We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Solution Préparation <ol><li> Préparer 5 ml de &quot;tampon de SUV&quot; contenant 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou TRIS (pH 7,5) et 2 mM de trehalose. Filtrer le tampon avec un filtre à seringue de 0,2 um et diviser en portions aliquotes de 1 ml qui peuvent être stockées à -20 ° C. REMARQUE: Des détails supplémentaires pour les réactifs et les instruments sont donnés dans la liste des matériaux. </li><li> Préparer 40 ml de «tampon croissance» GUV qui permettra de combler l&#39;intérieur GUV pendant le film réhydratation. Pour une croissance «faible teneur en sel», combiner 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou 1 mM de TRIS (pH 7,5), et ~ 400 mM de saccharose. Pour une croissance &#39;de sel physiologique &quot;, combiner KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de TRIS (pH 7,5) et 200 mM de saccharose ~. </li><li> Préparer 40 ml de «tampon d&#39;observation&quot; pour la solution externe à la chambre expérimentale en combinant KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de TRIS (pH 7,5), et ~ 200 mM de glucose. NOTE: Ces tampons ne sont examples. Voir la discussion d&#39;adapter les tampons pour d&#39;autres expériences. </li><li> Mesurer les osmolarités des tampons de croissance et d&#39;observation avec un osmomètre. Ajouter granules de saccharose ou de glucose pour les faire correspondre à 1% afin que GUVs ne seront pas lyser ou se effondrer lors de son transfert de la chambre de croissance à la chambre d&#39;observation. NOTE: Dans cette gamme de concentration, en ajoutant 1 mM de saccharose (13,7 mg par 40 ml) ou de glucose (7,2 mg par 40 ml) augmente osmolarité par ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrer les tampons de croissance et d&#39;observation avec un filtre de 0,2 um et de les stocker à 4 ° C pour inhiber la croissance bactérienne. </li><li> Dissoudre 50 mg de bêta-caséine dans 10 ml de TRIS (pH 7,5) de tampon 20 pour former une solution de bêta-caséine 5 mg / ml nécessaire pour passiver les surfaces des chambres expérimentales pour que GUVs ne collent pas, la propagation et rafale. Une fois que la bêta-caséine soit complètement dissous (jusqu&#39;à plusieurs heures à 4 ° C), un filtre (0,2 pm) en aliquots de 0,5 ml qui peut être congelé et stocké éclairà -20 ° C pour une utilisation ultérieure (aliquotes décongelées stockées à 4 ° C peut généralement être utilisé jusqu&#39;à une semaine 1). </li></ol> 2. Préparation SUV <ol><li> Préparer et congeler des aliquotes de Proteo-VUS suivants du protocole détaillé publié antérieurement 28. Utilisation KvAP marqué par fluorescence avec Alexa 488-maléimide, reconstitué dans DPhPC VUS (10 mg / ml) à une protéine à lipide de 1:10 (en masse). Remarque: de type sauvage contient une cystéine KvAP par monomère situé près du C-terminal intracellulaire (acide aminé 247). </li><li> , VUS lipidiques seule fluorescentes: REMARQUE: Manipulez chloroforme sous une hotte de porter des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Éviter l&#39;utilisation de toute matière plastique que le chloroforme peut les dissoudre. solutions dans le chloroforme peuvent être stockés dans des flacons en verre ambre avec des bouchons en Téflon et transférées au moyen de seringues en verre. Prenez soin de rincer toute la verrerie au moins 5 à 10 fois avec du chloroforme avant et après pipetage lipides. <ol><li> Préparer 100 ul de10 Véhicules mg / ml DPhPC contenant 0,5% en moles du lipide fluorescent rouge, le rouge Texas-DHPE, en mélangeant 100 ul de solution DPhPC (10 mg / ml dans le chloroforme) avec 8,2 ul de solution Texas Red-DHPE (1 mg / ml dans du methanol) dans un flacon en verre ambré de 1,5 ml. </li><li> Sécher les lipides vers le bas sous un courant d&#39;azote dans une hotte chimique tout en faisant tourner le flacon. Lorsque le film semble être sec, placez les lipides sous vide pendant 3 heures pour éliminer tout solvant résiduel. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon SUV aux lipides, et vortex vigoureusement jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne reste collé lipidique sur les parois du flacon et la solution est laiteux uniforme. </li><li> Soniquer la solution de lipide pour former VUS. Ajustez la position flacon jusqu&#39;à ce que l&#39;échographie cause le plus de mouvement et de circuler à l&#39;intérieur du flacon, et de prendre soin de ne pas chauffer la solution inutilement. Continuer sonication jusqu&#39;à la solution devient translucide, ou lorsque possible, transparent (2-5 min pour embout sonication, ~ 20 min pour les bains à ultrasons). </li><li> Aliquot VUS (par exemple, 10 pi ou 20 pi) et gel (-20 ° C) pour une utilisation ultérieure. NOTE: Les lipides, en particulier les lipides insaturés, peut facilement ventilation. solutions lipidiques de magasin à 20 ° C (ou 80 ° C) sous argon et utiliser dans les 6 mois. Produits de dégradation des lipides peuvent être détectés avec chromatographie sur couche mince. </li></ol></li></ol> 3. GUV croissance par électroformation <ol><li> Préparer la chambre de électroformation. <ol><li> Si la chambre n&#39;a pas été nettoyé, retirez les fenêtres, essuyer le scellant et de graisse, extraire les fils, et rincer et frotter la chambre avec un tissu en utilisant l&#39;eau et de l&#39;éthanol (≥70%) en alternance. </li><li> Frottez les fils ainsi, plonger les fils et la chambre dans l&#39;acétone et soniquer pendant 5 min. Tout essuyer avec un tissu à nouveau avec de l&#39;acétone. Mettre la chambre dans l&#39;éthanol et de traitement par ultrasons pendant 5 min. </li><li> Assemblez la chambre en insérant les fils à travers les trous, et faire pivoter et essuyez les fils pour vous assurer qu&#39;ils are propre. Mettre la chambre dans l&#39;eau distillée, sonication pendant 5 min et sécher la chambre avec un courant d&#39;azote ou d&#39;air. </li></ol></li><li> Préparer 30 ul de 3 mg / ml de suspension de SUV dans un tampon SUV. Pour former GUVs contenant des protéines, mélanger 8 pi de Proteo-VUS (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01h10), 2 pi de VUS fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) et 20 pi de SUV tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml pour une protéine finale de lipide (masse) d&#39;un rapport de 1: 12,5 et 0,1% en moles TexasRed-DHPE. Mélanger vigoureusement la solution. <ol><li> Sinon, pour pratiquer le protocole avec lipides seulement VUS, simplement combiner 10 pi de VUS fluorescentes (10 mg / ml et 0,5 mol DPhPC% TexasRed-DHPE) avec le tampon de SUV de 20 pi. </li></ol></li><li> Déposer la solution SUV. <ol><li> Utiliser une pipette de 2 5 ul ul ou seringue en verre pour déposer de petites (&lt;0,2 ul) des gouttelettes de la solution de SUV sur les fils. Environ 1 ul de solution sont nécessaires pour former une série de gouttes le long de1 cm de fil. Assurez-vous que les gouttes sont assez petit et suffisamment espacées qu&#39;ils ne touchent pas ou le fusible. </li><li> Laissez les VUS déposés sécher pendant ~ 30 min à l&#39;air libre. Lorsque toutes les gouttes se sont installés, tourner le fil de sorte que les dépôts lipidiques sont plus faciles à observer avec le microscope. NOTE: Si les VUS ne se dessèchent pas suffisamment, ils peuvent tout simplement laver les fils lorsque la mémoire tampon de croissance est ajouté, pendant le séchage trop peut endommager les protéines. Étant donné que l&#39;humidité de l&#39;air influe sur la vitesse de séchage, le temps de séchage et / ou l&#39;humidité de l&#39;air peut être ajustée 30 pour des résultats optimaux. Le film lipidique sur les fils doit être visible sous un microscope. </li></ol></li><li> Assemblez