This work was supported by the KU Leuven PF &#8216;IMIR&#8217;, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

NOTE: Toutes les expériences animales ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de la KU Leuven (numéro de projet 090/2013). Maintenir les animaux conformément aux lignes directrices de soins aux animaux KU Leuven. 1. C. albicans Croissance <ol><li> Vingt-quatre heures avant le début de l&#39;expérience animale, préparer des boîtes de YPD en ajoutant 10 g d&#39;extrait de levure de granules, 20 g de peptone bactériologique, et 15 g d&#39;agar granulé. Maquillage volume à 900 ml avec de l&#39;eau Milli-Q et autoclave. </li><li> Ajouter 50 ml de 40% de glucose stérile. Bien mélanger et verser dans des boîtes de Pétri. Laissez plaques d&#39;agar refroidir et se solidifier. NOTE: Dans cette étude, utiliser deux souches de type sauvage, à savoir C. albicans SC5314 - GLUC souche négative (dénommé WT) et C. albicans SKCA23 souche, qui est un type sauvage C. albicans SC5314 transformée avec Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 .Dans cette souche (nommé SKCA23- ACTgLuc) Gluc a été fusionné au gène endogène PGA59 sous le contrôle de ACT1 (actine) promoteur (ce promoteur est actif dans la levure, ainsi que l&#39;étape de croissance des hyphes fongiques). Cette souche peut être demandé au laboratoire du professeur Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgique. Plasmide Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 a été gracieusement offert par le professeur C. d&#39;Enfert, Institut Pasteur, Paris, France. </li><li> Maintenir les deux souches de stock de glycérol et conserver à -80 ° C. </li><li> Avant toute expérience souches à balayage sur une plaque YPD. Incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. Préparation cathéter Pieces <ol><li> Avant l&#39;expérience, déterminer le nombre de cathéters sont nécessaires. Il est possible d&#39;implanter jusqu&#39;à six morceaux de cathéters par souris (3 cathéters à gauche et trois cathéter sur le côté droit de l&#39;animal (Figure 2A). </li><li> Vingt-quatre heures avant la chirurgie animale, ouvrez le packâge contenant triple cathéter à sous le cabinet de sécurité biologique. Retirez toutes les pièces inutiles avec pinces stériles et coupez la partie attachée au cathéter avec un scalpel stérile. Placez la règle sous le paquet en plastique et couper des morceaux de cathéter de polyuréthane d&#39;exactement 1 cm selon l&#39;échelle sur la règle (Figure 1). NOTE: Il est important de mentionner que ce type de pièce de cathéter ne est pas phosphorescente et donc approprié pour BLI 18,19. </li><li> Placez un maximum de 15 pièces de cathéter de coupe (étape. 2.2) dans 2 ml microtubes. Toujours préparer trois morceaux supplémentaires, qui sont utilisés pour énumérer la quantité de cellules de Candida attachés sur le dispositif après la période d&#39;adhésion. </li><li> Supplément cathéters à environ 1,8 ml de 100% de sérum bovin fœtal (FBS). </li><li> Vigoureusement vortex et ajouter d&#39;autres 100-200 pi de 100% de FBS. Couvrir complètement toutes les pièces de cathéter avec du sérum. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant une nuit. </li&gt; </ol> 3. Les animaux et la suppression du système immunitaire <ol><li> Gardez Female souris BALB / c (environ huit semaines d&#39;âge) dans les cages individuellement ventilées haut de filtres avec un accès libre à la nourriture standard et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Initier la suppression de système immunitaire 24 heures avant la chirurgie des animaux par l&#39;addition de dexaméthasone (0,4 mg / L) dans l&#39;eau de boisson des animaux. Afin d&#39;éviter toute contamination bactérienne de l&#39;hôte, de compléter l&#39;eau de boisson avec un antibiotique, par exemple, l&#39;ampicilline de sodium en poudre (0,5 g / L). </li><li> Gardez immunosuppression des animaux pendant toute l&#39;expérience (jusqu&#39;à 6 jours). </li></ol> 4. Substrats de polyuréthane ex vivo C. albicans Adhérence sur FBS revêtues <ol><li> Transférer chaque pièce de cathéter enduites de sérum dans un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger. </li><li> Grattez un certain C. albicans cellules cultivées sur des plaques YPD (étape 1) et les suspendre dans 1 ml de PBS. </li><li> Diluer Cancellules Dida (1: 100) dans un tube à centrifuger séparée. Prendre 10 pl de l&#39;échantillon dilué et de l&#39;appliquer sur une chambre de comptage de cellules. Comptez au moins 16 petits carrés. </li><li> Préparer cellules de Candida (chaque souche séparément) dans du milieu RPMI 1640 à une concentration finale de 5 x 10 4 cellules / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de suspension cellulaire à chaque élément de cathéter enduites de sérum. </li><li> Vigoureusement Vortex et se assurer que les cathéters sont immergés dans le milieu et non flottant au-dessus. </li><li> Incuber les cathéters à 37 ° C pendant 90 minutes (durée de l&#39;adhérence). </li><li> Retirer les cathéters avec pinces stériles et les laver deux fois avec 1 ml de PBS. Au cours de cette étape se assurer que le fluide de lavage passe à travers la lumière du cathéter en le mettant en position verticale pendant le rinçage très doucement les cathéters. Surtout, ne pas utiliser un fort débit qui peut conduire à l&#39;élimination des cellules attachées. </li><li> Transférer chaque cathéter lavé pour un microtube propre (une pièce par