PDK est soutenu par une subvention des IRSC exploitation (MOP 86523)

1. Technique chirurgicale <ol><li> Les expériences doivent être réalisées en utilisant des techniques aseptiques et en suivant les protocoles d&#39;utilisation d&#39;animaux de votre institution spécifique. Instruments et matériel (solutions, des substances d&#39;essai, traceurs, aiguilles, etc) qui entrent en contact avec les tissus vivants doivent être stériles pour prévenir l&#39;infection et les impacts négatifs sur le bien-être animal et les impacts négatifs potentiels sur l&#39;étude. </li></ol> 2. L&#39;anesthésie <ol><li> Les rats seront anesthésiés à l&#39;aide d&#39;un système de vaporisateur vétérinaires isoflurane. Utilisez oxygène médical à un taux de 0,8 L / min pour vaporiser le gaz isoflurane. Placez l&#39;animal dans la boîte de l&#39;anesthésie attachés et cadran en une concentration d&#39;isoflurane de 4% jusqu&#39;à ce que la respiration a ralenti et l&#39;animal est calme. </li><li> Ensuite, passer le débit de gaz de l&#39;attachement de masque à gaz pour le cadre stéréotaxique et de placer l&#39;animal dans l&#39;appareil de stéréotaxie. Tourner la concentration d&#39;isoflurane à 2% et de surveiller l&#39;anesthésie. Les plus gros animaux (&gt; 300g) peut exiger une plus forte concentration d&#39;isoflurane. L&#39;anesthésie doit être surveillée pendant la chirurgie et la posologie ajustée en conséquence l&#39;isoflurane. Profondeur et le taux de respiration doit être constamment évalué, et l&#39;évaluation pincement de l&#39;orteil (toutes les 5 min) pour l&#39;absence de douleur profonde doit être réalisé. </li><li> Une fois l&#39;intervention terminée, éteignez l&#39;isoflurane et permettre à l&#39;animal à l&#39;oxygène souffle pendant plusieurs minutes avant leur évacuation de l&#39;appareil de stéréotaxie. La température du corps doit être maintenu en couvrant l&#39;animal avec une couverture chirurgicale et / ou en utilisant une couverture chauffante régulée pendant la chirurgie. </li></ol> 3. Préparation Seringue pour injections intraoculaires <ol><li> D&#39;abord, assemblez le système de seringue pour effectuer les injections intraoculaires. A 10 uL RN 1701 Gastight seringue Hamilton est utilisé pour l&#39;injection. Retirez toute aiguille ou RN écrou présent sur la fin de la seringue. </li><li> Insérez l&#39;embout PFA dans la tasse PEEK férule du raccord de compression. Ensuite, insérez le raccord complète dans l&#39;extrémité de la seringue et lâchement visser l&#39;écrou RN sur le dessus. </li><li> Insérez une extrémité du tube en PEEK 1 / 16 po dans le raccord de compression, grâce à l&#39;ouverture de l&#39;écrou de RN. Assurez-vous que le tube en PEEK est bien en place. Serrer l&#39;écrou RN pour compresser la virole, d&#39;étanchéité du tube en PEEK. </li><li> Effectuez l&#39;étape 3.2 sur les deux extrémités de l&#39;attelage RN en verre double. Fixez l&#39;extrémité libre du tube en PEEK à une extrémité de l&#39;attelage RN en verre double en serrant l&#39;écrou RN. </li><li> Une micropipette de verre tiré formeront l&#39;aiguille et le baril pour le système d&#39;injection. Utiliser 1,5 mm OD épaisseur de verre à parois capillaires pour fabriquer les pipettes en verre, et d&#39;insérer la pipette de verre dans l&#39;extrémité libre du coupleur RN en verre double. Serrer l&#39;écrou RN pour fixer la pipette en place. </li><li> La pointe fine de micropipettes de verre tiré est généralement trop petit pour réaliser des injections intraoculaires. Afin de créer une pointe de diamètre approprié, casser la pointe de la pipette en verre, sous guidage visuel, en utilisant un microscope chirurgical. La fin dépolie