la chambre. <ol><li> Sceller le fond de la chambre: Utiliser une seringue pour appliquer la graisse à vide au fond de la chambre autour des trois puits et appuyez doucement à 40 mm x 22 mm lamelle contre elle pour sceller le fond de la chambre, de sorte qu&#39;il adhère sans lacune. Sceller les côtés de la chambre (où la sortie des fils) avecpâte d&#39;étanchéité. Appliquer de la graisse à vide au-dessus de la chambre décrivant les trois puits. </li><li> Ajouter lentement tampon de la croissance jusqu&#39;à ce que chaque puits est rempli jusqu&#39;en haut. Éviter tout mouvement rapide de la solution dans les puits comme cela peut décaper le film lipidique hors tension les électrodes. </li><li> Fermez la chambre en appuyant sur la lame du capot supérieur doucement sur la graisse, en prenant soin de ne pas déloger la lamelle inférieure. Utilisez un tissu pour enlever les gouttes de tampon sur les bords du capot supérieur glissement. NOTE: Ce est un bon temps pour examiner la chambre sous le microscope pour confirmer que le film lipidique est resté sur les fils. </li></ol></li><li> Branchez le générateur de signal pour les câbles à l&#39;aide de deux pinces crocodiles. Régler la fréquence (10 Hz / 500 Hz sinusoïdal pour le tampon de sel basse / haute) et utiliser un multimètre pour mesurer et ajuster la tension entre les fils à 0,7 / 0,35 V racine carrée (Vrms) pour le tampon de sel bas / haut signifie. Couvrir la chambre avec du papier aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière. Laissez tes GUVs croître pendant 2 à 3 h pour le tampon de faible teneur en sel, et 12 h ou H / N pour le tampon à haute teneur en sel. </li><li> Déconnecter la chambre de générateur et soigneusement le placer sur un microscope inversé à évaluer l&#39;évolution de la GUV. Utilisez des mouvements lents et réguliers ou l&#39;écoulement de fluide dans les puits peut se détacher prématurément GUVs des fils. REMARQUE: GUVs sur les bords de fils sont généralement visibles en contraste de phase (40X travail de longue objectif à distance), alors que GUVs ne importe où sur la partie inférieure des fils sont visibles à épifluorescence. Si aucune GUVs sont visibles, essayez de tourner les fils à regarder la surface supérieure. GUVs peuvent être conservés à 4 ° C dans une chambre de croissance pendant plusieurs jours. </li></ol> 4. GUV croissance par Gonflement Gel assistée <ol><li> Préparer 10 ml d&#39;une solution d&#39;agarose à 1% en mélangeant 100 mg d&#39;agarose avec 10 ml d&#39;eau pure. Chauffer jusqu&#39;à ébullition en le plaçant dans un micro-ondes à 480 W pour ~ 20 sec. Remuer pour se assurer que l&#39;agarose est complètement dissous. REMARQUE: La solutionpeuvent être stockées à 4 ° C et réchauffé si nécessaire. </li><li> (air plasma) de plasma nettoyer une couverture-toboggan pour 1 min afin que la solution d&#39;agarose se étendra bien sur il. Utilisez les couvre-diapositives dans les 15 prochaines minutes que l&#39;effet de nettoyage au plasma se dissipe rapidement. </li><li> Appliquer 200 ul d&#39;une solution chaude d&#39;agarose à chaque 22 x 22 mm 2 de sorte que le coulisseau solution mouille toute la surface. Inclinez la lame verticalement et toucher le bord inférieur à un tissu pour enlever l&#39;excès de liquide et il suffit de laisser une couche mince et lisse d&#39;agarose sur la diapositive. </li><li> Placer la lame sur une plaque chauffante ou un four à 60 ° C et laisser sécher pendant au moins 30 min. Le film est à peine visible agarose à l&#39;oeil. Après les diapositives refroidir à température ambiante, les utiliser immédiatement, ou de les stocker pendant une semaine dans un récipient fermé à 4 ° C. </li><li> Placez la lamelle d&#39;agarose revêtues dans un plat de 3,5 cm de Pétri. </li><li> Préparer la solution de SUV comme dans la section 3.2 et appliquer ~ 15 pi de la