tuêtre). </li><li> Placez sur la glace et y tenir jusqu&#39;à ce que la chirurgie. </li></ol> 5. Anesthésie <ol><li> Préparer anesthésie en mélangeant 75 ul de kétamine (100 mg / ml) avec 100 ul de médétomidine (1 mg / ml) et 825 ul de solution saline stérile. Administrer par voie intraperitoneale (ip) de 60 à 80 pl de cocktail anesthésiant par 10 g de poids corporel, résultant en une dose de 45-60 mg / kg de kétamine et de 0,6 à 0,8 mg / kg de médétomidine. </li><li> Par inversion de l&#39;anesthésie, diluer 50 ul atipamézole (5 mg / ml) dans 4,95 ml de solution saline, d&#39;administrer ip 100 ul par 10 g de poids corporel comme antidote, d&#39;où une dose de 0,5 mg / kg. </li><li> Après l&#39;injection de l&#39;anesthésie, placer l&#39;animal dans une cage séparée et attendre jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit totalement endormi. </li><li> Confirmer le bon anesthésie de l&#39;animal par pincement de la peau claire et pincement de l&#39;orteil, qui ne cause pas de dommages à la peau. Tout mouvement observé indique que l&#39;animal ne est pas suffisamment anesthésiée à pratiquer la chirurgie. Si cela se produit, attendez un couple de minutes de plus jusqu&#39;à ce que l&#39;animal ne montre pas de signes de mouvement sur la peau ou pincement de l&#39;orteil. </li></ol> 6. chirurgie animale <ol><li> Transfert anesthésié l&#39;animal de la cage sur un tissu propre placée sur le coussin chauffant, pré-chauffé à 37 ° C (figure 2A, (1)). NOTE: Une alternative moins coûteuse est d&#39;utiliser les couvertures chauffantes. Il est également possible d&#39;utiliser des serviettes isothermes, qui doivent être réchauffés au micro-ondes avant la chirurgie des animaux. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux. </li><li> Raser le bas du dos de l&#39;animal avec un rasoir électrique. Retirez tous les poils d&#39;animaux et de transférer des animaux sur un tissu propre. Désinfecter la peau (par exemple, 1% d&#39;isopropanol avec de l&#39;iode ou 0,5% de chlorhexidine à 70% d&#39;alcool) et quitter la zone désinfecté à sécher pendant environ 1 min (Figure 2A, (2)). </li><li> Faire une petite incision dans la peau (un à gauche et l&#39;autre sur le côté droit de l&#39;animal) (environ 0,5 &amp;# 8211; 1 cm) (Figure 2A, (3)). </li><li> Disséquer l&#39;hypoderme avec une paire de ciseaux pour créer deux tunnels sous-cutanées. Chaque tunnel devrait être d&#39;environ 1,5 cm de long et 1 cm de large. </li><li> Insérez trois pièces de cathéter, préalablement infectées par Candida, dans chaque tunnel. Se assurer que les cathéters se trouvent à côté de l&#39;autre dans une disposition horizontale et qu&#39;ils ne couvrent pas les uns les autres pour permettre l&#39;implantation de six fragments de cathéter au total (Figure 2A, (4)). </li><li> Fermez les incisions avec des sutures. Vous pouvez également utiliser Dermabond pour fermer la plaie. </li><li> Désinfectez la plaie très doucement avec 0,5% de chlorhexidine à 70% d&#39;alcool ou avec de l&#39;isopropanol iode (1%). </li><li> Appliquer un anesthésique local (gel de xylocaïne à 2%) directement sur la plaie. </li><li> Administrer inversion de l&#39;anesthésie (protocole 5, étape 2): voie intrapéritonéale 100 pi par 10 g de poids corporel. </li><li> Transfert des animaux dans une cage propre préalablement placé sur une plaque chauffante. Gardez l&#39;animalséparée et chaud jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est complètement éveillé. Pendant ce temps, poursuivre l&#39;opération et l&#39;implant de l&#39;animal suivant. Une fois que tous les animaux sont exploités pleinement éveillé. Transfert à une cage. Surveiller régulièrement les animaux. </li></ol> 7. La bioluminescence Imaging: Préparation de coelentérazine (CTZ), le substrat de G. luciférase princeps <ol><li> Préparer coélentérazine frais (CTZ) solution mère en dissolvant 5 mg / ml dans de l&#39;éthanol acidifié CTZ ou selon les instructions du fabricant. </li><li> Préparer la solution de travail 1,2 mM par dilution de la solution mère 1:10 dans du PBS stérile. REMARQUE: Injecter 100 ul CTZ solutions de travail sous-cutanée dans la zone entourant les cathéters. Utiliser des seringues d&#39;insuline pour injection sous-cutanée de la CTZ. </li><li> Toujours garder CTZ dans l&#39;obscurité (par exemple, couvrir microtubes contenant CTZ une feuille d&#39;aluminium). Conserver la solution de stock à -80 ° C pendant la durée des expériences. </li></ol&gt; 8. bioluminescence Imaging <ol><li> Réinitialisez l&#39;appareil BLI. </li><li> Anesthésier les animaux en utilisant une boîte d&#39;induction. Utilisation d&#39;un mélange gazeux d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène, N 2 O / O 2, ou de l&#39;air à 3.2%. </li><li> Après l&#39;induction, de maintenir l&#39;anesthésie dans la zone d&#39;induction et dans la chambre d&#39;imagerie à 1,5 à 2%. </li><li> Avant de commencer la session d&#39;imagerie, placer la plaque d&#39;imagerie en position A, qui correspond à un champ de vision de 10 cm. Veiller à ce que la bonne position des sorties d&#39;anesthésie et animaux en plaçant un animal de couchage dans la boîte. </li><li> Prenez quelques photos jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est en position d&#39;imagerie désiré, dans le champ de vision droite sous la caméra. </li><li> Préparer deux seringues à insuline contenant chacun 100 ul de la solution de travail CTZ. </li><li> Placez un animal sur le