This study was supported by NeuralStem, Inc., and Johns Hopkins Project RESTORE.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par le Comité des soins et de l&#39;utilisation des animaux Johns Hopkins. machines d&#39;anesthésie nécessitent une inspection annuelle et l&#39;étalonnage nécessaire. 1. Anesthésie et de positionnement <ol><li> Anesthésie. <ol><li> Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous anesthésie avec 2-3% isofluorane. Confirmez niveau approprié de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil et le taux de respiration. Vérifiez que le rat ne bronche pas en réponse à un pincement de l&#39;orteil. NOTE: Un tressaillement indique anesthésie qui est trop tard et peut nécessiter une anesthésie plus avant de commencer ou une concentration isofluorane supérieur. Un taux inférieur à 1 souffle toutes les 2 sec est trop lent indiquant l&#39;anesthésie de respiration est trop élevé et peut exiger un éclaircissement de la concentration isofluorane. </li><li> Fixez l&#39;animal comme nécessaire pour éviter les mouvements de la tête lors de la procédure. Déposer une goutte de la lidocaïne sur l&#39;œil chirurgicale. Utilisez des larmes artificielles toutes les 10 min pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Donnerune injection de buprénorphine de 0,01 mg / kg SC pré-opératoire, puis tous les 6-8 heures au besoin. </li></ol></li><li> Positionnement. <ol><li> Placez rats dans un cadre stéréotaxique et garder au chaud avec un coussin chauffant. Mouiller la fourrure du cuir chevelu avec de l&#39;alcool en prenant soin d&#39;éviter l&#39;exposition sur les yeux. Utiliser des outils stériles et technique stérile pour minimiser les risques d&#39;infections post-opératoires. </li></ol></li></ol> 2. Contrôle des yeux <ol><li> Placez une suture 4-0 dans la conjonctive latérale et attacher avec assez de suture pour permettre une légère traction. </li></ol> 3. Dissection <ol><li> Dissection initiale. <ol><li> Faire une incision pouces ~ 1 dans la peau recouvrant la crête orbitale en utilisant une taille 10 scalpel comme le montre la figure 1. Rentrer la peau et le fascia sous-jacent et soigneusement disséquer le fascia. Pour prévenir les saignements excessifs dans la chirurgie, éviter de couper les vaisseaux sanguins tout en disséquant le fascia. Utilisez stratégiquement plconseils de coton ACED pour fournir l&#39;hémostase. </li></ol></li><li> Dissection profonde. NOTE: Avec une légère traction sur la conjonctive de l&#39;œil en tirant vers le bas et de la prise, le muscle orbitaire supérieure entrera en vue. Afin d&#39;exposer le nerf optique, ce muscle doit être coupé et la graisse rétro-orbitaire retiré. La graisse peut être jeté et ne doit pas être remplacé après l&#39;injection. De ce point, le nerf optique fascia doit être visible comme un faisceau de nerf optique lui-même, avec les vaisseaux sanguins enveloppés dans la dure-mère (Figure 1). <ol><li> Faire une petite incision dans la dure-mère utilisant le scalpel ou une aiguille biseautée de calibre 31 pour faire percer moins traumatisante. </li></ol></li></ol> 4. Pipette Injector <ol><li> Tirer une micropipette de verre à un diamètre de 50 à 100 um. Pour assurer la stabilité, la micropipette monter sur un micromanipulateur et le fixer à une seringue Hamilton reliée à une pompe à perfusion. </li><li> Tirez les billes (ou cellules souches)reconstituée dans un volume de 0,5 à 1,0 ul dans la micropipette rétrograde avec 0,5 ul de volume de solution de bleu de méthyle avant et après. NOTE: Un débit de perfusion réglé à 0,5-2 pi par min empêche traumatisme du nerf optique. </li></ol> 5. Injection <ol><li> Abaissez la pointe de la micropipette sur le nerf optique juste au-dessus de la dure entaillé. REMARQUE: Un petit mouvement, mais rapide de la pointe de verre dans les résultats du nerf optique dans le moins de dommages. Comme la pompe à perfusion commence, le colorant bleu de méthyle devrait mettre en évidence la zone du nerf optique injecté. Le colorant doit rester localisée dans le nerf optique sans fuite dans l&#39;espace sous-arachnoïdien. </li><li> Suivez la deuxième bande de bleu de méthylène pour déterminer quand l&#39;injection de cellules souches est complète et tourner la pompe à perfusion off que la deuxième dose de bleu de méthylène est injectée. Gardez la micropipette toujours dans le nerf optique pendant 2 minutes pour chaque volume de 1 pl injecté dans de prévenir l&#39;hypertensionéjection pression lors du retrait de la micropipette. NOTE: Une approche alternative est de relier la pointe de la pipette à une seringue remplie d&#39;air qui peut être manipulé manuellement. De toute façon, éviter une force excessive pour minimiser les dommages aux nerfs optiques. Nous vous recommandons d&#39;injecter plus de 2 pi de volume dans chaque nerf optique. </li></ol> 6. Suivi <ol><li> Immédiate. <ol><li> Lorsque l&#39;injection est terminée, retirez la micropipette avec des conseils de coton utilisés pour fournir l&#39;hémostase. Suturer la peau avec soie 3-0 et enlever la suture conjonctivale. </li><li> Gardez rats chaud sur un coussin chauffant jusqu&#39;à ce qu&#39;ils sortent de l&#39;anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu&#39;il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. </li><li> Si l&#39;animal présente des signes de douleur excessive, y compris la léthargie, ataxie, ou breathin travaillég, administrer une analgésie appropriée avec la buprénorphine par voie intramusculaire (0,05 mg / kg) jusqu&#39;à trois fois par jour. </li></ol></li><li> Long terme. <ol><li> Pour le 24-48 heures suivantes, observer le rat pour des complications de la chirurgie, y compris gonflement ou la décharge de la plaie ou d&#39;autres signes de douleur tels que la vocalisation, l&#39;apparence voûtée, non-toilettage, ou ne pas manger. Envisager une consultation avec un vétérinaire ou l&#39;euthanasie éthique que nécessaire. </li></ol></li></ol>

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	<li>Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+and+future+prospects+for+stem+cell+rescue+and+regeneration+of+the+retina+and+optic+nerve.">Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve.</a> Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).</li><li>Quigley, H. A., Iglesia, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+to+replace+the+optic+nerve.">Stem cells to replace the optic nerve.</a> Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).</li><li>Ghaffarieh, A., Levin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+disease+and+axon+pathophysiology.">Optic nerve disease and axon pathophysiology.</a> International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).</li><li>Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+development+of+the+optic+nerve+in+rats+reared+in+the+dark+during+early+postnatal+life.">Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life.</a> Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).</li><li>Celestre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+invasive+approaches+to+the+cervical+spine.">Minimally invasive approaches to the cervical spine.</a> The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).</li><li>Hallas, B. H., Wells, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Technique+for+Multiple+Injections+into+the+Mammalian+Optic+Nerve.">A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve.</a> Kopf Carrier. 54, (2001).</li><li>Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+and+transplantation+in+the+retinofugal+pathway.">Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway.</a> Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).</li><li>Adachi-Usami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+neuritis--from+diagnosis+to+optic+nerve+transplantation.">Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation.</a> Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).</li><li>Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+inflammation+and+demyelination+in+a+rodent+model+of+nonarteritic+anterior+ischemic+optic+neuropathy.">Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).</li><li>Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+nanomedicine+for+vision+restoration.">Regenerative nanomedicine for vision restoration.</a> Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).</li></ol>

The authors have no meaningful disclosures to report.

Direct injection into the optic nerve of stem cells or other products intended to facilitate regeneration provides a convenient model compared to other means of injections into the CNS. This technique takes less time, requires less total anesthesia, avoids drilling or removing skull or bone tissue, reduces complications rates and allows for more rapid recovery following surgery. 
The most critical steps in this protocol include: 1. Adequate hemostasis in the surgical field to allow clear visua...

Le nerf optique offre un emplacement idéal pour le système nerveux central (SNC), y compris la recherche régénérative conditions ophtalmologiques tels que la névrite optique, le glaucome et les traumatismes. Les injections de diverses cellules souches ont démontré une efficacité ou soit montré prometteur pour remplacer la perte de myéline, ce qui augmente le nombre axonale et / ou prévenir les maladies dégénératives. 1,2 Le nerf optique humain contient environ 1,2 million d&#39;axones parallèles voyageant de la rétine au chiasme avec un diamètre d&#39;environ 3,0-3,5 mm. 3 Pour modéliser les maladies humaines en laboratoire, le rat a été utilisé fréquemment. Le nerf optique de rat adulte contient environ 100.000 axones au sein d&#39;un diamètre d&#39;environ 0,5 mm. 4 Une des limitations majeures dans la recherche régénérative CNS est l&#39;accès désossé directe. Les complications et les risques chirurgicaux à l&#39;animal sont plus élevés lorsque le crâne ou des vertèbres sont enlevés. Comme pour les avantages deapproches mini-invasives de la colonne vertébrale, 5 injections du nerf optique directs sans ouvrir le crâne offre réduite complications et une récupération plus rapide. Cette technique a été utilisée dans les études précédentes. 6 Dans ce manuscrit et la vidéo qui l&#39;accompagne, nous démontrons une procédure mini-invasive d&#39;injecter des cellules souches dans le rat nerf optique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:335px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lewis rat</td>
			<td style="width:151px;">Charles River</td>
			<td align="right" style="width:151px;">4</td>
			<td>Any rat strain will work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anesthesia machine</td>
			<td style="width:151px;">Surgivet</td>
			<td style="width:151px;">CDS9000</td>
			<td>CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Infusion pump</td>
			<td style="width:151px;">Stoelting</td>
			<td align="right" style="width:151px;">53129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:151px;">National Optical</td>
			<td style="width:151px;">409-411-1105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiber-optic light source</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">12-562-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissection and Stereotaxic Instrument</td>
			<td style="width:151px;">Stoelting</td>
			<td align="right" style="width:151px;">51400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:151px;">Kopf</td>
			<td align="right" style="width:151px;">750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pipettes</td>
			<td style="width:151px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">18150-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable scalpel blades</td>
			<td style="width:151px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:151px;">810-15-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Iridectomy scissors</td>
			<td style="width:151px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:151px;">Uniband LA-4XF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimally-invasive technique for injection into rat optic nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

A la fin de l&#39;expérience, les rats ont été sacrifiés et perfusés avec 4% de paraformaldehyde. Les nerfs optiques ont été soigneusement disséqués et montés pour cryostat sectionnement. La figure 2 montre un exemple d&#39;un rat ensemble nerf optique à faible puissance dans lequel colorant bleu Evans a été injecté afin de visualiser le site. La flèche indique l&#39;emplacement précis de l&#39;injection. Cette dissection a été fait en quelques minutes de l&#39;injection, comme indiqu?...

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Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Technique mini-invasive pour injection dans Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

minimally-invasive-technique-for-injection-into-rat-optic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K vues.  Johns Hopkins University. Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid. 