solution de SUV (3 mg / lipide ml) dans~ 30 très petites gouttes doucement sur la surface agarose. Prenez soin de ne pas fausser la couche d&#39;agarose trop. </li><li> Placez la lame sous un léger courant d&#39;azote pendant environ 10 à 15 min et suivez l&#39;évaporation de la mémoire tampon à l&#39;oeil que les gouttelettes sèchent. </li><li> Dès que les VUS ont séché, ajouter tampon de croissance pour couvrir la surface de glissement. Pour un petit 3,5 cm boîte de Pétri utilisation ~ 1 ml de tampon. </li><li> Laisser le gonflement se dérouler pendant ~ 30 min, puis examiner la croissance de GUVs dans la chambre à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé avec contraste de phase ou contraste d&#39;interférence différentiel (DIC). NOTE: observation épifluorescence est difficile en raison de la solide expérience de fluorophores dans le gel et l&#39;auto-fluorescence de l&#39;agarose. </li></ol> 5. La récolte et observation GUVs <ol><li> Passiver la chambre d&#39;observation (par exemple, une petite boîte de Pétri ou lamelle de verre) de sorte que GUVs ne collent pas, la propagation et éclater sur le fond de chambre. Couvrir le chambre de fond avec une solution de bêta-caséine, incuber pendant 5 min, rincer la solution de caséine avec de l&#39;eau pure, sèche avec un courant d&#39;air ou de l&#39;azote, et enfin ajouter tampon d&#39;observation (par exemple, ~ 5 mm de profondeur pour une petite boîte de Pétri). </li><li> Récolter les GUVs. Couper le bout de 100 embouts de pipette ul donc l&#39;ouverture est plus grande (~ 2 mm de diamètre), et aspirer lentement que la contrainte de cisaillement de pipetage peut facilement détruire GUVs. <ol><li> Pour GUVs électro-formée, ouvrir la chambre de croissance en retirant doucement la lamelle supérieure. Placez la pointe de la pipette directement au-dessus de chaque fil et aspirer ~ 50 pi tout en déplaçant la pointe de la pipette le long du fil de détacher les GUVs. NOTE: Il peut être utile pour faire tourner le fil de recueillir GUVs de &quot;l&#39;autre côté&quot; du fil. </li><li> Pour GUVs &quot;assisté gel-gonflement&quot;, appuyez d&#39;abord sur le côté de la boîte de Pétri à quelques reprises pour aider les GUVs détachent de la surface de lamelle. Placez la pointe de la pipette juste au-dessus de la lamelle et aspirer 50 pi tout en pulling la pointe de retour sur la surface. Transférer directement GUVs récoltés à une chambre d&#39;observation, ou un magasin dans un tube de 1,5 ml à 4 ° C pendant 1 semaine. </li></ol></li><li> Placez la chambre d&#39;observation sur un microscope inversé, ajouter les GUVs à la chambre d&#39;observation, et attendre quelques minutes pour que les GUVs à se déposent au fond de la chambre. </li><li> Enquête sur la chambre avec un contraste de phase ou DIC pour localiser rapidement lisses, sphériques (&#39;sans défaut&#39;) &quot;candidats GUV&quot;. Examinez chaque «candidat GUV» dans épifluorescence afin d&#39;exclure tout petits liposomes contenant imbriquées à l&#39;intérieur. Enfin, vérifiez que l&#39;intensité de fluorescence des lipides est uniforme et compatible avec une seule membrane (ce est à dire, unilamellaire). NOTE: Dans certains bilamellaire (ou multi-lamellaires) vésicules, les membranes sont trop proches pour être résolus afin qu&#39;ils apparaissent unilamellaire en contraste de phase ou images DIC. Cependant, ces objets peuvent être distingués des unilame réelGUVs Llar par leur fluorescence lipidique, qui est deux fois (ou plus) lumineux. </li></ol> 6. GUVs Patch-serrage <ol><li> Assurez-pipettes de patch avec un diamètre de pointe de 1-2 um à partir de verre borosilicate capillaire standard en utilisant le programme recommandé pour l&#39;extracteur de pipette. NOTE: Les traitements spéciaux tels que polissage au feu ne sont pas nécessaires, et pipettes peuvent être utilisés pendant