Nous sommes reconnaissants à S. Thomas, qui a initié ce projet, J. Hermann et U. Burgbacher de l&#39;aide dans la construction de l&#39;installation de la FIM. Ce travail a été financé par la DFG (SFB 629 B6).

REMARQUE: Ici, l&#39;utilisation de la FIM est présenté pour l&#39;analyse pratique à haut débit de locomotion pour le dépistage des larves dans des conditions de libre-mobiles et sous l&#39;influence d&#39;un stimulus de chaleur. D&#39;autres applications telles que l&#39;analyse des stimuli olfactifs de locomotion à charge ou imagerie à haute résolution des comportements de roulement ou d&#39;autres pourraient avoir besoin des changements subtils au protocole, qui sont disponibles sur demande. 1. Mise en place d&#39;expériences <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilisez environ 100 larves par génotype au total (temps de 1 h requis) pour obtenir des valeurs statistiquement significatives. NOTE: Dans le cas où plusieurs génotypes doivent être comparés et enregistrés à des jours différents, enregistrer le même nombre de larves par génotype par jour. </li><li> Pour la plupart des applications, fiche à 10 Hz pour l&#39;analyse des paramètres. Pour des applications d&#39;imagerie à haute résolution, varier la vitesse de formation d&#39;image si nécessaire. </li><li> Pour le suivi des larves de troisième stade, mener des expériences environ 120 heures après la ponte. Assurez sure que les cultures donnent assez de larves dans la période expérimentale (voir 4.3). </li><li> Pour les applications non-relance, préparer une surface ramper contenant agar translucide (voir section 2). Pour contenir les larves dans la gamme de relance pour l&#39;application de gradient thermique, entourer le champ de vision d&#39;une barrière de gélose sel aversif (voir section 3). NOTE: D&#39;autres applications peuvent nécessiter différentes surfaces. </li><li> Veillez à utiliser une chambre avec des conditions constantes de l&#39;environnement (température, lumière, débit d&#39;air, humidité de l&#39;air, etc.). </li></ol> 2. Crawling Préparation de la surface (translucide Agar) NOTE: Dans la configuration FIM une surface agar est ajouté pour fournir une surface de ramper humide. En outre, il améliore également les propriétés d&#39;éclairage. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Faire bouillir l&#39;agar 0,8% de qualité alimentaire dans l&#39;eau ultra-pure déminéralisée. Pour l&#39;application de dépistage de préparer 400 ml. </li><li> Verser la gélose à 50 ° C (à chaud à la main) sur une séparée 33 cm x 33 cm acrylic plaque de verre. La tension de surface de la gélose et donc la température définira l&#39;épaisseur de la plaque de gélose. A 50 ° C, des plaques d&#39;agar 2 mm d&#39;épaisseur sont obtenues. Ne pas agiter après ébullition et versez constamment pour éviter les bulles. Préparer dalles agar frais pour chaque période d&#39;imagerie d&#39;environ 4 heures. </li><li> Remplir plats 6 cm de Pétri standard et la solution restante de la gélose à 0,8% pour trier, propre et habituer les larves avant l&#39;expérience (1 plat par génotype). </li><li> En cas une barrière agar aversif est nécessaire pour l&#39;application, passez à la section 3. </li><li> Coupez environ 2 cm du périmètre de la dalle agar pour obtenir une surface carrée de plan pour l&#39;enregistrement. Retirer l&#39;excès agar. NOTE: La taille dépend de l&#39;application. </li><li> Transférer la dalle agar à la configuration FIM directement après refroidissement en poussant doucement la gélose de glisse sur le bord de la plaque de verre acrylique. </li></ol> 3. Facultatif: Ajout d&#39;un aversif Agar barrière à l&#39;Crawling Surface (Sel Agar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Faire bouillir la gélose à 2,5% de qualité alimentaire avec 3 M de NaCl dans de l&#39;eau désionisée ultrapure. Pour le criblage dans un gradient thermique préparer 200 ml. NOTE: Le volume dépend