d&#39;une lame de verre spécimen est bien adapté pour briser la pipette. Tenir la pipette à un angle et frotter le bout le long de la givrer le verre pour créer une pause. Idéalement, la pointe finale devrait être légèrement biseautés. Il peut prendre un peu de tentatives pour produire un bon pourboire, donc tirez pipettes multiples avant de l&#39;utiliser. </li><li> Le système d&#39;injection est hydraulique. Par conséquent, la seringue, linker tube en PEEK, double RN en verre coupleur et la micropipette de verre doit être rempli avec de l&#39;huile minérale avant de l&#39;utiliser. En utilisant le kit d&#39;amorçage à partir seringue Hamilton Co. (PRMKIT), remplir la seringue d&#39;amorçage avec de l&#39;huile minérale. Utiliser une aiguille de gros diamètre pour permettre le passage facile de l&#39;huile visqueuse. Remplacer l&#39;aiguille avec le Hamilton 90030 aiguille qui s&#39;adapte à l&#39;intérieur du canon de l&#39;seringue Hamilton 10 uL. Ensuite, placez une cloison en caoutchouc au cours de la Hamilton 90030 aiguille, afin d&#39;assurer une étanchéité tout en injectant de l&#39;huile minérale. </li><li> Insérez le Hamilton 90030 aiguille de la seringue d&#39;amorçage dans le dos du baril de 10 uL seringue Hamilton du système d&#39;injection. Appuyez sur la cloison étanche contre l&#39;extrémité de la seringue pour créer un joint. </li><li> Enfoncez lentement le piston. Vous verrez le passage de l&#39;huile minérale à travers les éléments en verre du système d&#39;injection, et enfin le remplissage de la pipette en verre. Poussez la totalité du pétrole à travers le système d&#39;injection afin d&#39;éliminer les bulles d&#39;air le long du tractus. Si la seringue de remplissage est à court d&#39;huile minérale, lentement, retirer l&#39;aiguille tout en permanence la distribution d&#39;huile pour empêcher la formation de bulles d&#39;air. Remplir la seringue d&#39;amorçage et d&#39;injecter de nouveau. </li><li> Lorsque le système entier est rempli d&#39;huile minérale et sans bulle, insérez le piston d&#39;origine du 10 uL seringue Hamilton. Appuyez sur le piston jusqu&#39;à la fin de sa course afin d&#39;enlever l&#39;huile minérale supplémentaire du système. Essuyez la vitre micropipette propre et la fin de la seringue propre avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Withdraw le piston de la seringue pour la marque de 2 uL sur le canon. La fin de la micropipette de verre va se remplir d&#39;air offrant une zone tampon entre l&#39;huile minérale et le fluide désiré d&#39;être injecté. Le baril pipette peut désormais être rempli en plaçant l&#39;extrémité de la micropipette dans la solution désirée et retirer le piston de la seringue Hamilton. Ne pas injecter plus de 4-5 uL de solution dans un oeil de rat adulte. </li></ol> 4. Procédure d&#39;injection intraoculaire: cibler les Retina Globalement <ol><li> Avec l&#39;animal anesthésié et sécurisés dans le cadre stéréotaxique (comme décrit dans la section 2), l&#39;utilisation des yeux Alcaine tombe à anesthésier localement la cornée. Ouvrez les paupières avec les doigts et déposer une goutte de la solution anesthésique à la surface de la cornée. </li><li> Injection nécessite deux personnes: une pour insérer la pipette en verre dans la chambre vitrée et maintenir la position pipette, et un autre pour appuyer sur le piston de la seringue, qui fournit la solution désirée. </li><li> Sous un microscope, l&#39;adhérence au verre et chirurgicale micropipette en verre double coupleur RN avec vos doigts. Fais les paupières avec les doigts de votre main libre, formant un &quot;V&quot; en face du site d&#39;injection. En exerçant une traction sur les paupières, l&#39;œil