard, l’immunofluorescence sur les sections coronaires est effectuée pour permettre la comparaison entre les neurones d’essai et de contrôle.
Enfin, les sections immunotachées sont imaged et squelettées pour l’évaluation finale des paramètres morphométriques. Avant la transplantation in vivo, préparer la piscine verte précurseur. Les embryons E12.5, récoltés à partir d’une mère enceinte précédemment agenquée à un fondateur de Tau EGFP, sont mis dans des puits individuels d’une plaque multi-puits dans la solution PBS.
Génotypez-les rapidement par inspection visuelle sous une lampe à lumière bleue. Dissocier les cortices verts disséqués en cellules individuelles. Re-suspendre les cellules dans le milieu proliférant, et les subdiviser en deux sous-pools de taille égale.
Infecter chaque sous-piscine avec un mélange de lentiviral dédié. Chaque mélange contient le virus rouge d’étiquette ou le virus noir de commande. Ainsi que les virus pour tet-off conduit transgène ou l’expression de contrôle, respectivement.
Chaque lentivirus doit être administré à la multiplicité de l’infection de 8. Plaquez les cellules infectées dans le milieu proliférant avec 2 microgrammes par millilitre de doxycycline. Transférer les cellules à l’incubateur et les laisser pendant 2 jours à 37 degrés.
Après 2 jours, les deux sous-piscines doivent apparaître comme des suspensions de petites neurosphères. Exprimant homogènement la protéine fluorescente rouge, ou non. Après l’ingénierie des précurseurs, établissez un tableau d’évaluation pour la transplantation chez les chiots de laboratoire blancs P0.
Utilisez les capillaires en verre borosilicate avec un diamètre éternel et interne égal à 1,5 millimètre et 1,12 millimètres, respectivement. Tirez le capillaire avec un pull P1000. Tout d’abord, entrez dans le programme de traction.
Deuxièmement, placez le capillaire dans les porte-porte et serrez-les. Troisièmement, commencer le programme et prendre les deux microcapillaires tirés. Couper la pointe capillaire, à la main avec un scalpel, sous le stéréomicroscope pour obtenir une pointe avec un diamètre externe de 200-250 micromètres.
Enfin, placez les capillaires sur le support en plasticine dans une boîte de Pétri fermée, et transférez-le sous le capot. Désinfectez les fibres optiques et placez-les sous le capot. Mélangez les mélanges maître EGTA et Fast Green, pour préparer la solution de traceur cellulaire, et placez-la à nouveau sous le capot.
Couper de petits morceaux de film d’étanchéité de laboratoire pour repérer la suspension cellulaire. Enfin, préparez une solution de 1 milligramme par millilitre de doxycycline stérile disposée dans une seringue de 0,3 millilitre. Le tube d’injection est préparé à partir de deux tubes de latex.
Fixer un morceau de bouche en plastique dur à une extrémité d’un tube de latex. Ensuite, fixez le support capillaire à une extrémité de l’autre tube de latex. Connectez les extrémités libres des deux tubes de latex à partir d’un filtre stérile de 0,45 micromètre, comme barrière contre les germes de l’opérateur.
Placez l’assemblage du tube aspirateur qui en résulte sur un support en plasticine à garder sous le capot. Recueillir, tester et contrôler les neurosphères dans des tubes séparés. Centrifugeuse suspensions neurosphère et remplacer le supernatant par PBS.
Répétez cette séquence deux fois de plus. Suspensions de neurosphère de centrifugeuse, remplacent le supernatant par la solution de trypsine, et pipette la pastille de cellules de haut en bas, 4, 5 fois. Laissez les cellules dans l’incubateur pendant cinq minutes pour obtenir une suspension à cellule unique.
Bloquer la trypsine avec la solution inhibiteur de la trypsine. Cellules centrifugeuses, et les suspendre à nouveau dans un milieu proliférant frais. Comptez les cellules des deux piscines et ajustez leur concentration à 100 000 cellules par microlitre, dans un milieu proliférant.
Ensuite, mélangez les cellules d’essai et de contrôle 1:1 et vérifiez le mélange qui en résulte au microscope à fluorescence. Enfin, placez le mélange sur la glace sous le capot. Préparer la cage avec la mère et les chiots sur une table loin de la zone d’opérateur chirurgical.
Placez une cage de récupération sur un chariot. Placez un mélange de sciure de bois prélevé dans la cage de la mère sur son fond et placez la cage de récupération sous une lampe. De côté, mettre une glaciation recouverte d’une feuille d’aluminium pour l’anesthésie des chiots P0.
Juste avant la transplantation, ajouter un volume de 1 à 10 volume de solution de traceur cellulaire à un volume de suspension cellulaire, et repérer trois microlitres du mélange résultant sur un morceau de film d’étanchéité de laboratoire. Placez le chiot sur le papier d’aluminium frais pendant une minute, et vérifiez qu’il est entièrement anesthésié. Pendant ce temps, aspirer les 3 microlitres de mélange d’injection dans le verre capillaire.
Essuyer délicatement la tête du chiot anesthésié avec 70 % d’éthanol. Ensuite, localisez-le sur la fibre optique, pour identifier clairement les hémisphères corticals. Entrez le capillaire à l’avant et accédez à la cavité ventriculaire.
Tout en faisant cela, faites attention à ne pas endommager les vaisseaux sanguins. Pour éviter les dommages causés par l’éminence ganglionnaire, faites pivoter l’aiguille latéralement de trente degrés. Injectez doucement les cellules dans la cavité et surveillez leur diffusion au moyen de Fast Green.