de l&#39;application. </li><li> Coupez un 2 cm de large encoche dans la surface précédemment versé ramper entourant le champ de vision (22 x 22 cm). REMARQUE: les formes et les champs de vision barrière différents peuvent être nécessaires en fonction de l&#39;application. </li><li> Remplir l&#39;encoche avec l&#39;agar de sel 0,1-0,3 cm plus haut que la surface de suivi de piste. </li></ol> 4. Fly Manipulation <ol style="margin-left: 40px;"><li> Arrière va à 25 ° C incubateur avec de la lumière de 12 h cycle jour / nuit ajusté au temps de l&#39;expérience sur la nourriture à la mouche standard à 65% d&#39;humidité de l&#39;air. </li><li> Pour croix, anesthésier 30 mouches femelles vierges et huit hommes avec le CO 2 et les croiser dans 130 flacons de culture ml avec 35 ml alimentaire. REMARQUE: Un 130 ml flacon de culture avec 35 ml alimentaire donnera environ 20-30 lmangé troisième stade larvaire au sein de la durée de l&#39;imagerie de 4 heures. Imagerie et de suivi des travaux pour toutes les étapes de stade larvaire. </li><li> Déposer un peu d&#39;eau dans des flacons de culture de conduire troisième stade larvaire mouvement fin et de recueillir le plus grand larves des murs flacon à l&#39;aide d&#39;un petit pinceau. </li><li> 2-5 min avant l&#39;enregistrement, les larves de transfert pour une vidéo à une boîte de Petri contenant de la gélose 0,8% de qualité alimentaire dans l&#39;eau ultra pure déminéralisée se habituer et les nettoyer. </li></ol> 5. Réglage de la configuration FIM Imaging pour Recordings (non stimulation Conditions) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Réglez l&#39;appareil photo point de l&#39;objectif et l&#39;ouverture si nécessaire. Réglez le temps d&#39;exposition pour la caméra correspondante. REMARQUE: Ces paramètres ne ont pas besoin d&#39;être changé pendant une expérience. </li><li> Réglez l&#39;intensité d&#39;éclairage pour obtenir un bon contraste en imagerie une larve. </li><li> Gardez les conditions environnementales dans la constante de chambre pendant les enregistrements. Assombrir la pièce pour ne pas perturber les larves avec une lumière directionnelle. </li></ol> 6. Facultatif: Réglage de la configuration FIM Imaging pour Recordings (progressive de la température de stimulation Conditions) REMARQUE: Le dispositif de gradient thermique est un 3 cm plaque d&#39;aluminium 42 x 42 x 0,2 avec une peinture noir mat et matériau isolant sur ​​le site top. La plaque est perfusé avec de l&#39;eau à partir de deux circuits différents connectés à préparateurs / refroidisseurs et les pompes à deux extrémités (voir la figure 1B). Les températures peuvent être régulées de -5 à 50 ° C. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Allumer le gradient thermique dispositif 1 h avant les expériences et les placer au-dessus de l&#39;installation pour permettre l&#39;établissement du profil de température souhaité et les composants se équilibrer. </li><li> Transférer la gélose de surface rampant avec une barrière de sel à la configuration. </li><li> Placer la plaque de radiateur sur la gélose et ajuster l&#39;espacement entre la plaque et la surface à crémaillère à 2 mm (~ 1 mm au-dessus larves). </li><li> Établir un gradient linéaire deau moins 0,8 ° C / cm à partir de 34 ° C (env. 2 cm de l&#39;obstacle dans le champ de vision) à 18 ° C (env. 2 cm de la barrière opposé à l&#39;emplacement dans le champ de vision) en ajustant la température des circuits d&#39;eau à 1 ° C et 45 ° C. REMARQUE: Les différentes propriétés de gradient de la plaque de métal exigent des températures différentes qui doivent être déterminée de manière empirique. Ces paramètres ne ont pas besoin d&#39;être changé au cours des expériences. </li><li> Réglez les paramètres comme décrit dans l&#39;article 5. </li><li> Laisser la surface rampant se équilibrer dans le gradient avant les expériences pendant 20 min. Tester le gradient de température avec