plusieurs jours après qu&#39;ils ont été tirés se ils sont conservés dans une boîte fermée. </li><li> Passiver la chambre par incubation avec une solution de bêta-caséine (5 mg / ml) pour se assurer que GUVs ne adhèrent pas, et répartis sur les surfaces de rupture de la chambre. Rincer la caséine éteint après 5 min. </li><li> Insérez l&#39;électrode de masse, remplir la chambre avec un tampon d&#39;observation, transférer 10 pi de la suspension de GUV comme décrit dans l&#39;étape 5.2 et 5.3, et attendre quelques minutes pour que les GUVs à se déposent au fond. </li><li> Remplir une pipette de patch avec une solution fraîche (tampon d&#39;observation ou d&#39;une autre solution iso-osmotique) etmonter sur le patch-clamp amplificateur headstage. </li><li> Recherche à travers la chambre pour trouver une GUV &quot;sans défaut&quot; comme décrit dans la section 5.4, et vérifiez qu&#39;il contient une protéine fluorescente. </li><li> Appliquer une pression positive constante (&gt; 100 Pa, soit environ 1 cm H 2 O dans un manomètre) pour maintenir la pipette de patch intérieur propre, et insérez la pipette de patch dans la chambre. Apportez la pipette de patch dans le champ de vision, appliquer des impulsions de test pour mesurer / compenser le décalage et la résistance tension de pipette, et examiner la pipette sous éclairage fluorescent pour confirmer que la pointe est propre. </li><li> Apportez la pipette de patch vers la GUV, et, si nécessaire, de réduire simultanément la pression positive pour l&#39;écoulement vers l&#39;extérieur de la pipette de patch ne rend pas la GUV &quot;se enfuir&quot;. Lorsque la pipette de patch est proche de la GUV, appliquer une pression négative (jusqu&#39;à 5 cm H 2 O) pour tirer la GUV contre la pipette de patch. Surveiller la résistance comme le &quot;; Langue &quot;de la membrane GUV entre dans la pipette de patch et les formulaires de gigaseal. </li><li> Si un gigaseal ne forment pas, retirer la pipette de patch de la chambre et retourner à l&#39;étape 6.4. Si la pièce de membrane formé un gigaseal, mais le GUV reste attaché à la pipette, exciser le patch en tirant loin de la GUV, éclatement de la GUV contre le fond de la chambre, ou brièvement déplacer la pipette de la solution. </li><li> Lorsque la pièce de membrane inside-out a été excisé du GUV et la gigaseal est stable, éteindre les impulsions de test et appliquer un protocole de tension tel que celui représenté sur la figure 13. REMARQUE: Figure 13 suit la convention électrophysiologique standard pour un correctif inside-out dans lequel le courant circulant dans le patch-électrode est «positif», et V = V salle de bain - V pipette. Tenir le patch à un potentiel négatif (par exemple, V = -100 mV) pour ~ 30 sec endroits KvAP dans l&#39;état de repos, tandis que les étapes (100 ms à 5 sec) à des potentiels plus positifs (par exemple, V = 100 mV) peut alors conduire dans conductrices (c.-à-ouverts) états actifs. </li><li> Après les mesures sur une pièce de membrane sont finis, briser le patch avec une impulsion zap ou de la pression et vérifier que le décalage de l&#39;électrode de patch tension n&#39;a pas dérivé. Retirer la pipette de patch de la chambre, et retourner à l&#39;étape 6.4. </li></ol>

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S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Systèmes modèles biomimétiques sont un outil important pour étudier les propriétés et les interactions des protéines et les membranes. Comparé à d&#39;autres systèmes reconstitués comme BLM ou membranes lipidiques supportées, GUV systèmes basés offrent plusieurs possibilités, y compris un contrôle considérable de la composition de la membrane, la tension et la géométrie, ainsi que d&#39;être vraiment libre d&#39;huile. Cependant, l&#39;incorporation des protéines transmembranaires, comme KvAP, dans ...