Attendez cinq à dix secondes. Retirez l’aiguille en verre, en prenant soin de ne pas aspirer la suspension cellulaire et jetez-la dans un bac d’élimination approprié. Avant le rétablissement de chiot de l’anesthésie, injectez 150 microlitres de solution doxy intraperitoneally, pour maintenir l’expression transgénique encore éteinte après la transplantation.
Après l’injection, placez les chiots immédiatement sous la lampe pour la récupération. Laissez les chiots là pendant cinq à dix minutes, et une fois qu’ils sont complètement éveillés, placez-les dans la cage avec la mère. Observez les chiots opérés pendant deux à trois heures, pour s’assurer que la mère les accepte.
Fournir à la cage de l’eau potable contenant de la doxycycline et du saccharose de 0,5 mg/mL, afin de maintenir l’expression transgénique. Remplacer la doxycycline contenant de l’eau par de l’eau sans quatre jours après la transplantation. Activant ainsi le transgénique dans les neurones postmitotic.
Gardez les souris dans un régime sansoxy pendant six jours, et euthanasiez-les à P10. Fixer le cerveau des chiots euthanasiés dans 4%PFA, à quatre degrés, pendant la nuit. Retirez la solution PFA et remplacez-la par une solution de saccharose à 30 %.
Laissez le cerveau à quatre degrés jusqu’à ce qu’ils descendent vers le fond du flacon. Transférer les cerveaux dans un moule d’intégration jetable environ la moitié rempli de cryo-inclusion moyen. Congeler le cerveau inclus à 80 degrés.
Couper 60 microns de sections coronal épaisses à l’aide d’un cryostat. Les sections de processus pour l’anti-GFP, l’immunofluorescence anti-DP et les contre-taches avec la solution DAPI. Définissez les paramètres de fonctionnement du microscope confocal de manière appropriée, comme indiqué.
Recueillir des photos de tranches immunoassayed, en sélectionnant GFP positif neurone riche champs photographiques aveugles de la distribution du signal DP. Exportez les images sous forme de fichiers ND2 et générez des projections z maximales d’entre elles sous forme de fichiers TIFF. Pour permettre la squelettisation neuronale ultérieure aveugle du génotype cellulaire, cachez le signal rouge.
Pour ce faire, ajoutez une couche d’ajustement. Sélectionnez les niveaux, sélectionnez rouge. Réglez la sortie à zéro.
Et enregistrer le fichier en tant que tel. La skeletonisation est ensuite effectuée par un nouvel opérateur, qui n’avait pas auparavant accès aux fichiers rouges ordinaires originaux. Pour chaque fichier rouge caché, ouvrez le fichier, ajoutez une couche de dessin à l’image principale et sélectionnez l’outil crayon.
Tracez le somer sur la base du signal GFP. Puis, tracez les neurites. Enfin, enregistrez le fichier mutlilayer, y compris les silhouettes neuronales.
L’analyse ultérieure des squelettes neuronaux peut être effectuée par l’un ou l’autre opérateur. Ouvrez chaque fichier mulitlayer, créez de nouveaux fichiers gris vides de 16 bits avec fond noir. Un par neurone.
Copiez et coller des silhouettes neuronales simples, de l’image primaire aux fichiers à échelle grise. Revenez au fichier multicouche et éteignez la couche d’ajustement pour dévoiler les génotypes neuronaux. Enregistrez les fichiers gris 16 bits, en annotant les génotypes neuronaux correspondants.
Importer des images à échelle grise dans ImageJ une par une, et analyser les squelettes par NeurphologyJ plugin. Recueillir des données primaires neurophologyJ sélectionnées, une superficie totale de longueur de neurite, des points de fixation et des points d’extrémité, dans une feuille de calcul, et les utiliser pour calculer les paramètres morphométriques secondaires. Le protocole d’ingénierie que nous proposons permet de cotransduire la grande majorité des neurones sujets d’investigation, avec les ensembles transgènes prévus.
En outre, il permet d’atteindre une homogénéité substantielle des niveaux d’expression transgénique au sein de la population cellulaire transduced. Une caractéristique clé de notre procédure, c’est sa configuration jumelée. Un test et un pool de précurseurs de contrôle sont conçus séparément, mélangés 1:1, et finalement co-transplantés.
Cette approche jumelée facilitera la détection des différences de résultats spécifiquement liées à des génotypes distincts. Dans cet exemple, nous avons analysé des sections coronaires de chiots transplantés, dix jours après la co-injection intertriculaire des précurseurs et des précurseurs de neurones sur-exprimants de Foxg1 et des précurseurs de contrôle. Des images de groupes de neurones ont été acquises avec la microscopie confocale.
Les fichiers Z-stack ont été utilisés pour calculer des projections maximales. Des silhouettes neuronales ont été tracées manuellement. Ici, les silhouettes vertes et jaunes représentent foxg1 sur-exprimant et contrôler les neurones, respectivement.
Enfin, les paramètres primaires obtenus par l’analyse NeurphologyJ, ont été utilisés pour le calcul des indices morphométriques secondaires, comme illustré. Il s’agit d’un protocole simple qui permet au chercheur d’évaluer l’impact que l’expression mixte d’un gène donné, peut exercer sur le contrôle fin du développement de neuritearth in vivo. Les principaux avantages de ce protocole sont deux.
Le nombre existant de gènes impliqués dans la morphogenèse neuronale peut être fonctionnellement caractérisé in vivo, en l’absence des lignes tératogènes correspondantes. Et moins d’animaux sont nécessaires pour l’analyse pour obtenir les résultats statistiques significatifs.