un pyromètre. </li><li> Procéder à l&#39;article 8. </li></ol> 7. Imaging FIM (non stimulation Conditions) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilisez un petit pinceau humide pour recueillir délicatement 15 larves des boîtes de Pétri d&#39;accoutumance et de les transférer au centre de la surface de suivi. Ne pas transférer alimentaire reste ou tropeau (voir 7.8). </li><li> Enregistrez 1-50 larves sur un x 22 cm zone de suivi de 22 cm. Utilisez 15 animaux par vidéo pour la plupart des applications de dépistage (pour des raisons statistiques utilisent au moins 100 personnes par génotype). </li><li> Séparez délicatement les larves et attendre environ 10-20 secondes jusqu&#39;à ce que toutes les larves ont commencé à passer directement avant l&#39;enregistrement. </li><li> Enregistrez la locomotion des larves pendant 2 min à 10 images par seconde pour des conditions de relance non. Utiliser des images non compressées tif que le format de sortie. </li><li> Pendant l&#39;enregistrement, recueillir des larves pour la prochaine vidéo à partir de flacons pour les habituer critique:. Ne pas déranger larves enregistré avec la lumière. </li><li> Après l&#39;enregistrement, retirer les larves avec un pinceau large et jetez-les conformément aux règles de sécurité et la législation locale. </li><li> Après avoir retiré les larves, utiliser le pinceau pour nettoyer et hydrater la surface de ramper avec de l&#39;eau déminéralisée ultra pur. </li><li> Critique: Garder la surface humide en tout temps, mais éviter mo excessiveisture, qui peut être considéré comme des halos ou des gouttes larves dans les enregistrements environnantes et de perturber le suivi. </li></ol> 8. Facultatif: Imagerie FIM (progressive Température relance Conditions) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Après le gradient de température est établie (voir la section 6), préparer le logiciel d&#39;enregistrement pour enregistrement instantané dans les 20 secondes après la mise larves sur la surface de ramper (voir 8.2), par exemple, définir le nombre d&#39;images par vidéo et définir le chemin d&#39;enregistrement. </li><li> Soulevez la plaque du radiateur légèrement et placez les larves à 33 ° C à 2 cm de la barrière de sel. Reportez-vous à 6. et 7. Pour de plus amples instructions générales. Abaissez la plaque de radiateur encore et commencer l&#39;enregistrement 3-4 min immédiatement après larves commencé à se déplacer tout droit. </li><li> Après l&#39;enregistrement, retirer les larves directement, propre et hydrater la surface. Ne touchez pas la gélose de sel pour éviter la propagation de NaCl. </li><li> Critique: Garder la surface humide en tout temps mais il faut éviterhumidité excessive, qui peut être considéré comme des halos ou des gouttes larves dans les enregistrements environnantes et de perturber le suivi. </li><li> Laisser la surface de la gélose se équilibrer à nouveau après l&#39;hydratation pendant 1-2 min, tout en économisant images et de recueillir de nouveaux animaux avant de préparer pour la vidéo suivante. Contrôler le gradient de température à l&#39;aide d&#39;un pyromètre tous les cinq vidéos et ajuster dispositif de température si nécessaire (température de l&#39;eau, la hauteur et l&#39;orientation xy par rapport à la surface de suivi). </li></ol> 9. Suivi des larves Locomotion NOTE: Pour plus de détails, consultez le manuel ci-joint pour FIMTrack (supplément). Pour un diagramme de flux de programme, voir la figure 2. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Réglez les paramètres de suivi pour les expériences respectives en utilisant l&#39;option de prévisualisation. <ol><li> Ajuster pixel par cm selon la caméra et champ de vision. </li><li> Réglez images par seconde en fonction des réglages de l&#39;appareil. </li><li> Ajuster les seuils de luminosité de sorte que eà tous les animaux sont détectés correctement (rétroaction est donnée dans l&#39;aperçu). </li><li> Ajustez la zone seuils larvaires de taille. Remarque l&#39;option de retour dans l&#39;aperçu: animaux simples sont surlignés en jaune, se heurtant larves sont mis en évidence en rouge et la zone de chaque animal est donnée en bleu. </li></ol></li><li> Commencer le suivi en utilisant le bouton en bas à droite. NOTE: Après un suivi avec succès, une image avec pistes larvaires et un fichier CSV contenant la locomotion et de la posture caractéristiques calculées sont stockées dans le répertoire des images. </li><li> Utiliser les résultats de la FIM module de visualisation (Modifier&gt; Résultats Viewer ...) d&#39;examiner et de régler manuellement les résultats de suivi. Si nécessaire, définir des régions de relance pour évaluer les données en ce qui concerne le régime de relance par exemple, ramper orientation en ce qui concerne le gradient de chaleur ou de la distance à une source odorante. Pour une description plus détaillée se il vous plaît utiliser le manuel (supplément). </li></ol> 10. Évaluation des données <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importer le fichier CSV dans Excel, Matlab ou tout autre programme pour plus d&#39;analyse statistique. </li></ol>

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Les auteurs ne ont rien à divulguer

En neurosciences comportementales, il est obligatoire de déchiffrer quantitativement traits comportementaux complexes. Procédures Ainsi, un grand nombre de personnes doivent être observées à haute résolution et automatisés sont nécessaires pour l&#39;analyse statistique. Ici, l&#39;imagerie FIM est décrit, un roman, une configuration simple et robuste imagerie, qui fournit les moyens de contrôler la locomotion d&#39;un large éventail d&#39;animaux. L&#39;efficacité de l&#39;installation d&#39;imagerie FIM a été testé en utilisant la drosophile larves, des vers plats planaires et C. vers elegans. La technologie FIM fournit intrinsèquement un contraste élevé pour détecter même des structures internes des animaux, tels que le cerveau, la trachée, l&#39;intestin ou le proventricule. Fait important, ces structures internes sont solidement identifiés de telle sorte qu&#39;ils peuvent servir à identifier automatiquement l&#39;orientation de l&#39;animal 19. La qualité des films peut être influencée par quantité excessive d&#39;eau sur la surface de ramper. Ainsi, il est essentiel decontrôler l&#39;humidité de l&#39;agar. Agar ou l&#39;eau trop trop vieux à la surface peut provoquer des artefacts. De même, veiller à ce que les bulles d&#39;air sont inclus dans la surface de ramper. En général, une surface agar bien préparé permet l&#39;enregistrement de films pendant 4 heures. En raison des principes physiques sous-jacents imagerie FIM génère près de bruit enregistrements d&#39;images libres, résultant dans une superbe qualité d&#39;image. Cela facilite à son tour subséquent analyse d&#39;image assistée par ordinateur et permet un débit élevé. Toutefois, la méthode est limitée à l&#39;analyse des animaux qui entrent en contact directement la surface de la gélose. Le logiciel de suivi est contestée par les animaux formant une forme de beignet. Bien qu&#39;un indicateur binaire reconnaît la forme de beignet, une mauvaise colonne vertébrale peut être calculée. Grâce à la construction modulaire de la table de suivi double et triple imagerie couleur est à portée de main. En outre, des stimuli additionnels (lumière, odorisants, les stimuli électriques ou mécaniques) peuvent être facilement delivered de dessus. Le programme FIMTrack conçu pour correspondre à la puissance de l&#39;imagerie FIM peut être facilement adopté pour suivre la drosophile larves, C. elegans ou planaires. Ainsi et en raison de sa construction simple et pas cher (voir http://FIM.uni-muenster.de), imagerie FIM est possible pour un large éventail d&#39;applications biomédicales et permet en particulier urgent études à haut débit.