Lorsque l&#39;on étudie les principes physiques qui régissent les systèmes vivants, les approches bottom-up permettent un expérimentateur de contrôler la composition du système et d&#39;autres paramètres qui ne sont pas faciles à manipuler dans les systèmes à base de cellules-1. Pour les procédés membranaires, Giant vésicules unilamellaires (GUVs, diamètre ~ 1-100 um) se sont révélés être un système biomimétique très utile 2-7 comme ils sont bien adaptés pour les études de microscopie et micromanipulation 8-10. Bien qu&#39;il existe de nombreux protocoles différents pour produire GUVs, la plupart tombent dans deux catégories - émulsion à base approches 11,12 et techniques basées sur la réhydratation d&#39;un film lipidique 13-16. Dans les procédés à base d&#39;émulsion, les dépliants interne et externe des membranes GUV sont assemblés de manière séquentielle à partir de monocouches lipidiques aux interfaces eau / huile. Cette approche est idéale pour encapsuler des protéines solubles avecdans les GUVs, et pour former GUVs avec dépliant composition lipidique asymétrique. Cependant, GUVs formés à partir d&#39;émulsions peuvent conserver des traces de solvant qui changent les propriétés mécaniques de la membrane 17, et l&#39;approche ne est pas particulièrement bien adapté à la reconstitution trans-membranaire des protéines. Modes de réhydratation du film reposent sur le fait que le séchage (déshydratation) provoque de nombreux mélanges de lipides pour former un empilement multi-lamellaire de membranes. Si cette pile est ensuite mise en contact avec un tampon aqueux, les membranes de la pile se déplacent en dehors des flux de solvant entre eux et à la surface de l&#39;empilement, les membranes individuelles peuvent se détacher pour former GUVs 13,18 (ainsi un véritable zoo de d&#39;autres objets lipidiques). Cependant, même pour les compositions de tampons et de lipides optimales, cette méthode classique &quot;de gonflement spontanée&quot; a un rendement relativement faible des GUVs sans défaut. Une méthode largement utilisée pour stimuler le rendement de GUVs sans défaut est &quot;électroformation221 ;, dans laquelle un champ de courant alternatif (AC) est appliquée pendant le film réhydratation. Bien que le mécanisme reste mal comprise, &quot;électroformation&quot; peuvent donner des rendements de GUV spectaculaires (&gt; 90% dans des circonstances favorables) pour faible teneur en sel des tampons de concentration (&lt;5 mM) 14,19, et peut même travailler dans des tampons physiologiques (~ 100 mm) en utilisant une fréquence plus élevée (par rapport à 500 Hz 10 Hz) de champ en courant alternatif et des électrodes en platine 15. Une approche alternative pour augmenter le rendement de GUVs sans défaut est &quot;assisté gel gonflant&quot;, dans lequel la solution lipidique est déposé sur un substrat de gel polymère plutôt que le passif (par exemple, le verre, PTFE) substrats utilisés dans &quot;gonflement spontanée classique ». Lorsque le film lipidique / gel résultant est réhydraté, GUVs peuvent former rapidement même pour les tampons physiologiques 16,20. Toutes ces méthodes peuvent produire GUVs lipidiques seule qui peuvent être utilisés pour étudier la membrane associée phénomènes tels que lainteraction entre les protéines solubles et les membranes. Cependant, à incorporer une protéine trans-membranaire dans GUVs, des modifications importantes sont nécessaires pour garantir que la protéine reste dans un état fonctionnel tout au long de la procédure de reconstitution. Bien que les solutions de lipides dans des solvants organiques (par exemple, le chloroforme, le cyclohexane) sont idéales pour produire des films lipidiques, les protéines transmembranaires sont généralement seulement stable lorsque leur domaine transmembranaire hydrophobe est incorporé dans une bicouche lipidique, ou entouré par une micelle de détergent ( par exemple, lors de la purification des protéines). Ainsi, le matériau de départ pour une reconstitution est typiquement membranes natives, la protéine purifiée dans