The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Préparation des réactifs culture et la culture Plaques <ol><li> Préparer milieu de culture cellulaire de la tige sans alimentation par addition de 100 ml de supplément gratuit de sérum 5x à 400 ml de cellules souches milieu de base. Le milieu est stable à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois. </li><li> Ajouter 10 uM solution de rho-associée, à enroulement en spirale contenant la protéine kinase (Rock) inhibiteur disponible dans le commerce corps embryoïdes (EB) support de formation (Y-27362). </li><li> Préparer un milieu de différenciation par addition de 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 10% de remplacement de sérum KO (KSR) et 10 ug / ml de gentamicine pour Modified Eagle Medium l&#39;Mélange / nutritive de Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Préparer milieu iPS-RPE en ajoutant 1x N1 supplément, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 250 ug / taurine ml, 13 ng sel de sodium / ml de triiodo-L-thyronine, de 20 ng / ml d&#39;hydrocortisone, 5 ug / ml de gentamicine et 15% de sérum bovin fœtal (FBS) &lt;sup&gt; 21 à milieu essentiel minimum de Eagle (MEM). Ajuster le pH à 7,4. </li><li> Préparer le sel de sodium solution stock triiodo-L-thyronine. Dissoudre 1 mg de sel de sodium triiodo-L-thyronine à 1 N d&#39;hydroxyde de sodium en remuant doucement. Ajouter 49 ml de MEM pour faire 50 ml de 20 pg / ml de sel de sodium triiodo-L-thyronine. Préparer des aliquotes et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour atteindre la concentration souhaitée dans du milieu de culture final. </li><li> Préparer hydrocortisone solution stock. Solubiliser 1 mg d&#39;hydrocortisone dans 1 ml d&#39;éthanol 100% par agitation douce. Ajouter 19 ml de MEM pour faire 20 ml de 50 pg / ml de solution d&#39;hydrocortisone stock. Aliquoter et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour obtenir la concentration désirée dans le milieu de culture final. </li><li> Préparer une solution de travail de dispase de 1 mg / ml dans du DMEM / F12. </li><li> Préparation de plaques de matrice revêtu <ol><li> Préparer matrice de protéine extraite de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucellules de sarcome soi dans DMEM / F12 à 0,08 mg / ml. Manteau de chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits avec 1 ml de la solution de la matrice. Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Après l&#39;incubation de 1 h, aspirer l&#39;excédent DMEM / F12. Ajouter 0,5 ml de souches milieu de culture cellulaire dépourvu d&#39;alimentation-pour éviter le dessèchement des puits. Les plaques de matrice revêtu sont prêts à l&#39;emploi. </li></ol></li><li> Préparer des plaques de microtitration, en rinçant chaque puits avec 2 ml de DMEM / F12. Retirer DMEM / F12 et ajouter 0,5 ml de milieu de formation EB complété avec un inhibiteur de rock à chaque puits. Centrifuger la plaque à 2000 g pendant 5 min pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Préparer du tampon de coloration FACS en mélangeant 2% de FBS et 0,09% d&#39;azide de sodium dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajuster le tampon à pH 7,4. </li><li> Préparer la solution de neutralisation de la trypsine par addition de 10% de FBS DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Culture <ol><li> Avant iPS cellules ensemencement, chaleureux souches milieu de culture cellulaire dépourvu d&#39;alimentation à 37 ° C, et ont la matrix plaques enduites de prêt. </li><li> Dégeler rapidement les cellules iPS IMR90-1 dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Ensuite, retirez le cryo-flacon du bain d&#39;eau et essuyez le flacon avec 70% d&#39;éthanol. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml en utilisant une pipette 2 ml de réduire au minimum la rupture des agglomérats de cellules. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de culture chaude cellules souches sans alimentation à cellules goutte à goutte et mélanger délicatement. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension attentivement les amas de cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire de la tige sans chargeur-et épépiner les amas de cellules dans les puits de la plaque de matrice revêtu. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO2, 95% d&#39;humidité. </li><li> Changer le milieu de culture de cellules iPS quotidienne. Observez colonies indifférenciées de cinq à sept jours après l&#39;ensemencement. Vérifiez colonies indifférenciées qui sont prêts pour le passage (colonies avec un centre dense) sous un microscope optique. </li></ol> 3. Le repiquage des cellules iPS <ol><li> Au passage les cellules iPS Avant de commencer, réchauffer la solution de dispase, DMEM / F12 et la tige milieu de culture cellulaire dépourvu d&#39;alimentation à 37 ° C au bain-marie. </li><li> Avant de passage de cellules iPS, retirez tous les domaines de la différenciation en grattant la zone et en aspirant le milieu. Rincer soigneusement les cellules iPS avec 2 ml de DMEM / F12. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 mg / ml de dispase à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 7 min. Aspirer le dispase et rincer délicatement les colonies de cellules avec 2 ml de DMEM / F12 deux fois. Après rinçage, ajouter 2 ml de milieu de culture de cellules souches des liaisons de connexion dans chaque puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette de 5 ml gratter doucement les colonies de la plaque pour former des amas de cellules. Transférer les amas de cellules individuelles dans un tube conique de 15 ml. Ajouter souches milieu de culture cellulaire dépourvu de chargeur-suffisante pour ensemencer le prochain passage de cellules. </li></ol> 4. Génération d&#39;EBS Utilisation Micropuits Plaques <ol><li> Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique de cellules iPS <ol><li> Retirez le medium à partir des cellules iPS et rincer les cellules iPS avec 2 ml de DMEM / F12. Ajouter 750 pi de Accutase à cellules iPS à chaque puits de la plaque de 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pour permettre aux cellules de se détacher de la plaque (environ 5 à 10 min). </li><li> Utiliser une pipette pour dissocier doucement toutes les cellules restantes et à détacher les cellules restant sur la surface de la plaque. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml. Rincer la plaque avec 5 ml de DMEM / F12 et combiner le DMEM / F12 avec rincé les cellules dans le tube conique. Faire passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour éliminer les grumeaux de cellules résiduelles possibles. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante pour enlever le Accutase. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de formation EB sorte que la concentration en cellules est d&#39;environ 0,5 à 1,0 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Déterminer le nombre de cellules viables par comptage des cellules avec du bleu trypan et un hémocytomètre. </li></ol></li><li> Adjustindensité cellulaire g dans des micropuits pour former EB grandeur contrôlée <ol><li> Ajuster le nombre de cellules dans chaque puits de la plaque à micropuits pour générer les tailles désirées EB. Ajouter des cellules dans les puits des plaques préparées à l&#39;étape 1.9, Répartir les cellules par pipetage doucement les cellules à plusieurs reprises. NOTE: Nombre de cellules nécessaires par puits = désiré nombre de cellules par EB x nombre de micropuits par puits. </li><li> Réglez le support de formation EB complété avec un inhibiteur de rock dans les puits à un volume final de 2,0 ml. Redistribuer les cellules par pipetage doucement chaque puits. Centrifuger les microplaques à 100 g pendant 3 min. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d&#39;humidité pendant 24 heures. </li></ol></li><li> EB de récolte des microplaques <ol><li> Récolte EB de micropuits par pipetage milieu des puits de haut en bas avec une micropipette 1 ml pour éliminer la plupart des EBS. Passez la suspension EB à travers une cellule de 40 um inversépassoire sur le dessus d&#39;un tube conique de 50 ml, pour éliminer les cellules simples. </li><li> Laver la microplaque cinq fois avec 1 ml de DMEM / F12 pour supprimer tous les EBS. Recueillir lavages et passez le tamis cellulaire inversée. Tournez le tamis cellulaire droite jusqu&#39;à un nouveau 50 ml tube conique. Recueillir les EB par lavage avec un milieu de formation EB. Comptez EBS pour déterminer le rendement. </li></ol></li></ol> 5. Placage EB et différenciation Initier <ol><li> EBS sur les plaques à matrice protéique revêtu des plaques six puits (comme à l&#39;étape 1.8.1) à une densité de &lt;1000 EB / puits dans du milieu de formation EB inhibiteur de roche, plus de 10 uM. Incuber les EB à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d&#39;humidité pendant 24 heures. </li><li> 24 heures après EB placage, remplacer par un milieu de différenciation pour initier la différenciation. Changer la moitié du milieu de différenciation tous les deux jours jusqu&#39;à ce que les cellules sont collectées pour analyse ultérieure. </li><li> Prélever des échantillons à jour 6, 17, 29 et 60 à faire RT-PCR, immunocytochemistry et FACS pour valider l&#39;expression des gènes et des protéines caractéristiques de l&#39;EPR. </li></ol> 6. Extraction de l&#39;ARN et PCR <ol><li> Extraire l&#39;ARN à partir des échantillons EB selon les instructions fournies dans le kit disponible dans le commerce. Déterminer la concentration de l&#39;ARN en utilisant un spectrophotomètre. </li><li> Effectuer transcription inverse sur 100 ng d&#39;ARN total selon l&#39;ARN disponible dans le commerce à l&#39;ADNc kit de transcription inverse. </li><li> Effectuer la PCR avec 10 ng d&#39;ADNc en utilisant les amorces suivantes (tableau 1) à une concentration de 10 umol / 10 ng d&#39;ADNc. Régler la PCR comme suit: dénaturation de l&#39;ADN à 95 ° C pendant 5 min, 35 cycles avec amplifier à 95 ° C pendant 15 sec, 60 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 1 min, suivi d&#39;un cycle final à 72 ° C pendant 10 min. Exécuter le produit de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1%. </li></ol> 7. Immunocytochimie <ol><li> Laver les EB avec du PBS deux fois à la température ambiante. Fixer les EBS RT chez 4% paraformaldehyde pendant 10 min. Rincer une fois avec PBS à température ambiante. Conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu&#39;à utilisés pour la coloration. </li><li> Le jour coloration, traiter les cellules fixes avec fixation et perméabilisation réactifs. Incuber les échantillons avec une solution de blocage (sérum de chèvre à 10% dans une solution de perméabilisation) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Effectuer immunochimie dans du sérum de chèvre à 10% dans une solution de perméabilisation en utilisant les anticorps primaires suivants aux dilutions indiquées: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), et anti- ZO1 (1: 100). Incuber les échantillons avec des anticorps O / N correspondant à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, retirez l&#39;anticorps primaire à partir des cellules et rincer les échantillons trois fois avec PBS. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Retirer l&#39;anticorps secondaire à partir des cellules et rincer les échantillons trois fois dans du PBS. Montez le couvercle glisse sur des lames de verre avec du DAPI contenant un milieu de montage et permettent de mettre en échantillons O / N dans une chambre sombre.Utilisation d&#39;un microscope à fluorescence pour visualiser la coloration. </li></ol> 8. coloration pour l&#39;analyse FACS <ol><li> Laver les EB cultivées en PBS deux fois. Incuber les EB avec 0,5 ml de trypsine à 0,25% pendant 5-10 min pour obtenir une suspension cellulaire unique. Neutraliser la trypsine avec une solution de neutralisation de la trypsine (1 ml / puits). </li><li> Transférer la suspension cellulaire unique dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 600 g pendant 10 min. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 10 ml de DMEM / F12 pour les cellules dans le tube. Inverser doucement pour mélanger les cellules. Centrifugeuse à 600 x g. Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de coloration FACS. </li><li> Comptez le nombre total de cellules. Centrifuger à 600 g pendant 10 min. Après centrifugation Rejeter le surnageant. Fixer les cellules immédiatement en ajoutant 0,5 ml de paraformaldéhyde 4%. Mélangez bien au vortex douce. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 600 g pendant 10 min et retirez lasurnageant. Vortex doucement à perturber le culot cellulaire. Perméabiliser les cellules en ajoutant 1 ml de solution de perméabilisation refroidi. Vortex légèrement pour bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger à 600 g pendant 10 min et éliminer le surnageant. Ajouter 3 ml de FACS tampon de coloration et remettre en suspension. Répétez cette étape pour une fois de plus. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de coloration FACS à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Transférer 100 pl de la suspension de cellules (0,5 x 10 6 cellules) à chacun des tubes de microcentrifugation et ajouter le volume recommandé de l&#39;anticorps primaire. Pour Pax6, ajouter 5 ul de PE anti-Pax6 dans 100 ul de suspension cellulaire. Pour MITF, ajouter 5 ul d&#39;anti-MITF dans 100 ul de suspension cellulaire. </li><li> Mélanger et incuber à température ambiante pendant 60 min. Ajouter 3 ml de tampon de coloration FACS. Mélanger et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et répéter 8,16 pour deux fois supplémentaires. </li><li> Pour MITF coloration, incuber les cellules dans Antibo secondairedy, de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 à une dilution de 1: 2000 pendant 1 heure à 4 ° C. Pour Pax6 coloration, éviter cette étape. </li><li> Laver les cellules avec 5 ml de tampon de coloration FACS et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Répétez le processus pour deux fois plus. </li><li> Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de coloration FACS et vortexer doucement pour perturber le culot cellulaire. Les échantillons sont prêts pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 9. iPS-RPE Isolement et culture <ol><li> Au jour 29, couper soigneusement autour des colonies pigmentées sélectionnés de la plaque de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 pi. Transférer les colonies flottantes dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les colonies à 600 g pendant 10 min à température ambiante et retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les colonies de cellules dans 10 ml de DMEM / F12 et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Eliminer le surnageant. </li><li> Préparer une suspension de cellules uniques en faisant incuber les colonies avec 2 ml de trypsine à 0,25% à 37 ° C pendant 7-10 min. Vortexer doucement la suspension de cellules de dissocier les colonies. </li><li> Neutraliser le trypsine en ajoutant 2 ml de milieu iPS-RPE. Centrifuger à 600 g pendant 10 min et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules individuelles dans 2 ml de milieu iPS-RPE. Transférer les cellules dans une matrice protéique recouvert de plaque à 6 puits et placer dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d&#39;humidité. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Pour réaliser pleinement les promesses des cellules souches pluripotentes pour la thérapie cellulaire, il est nécessaire de réglementer leur différenciation d&#39;une manière cohérente et reproductible. Ce rapport décrit les protocoles pour former EB grandeur contrôlée en utilisant la technologie de la plaque micropuits, engager la différenciation vers EPR et identifier des marqueurs de protéines et de gènes de RPE. Pour synchroniser la différenciation in vitro, tailles homogènes d&#39;EBS ont é...