sera élevée hors de l&#39;orbite, d&#39;exposer la face postérieure derrière le limbe. En créant un «V» avec les doigts en face du site d&#39;injection, un berceau est formé pour assurer la stabilité de l&#39;œil lors de l&#39;injection. </li><li> Insérez délicatement la pointe de la micropipette de verre à travers la conjonctive, dans une zone dépourvue de vaisseaux sanguins, et à travers la sclère, à un angle vers le bas. Vous devriez sentir un petit &quot;pop&quot; quand la pipette pénètre la sclérotique. Insertion de la pipette à un angle légèrement vers le bas réduit la chance de frapper la lentille lors de l&#39;insertion de l&#39;aiguille. </li><li> La personne tenant la seringue doit désormais injecter le 4 uL de solution en appuyant sur le piston jusqu&#39;à la marque de 2 uL sur la seringue. L&#39;injection devrait prendre environ une à deux secondes au total. L&#39;injection à un rythme très lent&gt; 3 secondes réduit la propagation initiale de la solution à travers la chambre vitrée. Vous serez en mesure de voir la solution de rinçage injecté par la chambre vitrée sous le microscope, vérifiant ainsi le succès de la procédure. </li><li> Tenez la micropipette constante pendant environ 5 secondes, puis retirer, dans la même direction que l&#39;aiguille a été insérée. La conjonctive se rabat sur la petite ouverture, en aidant à sceller les perforations scléral. </li><li> Couvrez la surface de la cornée avec un onguent oculaire ophtalmique (Tears Naturale PM) afin de prévenir le dessèchement cornéen lors de la récupération et le retour de l&#39;animal dans une cage de récupération. </li><li> Post-chirurgicales analgésiques doivent être administrés selon les directives de vos autorités soins aux animaux, et les animaux doivent être surveillés avec attention après la chirurgie. </li></ol> 5. Cibler sélectivement les cellules ganglionnaires de la rétine de la souche Optic Nerve <ol><li> Application des traceurs, des médicaments, des plasmides, des siRNA ou des vecteurs viraux pour la souche du nerf optique, après axotomie, cible directement les cellules ganglionnaires de la rétine par le transport rétrograde. Ceci est accompli en premier exécutant une transection du nerf optique selon le «protocole du nerf optique Transection» 22. </li><li> Il existe deux méthodes principales pour accomplir cette procédure: en utilisant Gelfoam, ou l&#39;injection directe dans le nerf optique. </li><li> La méthode est similaire à Gelfoam rétrogrades traçage, cependant lors de la livraison de traitements expérimentaux au nerf optique, il est souhaitable de pré-étiqueter les cellules ganglionnaires de la rétine par l&#39;injection de traceurs rétrogrades dans le colliculus supérieur 1 semaine avant axotomie. Ceci est important pour la cellule de traçage parce que, dans certains cas traceurs neuronaux peuvent interférer avec le transport rétrograde de substances expérimentales ou vice-versa. </li><li> Immédiatement après le nerf optique est coupé, un petit morceau de Gelfoam trempé dans la solution expérimentale est placé sur le moignon du nerf optique sectionné. Le contenu orbitaire sont ensuite retournés à leur emplacement précédent. Lorsque l&#39;œil est retourné à une position neutre, il est nécessaire d&#39;utiliser une pince pour pousser le morceau de Gelfoam bas dans l&#39;orbite, en s&#39;assurant qu&#39;il reste sur le bout du nerf optique. </li><li> La technique d&#39;injection est plus efficace pour la livraison de substances qui doivent accéder au cytoplasme de l&#39;axone pour être transportés par voie rétrograde flux axoplasmique. Cela inclut des siRNA et des plasmides, et dans certains cas des vecteurs viraux. Une