une solution de détergent ou de petites vésicules contenant des protéines unilamellaires (Proteo-SUV) et / ou des vésicules multilamellaires (protéo-MLV) formés par élimination du détergent dans le présence de lipides. La plupart des méthodes d&#39;intégrer ces protéines membranaires en GUVs se répartissent en trois catégories. Insertio directn: protéine trans-membranaire en suspension dans le détergent est mélangé avec des lipides, seuls GUVs préformés, légèrement détergentes solubilisées, et le détergent ensuite éliminé en utilisant BioBeads 21. Bien que conceptuellement simple, cette méthode nécessite un contrôle précis de la concentration en détergent, comme une trop forte concentration de détergent puisse dissoudre les GUVs pendant trop faible peut entraîner une concentration de la protéine ou l&#39;agrégat de se dérouler. GUV / Proteo-SUV Fusion: protéines dans Proteo-VUS est combiné avec, lipides seulement GUVs préformés et la fusion est facilitée avec des peptides fusogènes spéciales 22 ou 21 détergent. Typiquement, la mesure de la fusion est Limited soit GUVs avec une densité faible en protéines. La déshydratation / réhydratation: un film lipidique contenant des protéines est formée par la déshydratation partielle d&#39;un protéo-SUV (ou protéo-MLV) et GUVs solution est ensuite cultivée comme pour un film lipidique pure. Le défi évident est de protéger la protéine pendant la dehydrati partielleà l&#39;étape 23, mais la méthode a été utilisée avec succès pour reconstituer les protéines transmembranaires telles que bactériorhodopsine, calcium-ATPase, intégrine et VDAC en GUVs 7,23 - 25. Cet article décrit les protocoles de déshydratation / réhydratation pour faire GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP, de la Archaea, Aeropyrum pernix hyper-thermophile. KvAP a un degré élevé d&#39;homologie tension eucaryote dépendants canaux potassiques 26 et une structure cristalline connue 27 , ce qui en fait un bon modèle pour étudier le mécanisme de déclenchement de la tension. La production des Proteo-VUS a été décrite en détail précédemment, et ne fait pas partie de ce tutoriel 26,28,29. Fait important, KvAP Proteo-SUV ne ont pas à être produit pour chaque préparation d&#39;GUV, car ils peuvent être stockés dans de petites aliquotes (par exemple, 10 pi) à -80 ° C pendant des périodes de temps prolongées (&gt; 1 an). Électroformationou gonflement assisté gel peut alors être utilisé pour développer des GUVs KvAP Proteo-VUS (ou proteo-MLV). Les principales étapes du protocole de électroformation sont illustrés sur la figure 1. Gouttelettes d&#39;une solution de SUV contenant la protéine sont déposées sur des fils de platine (voir figure 2). La déshydratation partielle de la suspension de SUV conduit à la formation d&#39;un film de protéine de lipide par la fusion des SUV. Au cours de la réhydratation, un champ en courant alternatif est appliqué aux électrodes afin d&#39;aider les couches lipidiques pour délaminer et former GUVs. Un champ de 10 Hz fonctionne bien lorsque vous utilisez &quot;pauvre en sel&quot; (&lt;5 mM) tampon de réhydratation 28 et GUVs prennent plusieurs heures à se développer. En revanche, les tampons physiologiques (contenant environ 100 mM de sel) bien travailler avec une tension inférieure, 500 Hz champ AC mais nécessitent un prolongée (~ 12 h) Période de 15 gonflement. Cette méthode est basée sur un protocole antérieur utilisant ITO glisse 24, mais utilise une suite de chambre personnaliséeaining deux fils de platine comme le montre la figure 2 (voir la discussion pour plus de détails de conception et des suggestions pour simple, chambres improvisé). La figure 3 illustre le procédé de gonflement assisté gel. Le protocole fonctionne bien avec des tampons ayant des concentrations salines physiologiques, est rapide et produit GUVs avec une distribution plus homogène de protéines. Toutefois, le rendement des isolés GUVs, apparemment sans défaut (ce est à dire, la membrane GUV est uniforme à longueur échelles optiques et ne englobe pas tous les objets) est