banc et le garder endormi au moyen d&#39;un cône de nez fournissant anesthésie gazeuse. </li><li> Apportez les aiguilles des seringues dans un endroit entourant cathéters sous-cutanée et injecterla CTZ simultanément au-dessus des cathéters. </li><li> Immédiatement après l&#39;injection, placez l&#39;animal sur la plaque chaude dans la boîte de la caméra et lancer l&#39;acquisition d&#39;image de bioluminescence. </li><li> Acquérir des balayages consécutifs avec des temps d&#39;acquisition de 20 à 60 secondes (selon l&#39;intensité du signal) jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité du signal maximum est atteint. Lors de l&#39;acquisition de la trame suivante, mesurer l&#39;intensité du signal BLI des cadres précédemment acquis en plaçant un ROI sur chaque cathéters trio et en mesurant le flux de photons à travers ce ROI. </li><li> Répétez l&#39;étape 7 pour l&#39;animal (s) suivante. </li><li> Après l&#39;imagerie, retourner les animaux dans leur cage. Répétez BLI au cours d&#39;une expérience pour longitudinale, suivi non invasif de la formation de biofilm. </li><li> Analyser les données à l&#39;aide de BLI Vivre logiciel Image. Placez un ROI rectangulaire de taille fixe sur chaque trio de cathéter et mesurer le flux de photons (éclat) à travers chaque ROI. Répétez cette opération pour chaque animal. </li><li> Rapportl&#39;intensité du signal de chaque BLI trio de cathéter flux de photons par seconde. Représenter les données BLI sur une échelle logarithmique en reportant la moyenne et l&#39;écart du flux de photons par seconde pour chaque groupe. Effectuer une analyse statistique sur les données transformées log 10. </li></ol> 9. cathéter explantation <ol><li> Préparer microtubes contenant 1 ml de PBS, un pour chaque dispositif de cathéter et de les garder sur la glace. </li><li> Euthanasier les animaux par dislocation cervicale (figure 2B, (1)). </li><li> Désinfecter la peau du dos avec 0,5% de chlorhexidine à 70% d&#39;alcool ou de l&#39;iode avec de l&#39;isopropanol (1%). </li><li> Faire une incision (environ 3 cm) au-dessus des cathéters. </li><li> Couper le tissu sous-cutané et enlever les fragments de cathéter, un par un à partir de sous le tissu sous-cutané en utilisant des pinces stériles (Figure 2B, (2)). </li><li> Poignée cathéter doucement en position verticale et laver deux fois avec 1 ml de PBS stérile. Placez chaque cathéterpièce dans un tube de microcentrifugeuse séparé (préparé dans l&#39;étape 1). </li></ol> 10. Quantification des cellules associées à un biofilm par unités formatrices de colonies comte (UFC) et analyse statistique des résultats <ol><li> Cathéters Soniquer préalablement placées dans 1 ml de PBS pendant 10 min à 40 000 Hz dans un sonicateur à bain d&#39;eau et de les placer sur la glace. </li><li> Après sonication, Vortex vigoureusement pendant 30 secondes et le lieu à nouveau sur la glace. </li><li> Préparer deux microtubes supplémentaires contenant 900 pi de PBS. </li><li> Assurez 01h10 et 1: 100 dilutions de votre échantillon original (celui qui contient le cathéter) et de garder tous microtubes sur la glace. </li><li> Planche 100 pi des échantillons originaux, 1:10 et 1: 100 dilutions sur des plaques de gélose YPD en double. </li><li> Incuber les plaques pendant 2 jours à 37 ° C et compter UFC. </li><li> Compter les colonies cultivées sur des plaques de gélose YPD (montant dénombrable de colonies, au maximum 300 colonies / plaque) et multipliez-les par le bon dilutionsfacteur de tion (1x-originale, 10x ou 100x dilution). En outre multiplier chaque pièce de cathéter en 10x, ce qui correspond à la quantité finale de colonies en 1 ml tube contenant le cathéter. Apportez le montant final de colonies de se connecter 10 cellules / pièce de cathéter avec une déviation standard (SD). Exprimez données comme une moyenne ± SD. </li><li> Placez toutes les valeurs pour chaque cathéter et groupe spécifique dans un tableur et / ou statistique, pour effectuer les calculs mentionnés ci-dessus et des analyses statistiques. Indiquer groupes spécifiques de comparer, à savoir WT vs. mutant ou deux jours vs. 6 jours de formation de biofilm et effectuer des test t non apparié et ANOVA avec Tukey post-test sur les données de log10-transformé. <ol><li> Exprimer le niveau de signification d&#39;une valeur de p. Dans cette étude indiquer l&#39;importance si la valeur de p &lt;0,05, représentée comme suit: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fungal+infections+in+living+mice+using+bioluminescent+pathogenic+Candida+albicans+strains+transformed+with+the+firefly+luciferase+gene.">Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene.</a> Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).</li><li>Enjalbert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+synthetic+Gaussia+princeps+luciferase+reporter+for+live+imaging+of+Candida+albicans+infections.">A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).</li><li>Mosci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bioluminescence+mouse+model+for+monitoring+oropharyngeal+candidiasis+in+mice.">A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice.</a> Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).</li><li>Van Wijngaerden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+infection:+a+new+rat+model+for+prophylaxis+and+treatment.">Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment.</a> J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