seringue de 50 à 10 uL Hamilton est utilisée pour injecter la solution souhaitée dans le nerf sectionné optique. </li><li> Grip au bord du nerf optique avec de fines pinces à bout Dumont. Insérez l&#39;extrémité de l&#39;aiguille dans le nerf optique, parallèlement avec le nerf, jusqu&#39;à ce que le biseau n&#39;est plus visible. L&#39;aiguille insérée sera enfermé de tous côtés par le nerf. Une aiguille à biseau court est souhaitable. </li><li> Une fois que le nEedle est inséré dans le nerf, presser doucement les côtés du nerf avec la pince à pointe fine et d&#39;injecter un quart de la solution tout en tournant la seringue un quart de tour dans le sens horaire ou anti-horaire. </li><li> Continuer à répéter l&#39;étape 5.7 jusqu&#39;à ce que vous avez effectué une rotation complète de l&#39;aiguille et injecter tout le contenu de la seringue. Pour de meilleurs résultats injecter un total de 10 uL de solution en utilisant une seringue de 10 uL étanche Hamilton. </li><li> Retirez l&#39;embout de la seringue par le nerf. Laisser l&#39;excès de liquide injecté qui a porté au reflux du nerf dans l&#39;orbite, car cela forme un bassin supplémentaire pour l&#39;absorption par les extrémités des axones. </li><li> Retourner le contenu orbitaire à leur position initiale, fermer la plaie, et permettre aux animaux de récupérer. </li><li> Post-chirurgicales analgésiques doivent être administrés selon les directives de vos autorités soins aux animaux, et les animaux doivent être surveillés avec attention après la chirurgie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Injections intraoculaires cibler toutes les cellules de la rétine dans le monde, et bien travailler pour les substances livraison à CGR blessés depuis cellules ganglionnaires sont situés dans la couche la plus interne des neurones de la rétine, à côté de la chambre vitrée. CGR peut également être directement visés par la prestation des substances à la souche du nerf optique sectionné. CGR Fluorogold marqués de façon rétrograde peut être ciblée en utilisant des peptides, des médicaments, des vecteurs, des plasmides, ou ARNsi de la souche nerveuse comme l&#39;illustre la figure 1. Figure 1A-C démontre la localisation d&#39;un peptide Cy3 étiquetés dans la soma des CGR qui ont été pré-étiquetées en injectant dans le Fluorogold colliculus supérieur. Cy3 peptides marqués ont été injectées dans le nerf optique immédiatement après axotomie, et de la rétine a été imagée en vie afin de prévenir les peptides issus de la lixiviation du tissu lors de la fixation. Figure 1D-F montre la localisation des Cy3 siRNA étiquetés et le traceur rétrograde Fluorogold au CGR axotomisés. Cy3 siRNA marqués ont été injectés dans le tronc du nerf optique immédiatement après axotomie, et de la rétine a été imagé vivante. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Micrographies épifluorescence des CGR dans les rétines flatmounted à 1 jour après axotomie et l&#39;injection de peptides soit étiqueté ou siRNA dans le tronc du nerf optique. (A) Fluorogold marquage rétrograde au CGR axotomisés au postaxotomy 1 jour (B) en fluorescence Cy3 CGR suivantes transport rétrograde de peptides marqués, 1 jour après axotomie et l&#39;injection de peptide dans le nerf optique. (C) Superposition de (A) et (B) montrant la localisation sélective des peptides marqués au Cy3 CGR Fluorogold étiquetés. (DF) Les corps cellulaires des Fluorogold CGR étiquetés (D) sont également remplis de Cy3 siRNA marqués (E) injecté dans le tronc du nerf optique 24 heures plus tôt, comme le montre la superposition (F). La barre d&#39;échelle dans le secteur est de 50 um. La barre d&#39;échelle dans le DF est de 20 um.