plus faible, mais il fournit un nombre suffisant de patch-clamp et les expériences de micro-manipulation . Cette méthode est basée sur un protocole utilisant un gel d&#39;agarose pour produire GUVs lipidiques seule 16 et nécessite un équipement moins spécialisé que la méthode de électroformation. La caractérisation de GUVs avec la microscopie de fluorescence est décrite, ainsi que des modes opératoires utilisant un patch-clamp configuration standardmesurer l&#39;activité KvAP dans &quot;inside-out&quot; excisées patches membranaires. Croissance GUVs contenant des protéines peuvent être plus difficile que GUVs lipidiques seule. En particulier, le rendement en GUV finale peut dépendre sensible sur exactement comment la solution de SUV est déposé et déshydraté pour former l&#39;empilement de membrane. Pour une personne sans expérience antérieure avec GUVs, il peut être utile d&#39;augmenter premier GUVs lipidiques uniquement suivant un protocole classique 15,16 dans lequel le film de la membrane est formée par dépôt de lipides dans un solvant organique. Une fois le protocole classique fonctionne bien, dépôt SUV et déshydratation partielle peuvent être maîtrisés à l&#39;aide VUS lipidiques seule, qui sont également très utile lors du réglage du protocole pour une nouvelle composition lipidique. Lorsque GUVs poussent fiable de VUS de lipides seulement, il ne est alors qu&#39;une petite étape pour produire GUVs contenant des protéines de Proteo-VUS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Géant vésicules unilamellaires (GUVs) sont un système biomimétique populaire pour l&#39;étude des phénomènes associés à membrane. Cependant, les protocoles couramment utilisés pour cultiver GUVs doivent être modifiés afin de former GUVs contenant des protéines transmembranaires fonctionnelles. Cet article décrit deux méthodes de déshydratation-réhydratation - électroformation et gonflement assisté gel - pour former GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP. Dans les deux procédés, une solution de petites vésicules unilamellaires contenant des protéines est partiellement déshydraté pour former un empilement de membranes, qui est ensuite laissé à gonfler dans un tampon de réhydratation. Pour la méthode de électroformation, le film est déposé sur des électrodes de platine de telle sorte qu&#39;un champ en courant alternatif peut être appliquée au cours de la réhydratation pellicule. En revanche, le procédé de gonflement assisté gel utilise un substrat en gel d&#39;agarose afin d&#39;améliorer le film réhydratation. Les deux méthodes peuvent produire GUVs dans (par exemple, 100 mM) des concentrations faibles en sel (par exemple, 5 mM) et physiologiques. Les GUVs résultantes sont caractérisées par microscopie à fluorescence, et de la fonction des canaux reconstituées mesurées en utilisant la configuration patch-clamp intérieur vers l&#39;extérieur. Bien que le gonflement en présence d&#39;un champ électrique alternatif (de électroformation) donne un rendement élevé de GUVs sans défaut, le procédé de gonflement assisté gel produit une distribution plus homogène de la protéine et ne nécessite aucun équipement spécial.

La croissance de GUVs peut être évaluée en examinant rapidement la chambre de croissance sous le microscope. Pour électroformation, les GUVs ont tendance à croître en grappes le long des fils de platine, comme le montre la Figure 4. Au cours de gonflement assisté gel, GUVs apparaissent comme des structures sphériques qui se développent rapidement et fusionnent ensemble (figure 5). GUVs sans défauts sont plus facilement identifiés et évalués apr?...

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Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K vues.  Université Pierre et Marie Curie.  La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie. 

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Recherche

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Préparation des liposomes de géant pour l&#39;imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...