La plupart des animaux ont la capacité de se déplacer d&#39;une manière très sophistiquée et contrôlée. Pour déchiffrer la base contrôle de la locomotion sous-jacente génétique, il est obligatoire d&#39;évaluer quantitativement différents comportements. A cet égard, la drosophile peut servir comme un modèle idéal. Suivi de voler librement drosophile est alléchant 1-4 mais ramper des larves de drosophile se produit en deux dimensions à une vitesse relativement faible et peut ainsi être contrôlé facilement. Configurations à base de caméras combinés avec un éclairage approprié sont utilisés pour acquérir des images 5. Tant incident ou la lumière transmise est utilisé dans les expériences comportementales 6,7. Cependant, dû à l&#39;organisme semi-translucide de larves et d&#39;éventuelles réflexions de la lumière de la surface ramper enregistrement fidèle des mouvements larvaires peut être difficile. Pour surmonter ces problèmes, certaines méthodes complexes ont été mis au point. Récemment, l&#39;illumination de champ sombre a été introduit pour améliorer l&#39;avant-plan / arrière-plan suiteRast 8. Comme une alternative à l&#39;enregistrement par caméra, l&#39;imagerie optique lentille de moins en image sans capteur sur puce techniques d&#39;acquisition ont été introduites 9-11. Plusieurs programmes de suivi ont été mis en place récemment, y compris les logiciels disponibles dans le commerce et 12 personnalisés solutions. Exemples de programmes de suivi à haut débit sont les Worm Tracker Multi (MWT) 13 et Multianimal démarche et Track (MAGAT) 8. Tous deux ont en commun, que plusieurs animaux peuvent être suivis en une seule arène en plein champ afin que les animaux entrant en collision conduisent à de nouvelles identités multiples animales. Pour surmonter cette limitation, une configuration multi-puits a été introduit séparant 12 animaux dans des puits individuels 14. La quantification précise de la locomotion des personnes seules peut être réalisé en utilisant une phase mobile de suivi en combinaison avec un microscope 15. Cependant, toutes ces approches sont soit inefficaces coût, le manque re suffisantesolution ou trop de temps pour la haute phénotypage de débit. FIM Pour surmonter les limitations mentionnées ci-dessus, nous avons développé (méthode d&#39;imagerie basée-FTIR) basée sur Frustré réflexion interne totale (FTIR) 16 (Figure 1). Cette nouvelle approche d&#39;imagerie fournit un contraste élevé sans précédent et permet même l&#39;enregistrement multi-couleur des animaux rampants 16. Le principe de cette méthode pratique et efficace est facile. Une plaque de verre acrylique est inondé de lumière (par exemple, 875 nm infrarouge). En raison de différents indices de réfraction du verre acrylique et de l&#39;air, la lumière est totalement réfléchie à la frontière verre / air. Pas de chauffage du verre acrylique est à noter 16. Seulement si les objets avec un indice de réfraction plus élevé touchent la table inondé de lumière, la lumière peut entrer ces objets. Si les animaux en contact avec la surface, la lumière est réfléchie et peut être saisie par le dessous (figure 1). En conséquence, seul le contactzone des animaux apparaît comme une tache lumineuse, qui permet l&#39;imagerie détaillée avec un fond noir globale. Ainsi, FIM-imagerie permet d&#39;enregistrer des films parfaits pour les algorithmes de vision par ordinateur. L&#39;utilisation simple et robuste de la FIM apporte maintenant une analyse détaillée à haut débit du comportement animal complexe en portée et peut être utilisé pour l&#39;étude de traitement de l&#39;information: par exemple, l&#39;olfaction 8, 16; vision 17 ou 18 thermosensation. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> Figure 1. configuration FIM intégration chaleur stimulus et principes physiques sous-jacents. (A) La configuration de la FIM. l&#39;intensité d&#39;éclairage peut être réglée sur le panneau avant. (B) Pour offrir un stimulus de chaleur, un noir peint plaque d&#39;aluminium, perfusé avec de l&#39;eau chaude et froide des deux côtés, est placé 2 mm au-dessus de la surface de la gélose quise est 2 mm d&#39;épaisseur. Le gradient est établie sur la plaque de rayonnement de chaleur et de la gélose par les différences de température (C) Le principe physique de la réflexion interne totale frustrée. Une plaque de verre acrylique est éclairé par une lumière infrarouge. θ 1, θ 2 et θ 3 indiquent les angles de réflexion de la lumière. n A, n 1, n 2 et n 3 représentent les indices de réfraction de l&#39;air, de verre acrylique, de l&#39;agar et la chenille, respectivement, et n satisfait à l&#39;inégalité A &lt;n 1 &lt;n 2 &lt;n 3. En raison de la réfraction, l&#39;angle de réflexion change pendant la transition. Si l&#39;angle est inférieur à l&#39;angle critique, la lumière ne se reflète pas plus, peut passer à travers les couches et peut être capturé par le bas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Le spectrum des processus qui peuvent être analysés par la FIM est large. Sans d&#39;autres ajustements, l&#39;imagerie FIM peut être utilisé pour surveiller tous les stades larvaires de la drosophile (figure 5B) ou peut être utilisé pour suivre les empreintes de la drosophile adulte 19. De même, les trajectoires de C. elegans ou la circulation des vers plats planaires peuvent être facilement enregistrés (figure 5C). Même l&#39;analyse de la croissance des hyphes ou les cheveux de la racine fongique semble réalisable 19. Dans notre configuration actuelle FIM, 4 x 16 diodes électroluminescentes infrarouges (IR LED) sont intégrés dans un cm 2 plaque 32 x 32 en verre acrylique, appelé le tableau de suivi (Figure 1). L&#39;intensité de la DEL IR est ajustée en fonction du poids des objets sur la table de suivi, ce qui peut être fait facilement par un microcontrôleur relié au circuit par l&#39;intermédiaire de modulation de largeur d&#39;impulsion (PWM). FIM donne des images à contraste très élevé sur une large gamme d&#39;intensités d&#39;éclairage. Surtout, elle gennère excellents résultats à déjà faible irridation infrarouge globale. Un appareil photo avec un filtre infrarouge est placé sous le tableau de suivi, qui permet l&#39;intégration de stimuli supplémentaires dans la configuration. stimuli thermiques peuvent être facilement appliqués par une plaque de rayonnement de chaleur et des stimuli lumineux sont appliqués par un projecteur LCD. Odorants peuvent également être contenus dans des gradients par des couvercles simples 8. Pour les expériences de gradient de chaleur, la plaque de radiateur de chaleur est perfusé avec de l&#39;eau chaude et froide respectivement sur ​​les deux côtés et placé au-dessus de 2 mm, les larves (figure 1B). La génération de contraste élevé, des films de haute qualité ouvre la possibilité pour base informatique sophistiqué d&#39;analyse d&#39;image, donc nous avons implémenté le logiciel FIMTrack pour extraire un grand nombre de caractéristiques à partir d&#39;images (Figure 2). Six premières principales caractéristiques ont été définies à partir du contour de l&#39;animal (figure 3A). Ces caractéristiques fournissent la valeur de référencePour de plus amples calcul des six caractéristiques secondaires qui décrivent la forme des animaux et sa position à certains stimuli à un point de temps donné (figure 3B). Actuellement, neuf caractéristiques tertiaires sont calculés qui intègrent les aspects temporels et ainsi caractériser la locomotion de l&#39;animal ainsi que les caractéristiques primaires et secondaires (figure 3C). <img alt="Figure 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> Figure 2. aperçu FIMTrack, workflow algorithmique et de la représentation des larves. (A) Comment utiliser FIMTrack. Les images sont chargées. Seuil de valeur de gris et de seuils de taille définissant larves larves unique doivent être réglés. La zone des larves doit être en [min-size, max-size]. Tracking est démarré par le bouton en surbrillance. (B) Suivi workflow. Après le bouton de démarrage est cliqué, l&#39;image de fond est calculated (intensités minimales dans le temps). Tant que il ya des cadres de gauche, les larves sont segmentés en fonction du seuil de gris et la minière et le seuil max-size. Pour tous les segments les représentations larvaires sont calculés (à comparer à (C)). Chaque nouveau modèle est associé à une trajectoire donnée si une piste valide est disponible. Si la dernière image est atteinte, la finalisation de post-traitement est effectué suivie par la génération de sortie. (C) la représentation des larves. L&#39;animal se compose