La plate-forme vectorielle lentivirale a un avantage majeur par rapport à la plate-forme vectorielle la plus populaire, en particulier en raison de la capacité des vecteurs lentiviraux à accueillir un insert génétique plus important. Ainsi, il semble que le vecteur lentiviral serait la plate-forme de choix dans l’application impliquent la livraison d’outils CRISPR/Cas. Cette technique imite le mécanisme réglementaire naturel de l’expression alpha-synucléine qui, lorsqu’elle est altérée, est associée à la maladie.
Il permet de peaufiner le niveau d’expression par rapport aux changements robustes dans l’expression des gènes. Je recommanderais fortement de valider cette approche ou d’autres approches similaires en utilisant plusieurs ARN guides pour le dépistage. Il y a une grande variabilité dans la puissance d’ARN de guide.
La seule façon de le déterminer est qu’il y ait un dépistage et une validation robustes et complets. Le système développé peut être facilement adapté à d’autres systèmes modèles tels que les modèles animaux, y compris les rongeurs et les primates non humains. Ces expériences de suivi pourraient servir de preuve de concept pour de futures études cliniques.
La Dre Ekaterina Ilich, membre du personnel supérieur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure de clonage moléculaire pour la création de plasmides vecteurs lentiviraux liés à ce projet. Elle démontrera également les étapes clés de la production de vecteurs lentiviraux. Le Dr Lidia Tagliafierro, postdoc de mon laboratoire qui se concentre sur la différenciation des cellules iPS humaines en cellules pathologiques pertinentes, démontrera également la procédure.
Elle démontrera les étapes clés de l’établissement d’analyses pour évaluer les profils de méthylation de synucléine intron1. Ahila Sriskanda, membre du personnel de mon laboratoire qui se concentre sur la culture des cellules progénitrices neurales dérivées des cellules iPS humaines. Pour commencer, développez le domaine catalytique DNMT3A à partir du d-Cas9-DNMT3A-GFP en amplifiant la partie DNMT3A du vecteur.
Après avoir digéré le fragment DNMT3A à l’aide d’une enzyme de restriction BamH1. Cloat il dans le site BamH1 du vecteur PBK-301 modifié portant d-Cas9 et vérifié par séquençage direct Sanger, pour remplacer le gène pur journaliste Meissen et le plasmide résultant avec GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A pure Meissen et plasmide avec FSC 1. Purifier le fragment vectoriel à l’aide d’une méthode de purification du gel.
Préparer l’insert en digérant PBK-201 avec FSC-1. Clonez le fragment FSC 1 dans le vecteur pour créer d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Enrober les plaques de 15 centimètres de 0,2% de gélatine pour la transfection et attendre 10 minutes.
Aspirez ensuite la gélatine et ajoutez 22,5 millilitres de milieu de glucose élevé et 2,5 millilitres de suspension cellulaire HEK-293T précédemment cultivé. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 jusqu’à atteindre 70 à 80% de confluence. Pour préparer le mélange plasmide suffisant pour 115 centimètres plaque utiliser les quatre plasmides décrits dans le manuscrit.
Ajouter 312,5 micro litres d’un chlorure de calcium molaire au même tube de 15 millilitres avec les plasmides et porter le volume final à 1,25 millilitres à l’aide d’eau distillée double stérile. ajouter délicatement 1,25 millilitres de deux X BBM solution goutte sage au tube tout en vortex. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Aspirez le milieu des cellules et ajoutez 22,5 millilitres de DMEM à haute teneur en glucose fraîchement préparé sans sérum. Ajouter 2,5 millilitres du mélange de transfection goutte sage à chaque assiette. Faites tourbillonner les plaques et couvez à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant deux à trois heures après l’incubation ajoutez 2,5 millilitres de sérum par plaque pour atteindre 10 % de dilution et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.
Pour récolter le virus recueillir le supernatant de toutes les cellules transfectées et les tirer dans des tubes coniques de 50 millilitres. Centrifugeuse à 400 à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante, puis filtrer le supernatant à travers l’unité de filtre à vide de 0,45 micromètre. Ensuite, créez un gradient saccharose en préparant des tubes coniques ultra centrifugation.
Ajoutez soigneusement le supernatant filtré au gradient en distribuant également le supernatant viral parmi chaque tube d’ultra centrifugation remplissant au moins les trois quarts de chaque tube. Centrifuger les échantillons à 70000 g pendant deux heures à 17 degrés Celsius. Recueillir doucement 30% à 60% fractions de saccharose dans des tubes propres ajouter froid 1X PBS jusqu’à 100 millilitres de volume total et pipette plusieurs fois à mélanger.
Ajouter soigneusement quatre millilitres de saccharose de 20% en 1X PBS à chaque tube pour stratifier la préparation virale continuer par pipetting environ 20 à 25 millilitres de la solution virale par tube. Équilibrez soigneusement les tubes, puis centrifugez à 70000 g pendant deux heures à 17 degrés Celsius. Aspirez soigneusement le liquide restant pour enlever complètement tout le liquide laissant le virus contenant des granulés qui sont à peine visibles comme de petites taches translucides.