L&#39;utilisation de modèles animaux, et en particulier les modèles rongeurs, pour les études réservés aux biofilms microbiens est très important que le système immunitaire de l&#39;hôte est un facteur essentiel dans la formation de biofilm que les modèles in vitro ne peuvent pas expliquer. Dans cette étude, nous décrivons un sous-cutanée C. relativement simple biofilm modèle de la souris albicans, qui peut être facilement adopté dans un laboratoire de recherche et ne nécessite...

Candida albicans est un organisme commensal, qui se trouve à différents sites d&#39;individus en bonne santé, par exemple sur la peau ou en tant que partie de la flore vaginale et gastro-intestinal. Cependant, dans hospitalisé, et surtout les patients immunodéprimés, il peut provoquer un large éventail d&#39;infections 1. Chez ces individus, le système immunitaire est affaibli permet aux cellules de Candida pour diffuser dans la circulation sanguine et envahissent les tissus profonds provoquant des infections potentiellement mortelles. En outre, la présence de substrats abiotiques tels que des cathéters veineux centraux et des voies urinaires, des soupapes et des joints cardiaques artificielles peut fournir un créneau pour Candida accessoire 2. Adhérence à ces substrats est un préalable à la poursuite du développement du biofilm, ce qui représente une couche de cellules de levure et hyphes enrobé dans un matériau polymère extracellulaire, constitué principalement de deux polysaccharides. C. albicans cathéter associée au gène infectionssont associés à des taux de mortalité élevé. Une caractéristique générale de biofilms est leur sensibilité diminuée aux antifongiques connus, tels que les azoles 3,4. Seulement nouvelles classes de médicaments antifongiques tels que échinocandines et formulation liposomale d&#39;amphotéricine B se sont révélées actives contre les infections liées aux cathéters 5-7. En raison de biofilm résilience aux antifongiques, les approches thérapeutiques sont très limitées, conduisant souvent à l&#39;enlèvement du cathéter et son remplacement ultérieur comme une solution unique. La plupart de notre compréhension actuelle de C. le développement de biofilm albicans provient des études in vitro sur des substrats abiotiques tels que le polystyrène, ou des matières plastiques utilisées pour la fabrication des dispositifs mentionnés ci-dessus, ce est à dire, silicone, polyuréthane 2. Ces modèles sont très avancés et essaient d&#39;imiter le plus fidèlement la situation in vivo que possible. Toutefois, ces systèmes ne comportent pas l&#39;écoulement sanguin continu et til système immunitaire de l&#39;hôte. Il en a résulté le développement de systèmes de modèle in vivo, tels que le modèle cathéter veineux central (CVC) 8-10, le modèle de prothèse dentaire de la stomatite candidose buccale 11 et un modèle murin pour cathéter associé candidurie 12. En outre, C. le développement de biofilm albicans a été étudiée in vivo sur les surfaces des muqueuses, telles que celles de la cavité vaginale 13 et 14 par voie orale. Notre laboratoire a contribué à la création d&#39;un sous-cutanée C. modèle de biofilm albicans, qui est basé sur l&#39;implant de morceaux de cathéters infectés sur le dos de rats Sprague-Dawley 15. Ce modèle a été utilisé avec succès dans notre laboratoire pour tester la sensibilité au fluconazole biofilm et échinocandine médicaments 5,16, pour étudier l&#39;effet de la thérapie combinatoire de diclofénac et caspofungine 17. Plus récemment, nous avons adapté ce système pour une utilisation dans souris BALB / c 18,19. Encomparaison avec d&#39;autres modèles in vivo, le principal avantage de ce modèle sous-cutanée est la possibilité d&#39;étudier plusieurs biofilms par animal développé à l&#39;intérieur du lumen de cathéter de pièces implantées. Pour réduire le nombre d&#39;animaux de laboratoire, nous avons adapté ce modèle pour étudier le développement de C. albicans biofilms non invasive en utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) 18,19. Cette méthode se est avérée une technique puissante, qui peut être utilisée pour quantifier les biofilms en mesurant le signal spécifique BLI à la région d&#39;intérêt (dans notre cas, la zone de cathéters implantés), évitant le sacrifice animal. Par rapport à des bactéries, qui peut exprimer à la fois le gène et le substrat nécessaire à la réaction de bioluminescence en raison de l&#39;introduction d&#39;un opéron lux 20 spécifique, la plupart des organismes eucaryotes, y compris C. albicans, dépendent de l&#39;expression hétérologue d&#39;un gène de la luciférase couplée à laadministration externe d&#39;un substrat spécifique, telle que D-luciférine ou 21 coelentérazine. Probablement en raison de la présence de la paroi cellulaire fongique et C. albicans morphogenèse, la délivrance intracellulaire du substrat pour l&#39;enzyme luciférase a été un défi principal 21. Afin de résoudre ce problème, Enjalbert et al. 22 conçu une souche où C. synthétique albicans version optimisée