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Transection du nerf optique est un modèle hautement reproductible de l&#39;apoptose des neurones du SNC adulte. Les manipulations expérimentales ont démontré dans ce manuscrit permettre l&#39;étude des mécanismes de l&#39;apoptose RGC après une blessure. Injections intraoculaires sont utiles pour cibler mondiale de la rétine. Cette procédure nécessite une certaine pratique, car il est essentiel de ne pas blesser la lentille avec la pointe de la pipette en verre. Endommager la lenti...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

Cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont des neurones du SNC que les informations de sortie visuelle de la rétine au cerveau, via le nerf optique. Le nerf optique peut être consulté dans l&#39;orbite de l&#39;oeil et complètement sectionné (axotomisés), couper les axones de la population entière du CJR. Transection du nerf optique est un modèle reproductible de mort cellulaire par apoptose neuronale dans le SNC adulte 1-4. Ce modèle est particulièrement intéressant car la chambre vitrée de l&#39;œil agit comme une capsule pour la livraison de médicaments à la rétine, permettant des manipulations expérimentales par injections intra-oculaire. La diffusion de produits chimiques à travers le fluide vitré veille à ce qu&#39;ils agissent sur l&#39;ensemble de la population du CJR. Les vecteurs viraux, des plasmides ou court ARN interférents (siRNA) peut également être livré à la chambre vitrée afin d&#39;infecter ou de transfecter des cellules rétiniennes 5-12. Le tropisme élevé de virus adéno-associés (AAV) est bénéfique pour CGR cible, avec un taux d&#39;infection de près de 90% des cellules à proximité du site d&#39;injection 6, 7, 13-15. Par ailleurs, CGR peuvent être sélectivement transfectées par l&#39;application de siRNA, des plasmides ou des vecteurs viraux pour l&#39;extrémité coupée du nerf optique ou des vecteurs 16-19 injectant dans leur cible du colliculus supérieur 10. Cela permet aux chercheurs d&#39;étudier les mécanismes de l&#39;apoptose dans la population neuronale blessés sans effets confondants sur les neurones ou des cellules gliales d&#39;autres spectateurs environs. RGC apoptose a une caractéristique du temps bien sûr où la mort cellulaire est retardée 3-4 postaxotomy jours, après quoi les cellules rapidement dégénérer. Ceci fournit une fenêtre pour des manipulations expérimentales dirigées contre les voies impliqués dans l&#39;apoptose. Les manipulations qui ciblent directement les CGR de la souche du nerf optique sectionné sont effectuées au moment de la axotomie, immédiatement après la coupe le nerf. En revanche, lorsque les substances sont livrés par une voie intra-oculaire, ils peuvent être injectés avant la chirurgie ou dans les 3 premiers jours après la chirurgie, qui précède l&#39;initiation de l&#39;apoptose dans les CGR axotomisés. Dans le présent article, nous démontrons plusieurs méthodes pour des manipulations expérimentales après section du nerf optique.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Transection du nerf optique est un modèle largement utilisé de blessure SNC adulte. Ce modèle est idéal pour effectuer un certain nombre de manipulations expérimentales qui ciblent la rétine au niveau mondial ou directement pour cible la population blessés neuronale des cellules ganglionnaires de la rétine.

Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K vues.  University of Toronto. Transection du nerf optique est un modèle largement utilisé de blessure SNC adulte. Ce modèle est idéal pour effectuer un certain nombre de manipulations expérimentales qui ciblent la rétine au niveau mondial ou directement pour cible la population blessés neuronale des cellules ganglionnaires de la rétine.

Vidéo: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Recherche

Neurosciences

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un modèle Optic Nerve Crush blessures murins pour étudier la rétine de survie des cellules ganglionnaires

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

La transplantation de cellules olfactives engainantes à évaluer la récupération fonctionnelle après des nerfs périphériques blessures

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

Dans l&#39;imagerie in vivo de Optic Nerve Fiber intégrité par IRM de contraste amélioré chez la souris

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Technique mini-invasive pour injection dans Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Enregistrement Potentiel évoqué visuel dans un modèle de rat of Experimental Optic Nerve démyélinisation

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

L&#39;exposition du porc du système nerveux central pour l&#39;analyse anatomopathologique: Un manuel pour Décapitation, Crâne d&#39;ouverture et cerveau suppression