Après avoir vidé le supernatant inverser les tubes sur du papier absorbant pour permettre au reste du liquide de s’écouler. Ajouter 70 micro litres de 1X PBS au premier tube et bien pipette pour suspendre à nouveau la pastille. Transférer la suspension dans le tube suivant et répéter avec le pipetage et le transfert jusqu’à ce que toutes les granulés soient re-suspendues.
Ajouter 50 micro litres supplémentaires de 1X PBS au premier tube et mélanger pour le laver. Ensuite, transférez la suspension dans le deuxième tube pour la laver et continuer à laver et à transférer comme précédemment, ce qui donne environ 120 micro litres de la suspension finale légèrement laiteuses. Centrifugeuse à 10000 g pendant 60 secondes pour obtenir une suspension claire transférer le supernatant à un nouveau tube et faire cinq micro litre aliquot et les stocker à 80 degrés Celsius négatifs placer un Cryovial avec MD NPC en bloc thermique de 37 degrés Celsius pendant deux minutes et transférer les cellules décongelées à un tube conique de 15 millilitres avec 10 millilitres de chaleur DMEM-F12.
Centrifugeuse à 300 g pendant cinq minutes. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules en deux millilitres de milieu N2B2 complet préchauffé. Ajouter deux millilitres de N2B27 à la suspension cellulaire et plaquer deux millilitres de cellules dans chaque puits de la plaque bmm précédemment préparée codée six puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pendant la nuit. Lorsque les PNJ md sont à 70% confluent, transduisez-les en ajoutant deux micro litres de vecteurs RNA d-Cas9-DNMT3A guident lentivirus et tourbillonnent doucement la plaque. Après avoir couver les cellules dans les mêmes conditions qu’auparavant pendant 16 heures remplacer le milieu N2B27 48 heures après la transduction.
Ajouter N2B27 avec cinq microgrammes par millilitre de Meissen pur pour obtenir les lignées stables md NPC, faire croître les cellules pendant trois semaines en N2B27 plus meissen pur pour caractériser le profil de méthylation de SNCA intron 1. D’abord extraire l’ADN de chaque lignée cellulaire transducteur stable à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN, puis utiliser 800 nanogrammes d’ADN pour effectuer une conversion de bisulfide avec un kit disponible dans le commerce, puis un adn converti en bisulfide en 20 nanogrammes par micro litre. Pour l’analyse pyro-séquençage préparer le mélange maître PCR dans un noyau tube libre transférer la plaque de réaction à un thermo-cycleur et démarrer le PCR.
Visualisez les amplicons à l’aide de deux micro litres de produit PCR avec une coloration de 30 et de bromure suite à l’électrophorésie du gel Agarose. Pour les analyses pyro-séquençant, on utilisait des mélanges d’adhérents non méthylés et méthylés par des ADN convertis au sulfide et des reagents pyro-séquençants tels que décrits dans le manuscrit. Calculer les valeurs de méthylation pour chaque site CPG à l’aide d’un logiciel de pyro-séquençage Les rendements physiques du vecteur Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP et du vecteur Naïf GFP généré à l’aide de ce protocole sont comparables.
Ceci suggère que l’utilité de l’épine dorsale vectorielle optimisée combinée avec le protocole de production optimisé a comme résultat des rendements élevés plus serrés des taux de transduction de vecteurs CRISPR-dCas9 du vecteur de Lentivirus d-Cas9-DNMT3 le vecteur de GFP était quatre fois inférieur à celui du vecteur naïf de GFP suggérant que l’efficacité d’empaquetage du CRISPR d-Cas9-ARN soit réduite. Les taux de transduction du vecteur Naïf PURO étaient cinq fois plus élevés que le vecteur d-Cas9-DNMT3A. Ces résultats ont été confirmés en utilisant le GFP naïf et d-Cas9-DNMT3A-GFP.
Le protocole basé sur eb décrit ici permet la différenciation des PNJ. hiPSCs exprimé marqueur de puissance de plaisir Oct4 tandis que le MD NPC est exprimé à la fois Nestin et FoxA2. Sept analyses pyro-séquençant ont été conçues et validées pour la quantification du statut de méthylation dans l’intron 1 de SNCA.
Les 7 analyses ont été validées et ont montré une corrélation linéaire, en utilisant les analyses validées, il a été possible de déterminer les niveaux de méthylation aux 23 CPG dans le SNCA intron 1 La chose la plus importante à retenir que d’assister à cette procédure est de travailler avec des cellules qui montrent une croissance et une santé adéquates pour assurer la cohérence entre les expériences. La production de vecteurs de lentilles mis en évidence dans cette présentation peut être facilement adoptée à la production d’intégrales déficientes anti-virus, il est également peut être facilement mis à l’échelle pour générer de plus grandes quantités ou des vecteurs plus concentrés. Cette technique peut ouvrir la voie à l’exploration de l’impact pathogène de la déréglementation des gènes sur les troubles liés à l’âge ni sur les troubles génératifs, y compris la maladie d’Alzheimer et les démences connexes.
L’avantage des vecteurs de lentilles se développent ici, c’est que ce n’est pas un danger ou non vecteurs de lentilles infectieuses n’ont qu’un effet minimal sur le cycle cellulaire, ils sont sûr et fiable plate-forme de livraison pour les applications de thérapie génique.