d&#39;une tête et un point de queue (h et t). Entre ces points un nombre impair arbitraire de points de la colonne vertébrale s i peut être réglé avec un rayon r i. En outre, le centre de masse m et le corps principal de pliage d&#39;angle γ est calculé. Plusieurs paramètres de mouvement liées sont esquissés par les lignes pourpres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3. Caractéristiques calculées par FIMTrack. (A) des caractéristiques primaires basé sur le contour des animaux. (B) des caractéristiques secondaires, sur la base de caractéristiques primaires. (C) Les caractéristiques tertiaires, sur la base de caractéristiques primaires de trames consécutives et entrées supplémentaires <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

L&#39;analyse de la fonction de réseau neuronal nécessite une mesure fiable de traits comportementaux. Etant donné que le comportement des animaux qui se déplacent librement est variable dans une certaine mesure, de nombreux animaux doivent être analysés afin d&#39;obtenir des données statistiquement significatives. Cela nécessite un ordinateur assistée quantification automatique des modes de locomotion. Pour obtenir des images de contraste élevé d&#39;objets en mouvement presque translucides et petites, une nouvelle technique d&#39;imagerie basée sur la réflexion interne totale frustrée appelé FIM a été développé. Dans cette configuration, les animaux ne sont éclairés par la lumière infrarouge à la position très spécifique de contact avec la surface de ramper sous-jacent. Cette méthodologie en résulte des images à contraste très élevé. Par la suite, ces images à contraste élevé sont traitées en utilisant des algorithmes de suivi de contour établies. Sur cette base, nous avons développé le logiciel de FIMTrack, qui sert à extraire un certain nombre de caractéristiques nécessaires pour décrire quantitativement une grande variété de locomotioncaractéristiques. Lors du développement de ce logiciel, nous avons concentré nos efforts sur une architecture open source permettant d&#39;ajouter facilement d&#39;autres modules. Le programme fonctionne indépendant de la plateforme et se accompagne d&#39;une interface graphique intuitive guidant l&#39;utilisateur dans l&#39;analyse des données. Toutes les valeurs de paramètres de locomotion sont données sous forme de fichiers CSV pour leur permettre d&#39;autres analyses des données. En outre, une visionneuse des résultats intégré dans le logiciel de suivi offre la possibilité d&#39;examiner et de régler la sortie, que pourraient être nécessaires lors de l&#39;intégration de relance interactive. La puissance de la FIM et FIMTrack est démontrée par l&#39;étude de la locomotion des larves de drosophile.

Pour imager plusieurs caméras différentes avec des propriétés différentes de résolution ont été testés (Figure 4). Toutes les caméras où équipés d&#39;un filtre IR appropriée. Selon la faible résolution de la caméra au prix le plus bas dans ce test, le champ de vision est limité à 10 cm x 10 cm. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant un appareil photo de 4 mégapixels (MP). Cela conduit à une résolution de 100 pixels par longueur des larves au troisième stade larvaire et on le laisse reconnaître facilement structures internes. En outre, le péristaltisme de l&#39;animal peut être facilement extraite (figure 4A). Cependant, on peut encore obtenir des films à fort contraste en utilisant des caméras moins chers, qui peuvent également être analysés par FIMTrack. L&#39;utilisation d&#39;un appareil photo 1,4 MP avec une profondeur de 8 bits et une résolution de 1392 x 1040 pixels est d&#39;environ la moitié du prix et permet une résolution de 45 pixels par troisième stade larvaire longueur dans le champ de vision. La tête, mais pas d&#39;autres structures internes peuvent être reconnus (figure 4B). Le suivi et la détection de péristaltisme est possible mais la précision est réduite (figure 4B). Avec un appareil photo 0,8 MP encore moins cher avec une résolution spatiale comparable à la caméra de 1,4 MP, la tête des larves ne peut être reconnu plus fidèlement (figure 4C). Suivi et analyse de péristaltisme est possible, mais dont plus gigue basée sur le bruit augmenté. Étonnamment, même une webcam basse résolution USB fournit des