codon du gène de la luciférase de Gaussia princeps naturellement sécrétée (Gluc) a été fusionné à l&#39;C. PGA59 gène albicans, une ancre GPI protéine de la paroi cellulaire. En raison de la présence de la luciférase à la paroi cellulaire, des problèmes concernant la disponibilité intracellulaire du substrat pourraient être évités. Ce système particulier a été utilisé pour étudier les infections superficielles provoquées par C. 22 albicans. Très récemment, BLI a également été utilisé pour suivre la progression de la candidose oropharyngée et son possibltraitement de l&#39;e 23. Ces résultats appuient l&#39;utilisation de BLI comme une technique prometteuse pour étudier les infections causées par des cellules vivant en liberté, mais aussi les infections associées aux périphériques. Dans cette étude, nous décrivons la C. albicans développement d&#39;un biofilm sur des morceaux de cathéters de polyuréthanne dans des souris BALB / c et sa quantification à l&#39;aide de BLI. Nous fournissons un protocole détaillé de la colonisation in vitro de cathéters de polyuréthanne au cours de la période d&#39;adhérence suivie de l&#39;implantation chez la souris et le développement de biofilm subséquente d&#39;animaux vivants. Outre la mesure du signal émis par le BLI C. cellules albicans, on détermine également la unités formant des colonies pour la comparaison avec la technique classique de biofilm fongique charge quantification.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Yeast extract granulated</td>
			<td style="width:199px;">Merck</td>
			<td style="width:113px;">MERC1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:199px;">Oxoid</td>
			<td style="width:113px;">LP037B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Agar granulated</td>
			<td style="width:199px;">Difco</td>
			<td style="width:113px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">D-(+)-glucose</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td style="width:113px;">49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prepared in the laboratory</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">R6504-1L</td>
			<td>Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">M1254</td>
			<td>MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">BBraun</td>
			<td style="width:113px;">CV-15703</td>
			<td>Polyurethane part cut into 1 cm pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:199px;">Fagron SAS, France</td>
			<td style="width:113px;">611139</td>
			<td>Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Duchefa Biochemie, The Netherlands</td>
			<td style="width:113px;">A0104</td>
			<td>Antibacterial prophylaxis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ketamine 1000</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">804 119</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Domitor</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134737-1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Antisedan</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134783-2</td>
			<td>Reversal of anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylocaine gel (2%) - this is Linisol</td>
			<td style="width:199px;">AstraZeneca</td>
			<td style="width:113px;">352 1206</td>
			<td>Local anesthetic for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>To prevent drying and infection of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Coelenterazine&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prolume (Nanolight)</td>
			<td style="width:113px;">NF-CTZ-FB</td>
			<td>Light sensitive agent (must be kept in the dark)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodine isopropanol (1%)</td>
			<td style="width:199px;">3M&#8482; DuraPrep&#8482;&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Cedium</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Cell counting chamber</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Insulin syringes (0.3 ml)</td>
			<td style="width:199px;">Terumo Myjector 29G</td>
			<td style="width:113px;">324826</td>
			<td>For injection of coelenterazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Electric razor</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sterile surgical tools</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Heating pad</td>
			<td style="width:199px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">14042321474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin suture</td>
			<td style="width:199px;">Johnson&#38;Johnson</td>
			<td style="width:113px;">K890H</td>
			<td>Surgical thread, needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath sonicator</td>
			<td>Branson 2210</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">BLI camera (IVIS Spectrum)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;">IVISSPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image software&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>(version 4.2)&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging

Candida albicans développement de biofilm sur des surfaces biotiques et / ou abiotiques représente une menace spécifique pour les patients hospitalisés. Jusqu&#39;à présent, C. biofilms albicans ont été étudiés principalement in vitro, mais il ya un besoin crucial pour une meilleure compréhension de ce processus dynamique dans des conditions in vivo. Nous avons développé un modèle de rat sous-cutanée in vivo pour étudier C. albicans formation de biofilm. Dans notre modèle, multiple (jusqu&#39;à 9) appareils infectés par Candida sont implantés à la partie arrière de l&#39;animal. Cela nous donne un avantage majeur sur le système de modèle de cathéter veineux central car il nous permet d&#39;étudier plusieurs biofilms indépendants dans un animal. Récemment, nous avons adapté ce modèle pour étudier C. le développement de biofilm albicans chez la souris BALB / c. Dans ce modèle, mûrir C. biofilms albicans développent dans les 48 heures et démontrent l&#39;architecture du biofilm tridimensionnelle typique. La quantification de biofilm fongiqueest traditionnellement analysé post-mortem et exige le sacrifice d&#39;accueil. Parce que cela nécessite l&#39;utilisation de nombreux animaux pour réaliser des études cinétiques, nous avons appliqué la bioluminescence imagerie non invasive (BLI) de suivre longitudinalement dans vivo mûrir C. albicans biofilms développer dans notre modèle sous-cutanée. C. albicans cellules ont été modifiées pour exprimer le gène de la luciférase de Gaussia princeps (Gluc) fixée à la paroi cellulaire. Le signal de bioluminescence est produite par la luciférase qui convertit la coelentérazine de substrat ajouté à la lumière qui peut être mesurée. Le signal BLI ressemblait nombre de cellules obtenues à partir de cathéters explantées. Imagerie non invasive pour quantifier la formation de biofilm in vivo fournit des applications immédiates pour le dépistage et la validation de médicaments antifongiques dans des conditions in vivo, ainsi que pour les études basées sur les interactions hôte-pathogène et contribuant à une meilleure compréhensiontion de la pathogenèse des infections liées aux cathéters.