Souches pluripotentes (iPS) induites sont un type de cellules souches pluripotentes dérivées par la reprogrammation des cellules adultes avec des facteurs extrinsèques 1. En revanche, les cellules souches embryonnaires (CSE), un autre type de cellules souches pluripotentes, sont générés à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste 3.2. Malgré leurs origines différentes, les cellules iPS et les CES sont comparables dans leur capacité illimitée de reproduire in vitro et dans leur capacité à se différencier en tout type de cellule 4-5. Ces caractéristiques de cellules iPS en font des candidats idéaux pour des applications en médecine régénérative personnalisée. Récents efforts de recherche sont axées sur l&#39;élaboration de protocoles de différenciation robustes pour produire des cellules adultes spécialisées, y compris épithélium pigmentaire rétinien (EPR) 6-11. Pour les applications cliniques potentielles de cellules iPS dérivées, une différenciation dirigée pour ce type de cellule spécifique est indispensable. Il existe différentes méthodespublié pour la différenciation dirigée des deux cellules iPS en CES et RPE qui varie grandement dans leur efficacité 6-7, 12-16. Nous ne savons pas encore beaucoup d&#39;événements moléculaires qui régissent le sort de cellules / tissus au cours du développement ou de la différenciation. Au cours des dernières années, des efforts ont été faits pour développer le protocole de différenciation qui peut imiter le développement embryonnaire dans la mesure du possible. Pendant la phase de blastocyste, non engagé population de cellules souches sont ensemble dans un micro-environnement en trois dimensions. Ainsi, diverses stratégies ont été appliquées pour rendre les cellules ESC / iPS assemblés et les cultiver en trois dimensions. Ces agrégats de cellules souches sont appelées corps embryoïdes (EBS). Des études ont montré que la différenciation EB de cellules souches imiter stade précoce du développement embryonnaire et peut spontanément donner lieu à endoderme primitif sur sa surface extérieure. Plus tard, le développement EB progresse, les phénotypes de cellules différenciées de tous les trois lignées germinales apparaissent 17-18. Therefore, protocoles de différenciation basée EBS ont attiré beaucoup d&#39;attention à la différenciation in vitro de cellules ESC / iPS et sont un bon candidat pour la production de l&#39;EPR à partir de cellules souches pluripotentes 13. EB peuvent être faites en utilisant plusieurs méthodes à partir de cellules / iPS ESC. Initialement, EB ont été faites par raclage des colonies adhérentes et les maintenir dans une culture en suspension non adhérent. Cependant, cette approche donne population hétérogène de EB qui entraîne une faible reproductibilité. Hanging culture cellulaire de chute et micropuits formation EB base existe d&#39;autres techniques populaires pour la formation EB qui donnent EB homogènes de tailles définies qui sont hautement reproductible. En outre, la technique de microtitration peut produire un grand nombre d&#39;agrégats avec moins d&#39;effort. Différenciation des cellules à l&#39;intérieur EB est régulée par un multiplex de signaux morphogéniques de l&#39;microenvironnement extracellulaire et intracellulaire. Contrairement à la différenciation dans un LUN.Format olayer, EBS fournir une plate-forme pour l&#39;assemblage complexe de cellules et de signalisation intercellulaire de se produire 17. Fait intéressant, le nombre de cellules souches pluripotentes utilisés pour fabriquer EB individuels a été observée pour influencer le destin des cellules. Par exemple, dans une étude de la différenciation hématopoïétique des CES humains, il a été observé que 500 cellules EB une différenciation vers la lignée myéloïde des cellules alors que 1000 EB poussé vers lignée érythroïde 20. Dans une autre étude, les petites EB favorisé la différenciation de l&#39;endoderme alors que les grandes EB promus vers la différenciation neuro-ectoderme 11, 17. Ces études antérieures suggèrent fortement que le nombre de cellules ESC / iPS utilisés pour fabriquer EB individuels affecte les EB différenciation en fonction de tous les types de cellules. Cependant, à notre connaissance, il ne existe pas d&#39;études actuelles qui ont élucidé l&#39;impact de la taille EB dans sa propension à se différencier vers RPE. Le but de cette étude est de caractériser l&#39;influence deEB taille sur souches pluripotentes induites (iPS) - l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (iPS-RPE) différenciation et d&#39;identifier le nombre de cellules optimale pour faire EBS pour la différenciation dirigée vers RPE lignée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Dans cette expérience, les cellules iPS ont été cultivées et différenciées dans la lignée de l&#39;EPR d&#39;EBS. EbS de tailles contrôlées ont été formés en utilisant des plaques micropuits. Comme on le voit sur ​​la figure 1 la formation EB était homogène dans les plaques de microtitration. Ces EB ont ensuite été recueillies et étalées sur des plaques à 6 puits (figure 2). RPE peuvent être identifiées par leur morphologie hexagonal...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

L&#39;objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes.

Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K vues.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes. 

Vidéo: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...