films de qualité suffisantes pour calculer les trajectoires larvaires (0,3 MP appareil photo, ci-dessous 20 €, figure 4D). Le péristaltisme peut être calculée à partir de la région, mais les mesures sont très bruyant. Dans notre configuration, nous utilisons systématiquement la caméra 4 MP. Pour le dépistage, cette caméra permet la surveillance d&#39;un 22 cm x 22 cm arène, qui fournit évidemment l&#39;occasion d&#39;analyser un grand nombre d&#39;animaux simultanément de sorte que l&#39;analyse à haut débit est possible. Avec ce paramètre, la longueur des larves is représenté par 40 pixels qui permet toujours l&#39;enregistrement et l&#39;analyse du péristaltisme. Une image exemplaire de 15 trajectoires larvaires dans un gradient thermique est donnée sur la figure 5A. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un objectif macro permettant de larves d&#39;image à très haute résolution où de nombreux organes internes deviennent visibles et la reconnaissance de la tête est encore améliorée (figure 5B). De plus ceux-ci peuvent être utilisés en outre pour l&#39;analyse plus détaillée des comportements d&#39;un large éventail 20. La même configuration peut être facilement utilisé à l&#39;image ramper C. vers elegans (Figure 5c). <img alt="Figure 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> Figure 4. imagerie et de suivi des résultats de la FIM pour différentes caméras. (A) Gauche: imagerie FIM de trois larves rampant sur ​​une étape de suivi de 10 cm x 10 cm capturées à l&#39;aide d&#39;une caméra 4 MP avec 10 fps. Mi:Clipping et le centre de la trajectoire de masse d&#39;une seule larve. La zone de l&#39;animal est indiquée. Droit: Espace de la larve tracée plus de 100 cadres. La flèche rouge indique le point de l&#39;image coupée de temps. (B) l&#39;équivalent de (A), mais capturée à l&#39;aide d&#39;un appareil photo 1,4 MP. (C) l&#39;équivalent de (A), mais capturée à l&#39;aide d&#39;un appareil photo de 0,8 MP. (D) équivalent à ( A), mais capturée à l&#39;aide d&#39;un appareil photo 0,3 MP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> Figure 5. relance de chaleur, et de haute résolution applications. (A) l&#39;application de relance de chaleur (comparer à la figure 1). Trajectoires calculées par FIMtrack. (B) de l&#39;image d&#39;application à haute résolution d&#39;une troisième, deuxième et premier stade larvaire à l&#39;aide d&#39;un objectif macro. La longueur des larves de troisième stade est représenté par 400 pixels dans un champ de vision de 2,5 x 2,5 cm. (C) A C capturé elegans ver utilisant l&#39;imagerie FIM. Barres d&#39;échelle sont indiquées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM est un nouveau système, l&#39;imagerie rentable conçu pour suivre des objets en mouvement petits comme C. elegans, planaria ou larves de drosophile. Le programme de FIMTrack accompagnement est conçu pour fournir une analyse de données rapide et efficace. Ensemble, ces outils permettent une analyse à haut débit de traits comportementaux.

FIM Imagerie et FIMtrack: Deux nouveaux outils permettant à haut débit et de l&#39;analyse coûts de locomotion efficace

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vues.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM est un nouveau système, l'imagerie rentable conçu pour suivre des objets en mouvement petits comme C. elegans, planaria ou larves de drosophile. Le programme de FIMTrack accompagnement est conçu pour fournir une analyse de données rapide et efficace. Ensemble, ces outils permettent une analyse à haut débit de traits comportementaux. 

Vidéo: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

Conception et construction d&#39;un Headstage rentable pour la stimulation neuronale et enregistrement simultanés dans le labyrinthe de l&#39;eau

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Analyses comportementales automatisés à haut débit dans les embryons de poisson zèbre

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Analyse de haut-débit du comportement locomoteur dans le dosage de l’île de drosophile

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Un système de neuronavigation stéréotaxique et d’ultrasons focalisés guidé par image à haut débit pour l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...