Dans cette étude, nous montrons la procédure chirurgicale d&#39;implant de cathéter et explant in vivo au cours de C. albicans développement du biofilm dans une souris. En outre, nous affichons la quantification des biofilms matures non seulement par UFC recensement classique mais aussi par BLI. Comme le montre la Figure 1A, phosphorescents non morceaux de cathéters en polyuréthanne ont été coupés en des dispositifs de 1 cm et ensuite revêtus avec...

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Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

candida-albicans-biofilm-development-on-medically-relevant-foreign

Research

JoVE Journal

Medicine

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

12.9K vues.  Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven. We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Vidéo: Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence imaging using IVIS Spectrum was employed to monitor the distribution and development of the tumor cells following the delivery procedure including DLIT reconstruction to measure the tumor signal and its location.
Development of metastatic lesions to the bone tissues triggers osteolytic activity and lesions to tibia and femur were evaluated longitudinally using micro CT. Imaging was performed using a Quantum FX micro CT system with fast imaging and low X-ray dose. The low radiation dose allows multiple imaging sessions to be performed with a cumulative X-ray dosage far below LD50. A mouse imaging shuttle device was used to sequentially image the mice with both IVIS Spectrum and Quantum FX achieving accurate animal positioning in both the bioluminescence and CT images. The optical and CT data sets were co-registered in 3-dimentions using the Living Image 4.1 software. This multi-mode approach allows close monitoring of tumor growth and development simultaneously with osteolytic activity.

An experimental mouse model of bone metastasis was established following intracardiac delivery of luciferase expressing mammary tumor cells. Tumor development and resulted osteolytic lesion were monitored longitudinally with bioluminescence and micro CT imaging.

Surveillance des métastases tumorales et les lésions ostéolytiques avec bioluminescence et Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

Recherche

Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Aiguë traumatisme cérébral chez la souris Suivi par longitudinale à deux photons imagerie

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Évaluation des leucocytes infiltrant les tumeurs sous-ensembles dans un Modèle de tumeur sous-cutanée

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Bioluminescence imagerie d&#39;un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualisation quantitative de l&#39;infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm développement sur les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging