We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparare 5 ml di &#39;tampone SUV&#39; contenente KCl 5 mM, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), e trealosio mM 2. Filtrare il buffer con un filtro a siringa da 0,2 micron e dividere in 1 ml di aliquote che possono essere conservati a -20 ° C. NOTA: Per ulteriori dettagli per reagenti e strumenti sono riportati nella lista dei materiali. </li><li> Preparare 40 ml di &#39;Buffer Growth&#39; GUV che riempirà il GUV interno durante pellicola reidratazione. Per una crescita &#39;bassa percentuale di sale&#39;, unire 5 mM KCl, 1 HEPES mM (pH 7,4) o 1 TRIS mM (pH 7,5), e ~ saccarosio 400 mm. Per una crescita &#39;salina fisiologica&#39;, combinare KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), e ~ saccarosio 200 mM. </li><li> Preparare 40 ml di &#39;osservazione Buffer&#39; per la soluzione esterna nella camera sperimentale combinando KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), e ~ 200 mM di glucosio. NOTA: Questi buffer sono solo examples. Vedere la discussione di adeguare i buffer per altri esperimenti. </li><li> Misurare le osmolarities dei buffer di crescita e di osservazione con un osmometer. Aggiungere granuli di saccarosio o glucosio per abbinarli a entro 1% in modo che GUVs non lisi o comprimere quando trasferito dalla camera di crescita per la camera di osservazione. NOTA: In questo intervallo di concentrazione, aggiungendo 1 mM di saccarosio (13,7 mg per 40 ml) o di glucosio (7,2 mg per 40 ml) aumenta osmolarità da ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrare i buffer di crescita e di osservazione con un filtro da 0,2 micron e conservare a 4 ° C per inibire la crescita batterica. </li><li> Sciogliere 50 mg di beta-caseina in 10 ml di 20 mM TRIS (pH 7,5) buffer per formare una soluzione di beta-caseina 5 mg / ml necessario per passivare le superfici delle camere sperimentali in modo che non si attacchino GUVs, diffondono e scoppio. Una volta che la beta-caseina è completamente sciolto (fino a diverse ore a 4 ° C), il filtro (0,2 micron) in 0,5 ml aliquote che può essere istantaneo congelato e conservatoa -20 ° C per un uso successivo (aliquote scongelati conservati a 4 ° C in genere può essere utilizzato per un massimo di un 1 settimana). </li></ol> 2. SUV Preparazione <ol><li> Preparare e congelare aliquote di Proteo-SUV seguito il protocollo dettagliato pubblicato in precedenza 28. Utilizzare KvAP fluorescente con Alexa-488 maleimmide, ricostituito in DPhPC SUV (10 mg / ml) ad una proteina rapporto lipidi di 1:10 (massa). NOTA: Wild-tipo KvAP contiene una cisteina per monomero situato vicino al C-terminale intracellulare (aminoacidi 247). </li><li> Fluorescenti, solo lipidi-SUV: NOTA: Maneggiare cloroformio sotto una cappa di indossare guanti di nitrile e occhiali di sicurezza. Evitare l&#39;uso di qualsiasi plastica come cloroformio possa dissolversi. Le soluzioni cloroformio possono essere conservate in flaconi di vetro ambrato con tappi in teflon e trasferiti tramite siringhe di vetro. Fare attenzione a lavare la vetreria almeno 5 a 10 volte con cloroformio prima e dopo pipettaggio lipidi. <ol><li> Preparare 100 ml di10 SUV mg / ml DPhPC contenenti 0,5 moli% del lipide fluorescente rossa, Texas Red-DHPE, mescolando 100 ml di soluzione DPhPC (10 mg / ml in cloroformio) con 8,2 ml di soluzione di Texas Red-DHPE (1 mg / ml in metanolo) in una fiala di vetro da 1,5 ml ambra. </li><li> Essiccare i lipidi sotto un flusso di azoto in una cappa chimica durante la rotazione della fiala. Quando il film appare asciutto, i lipidi sotto vuoto per 3 ore per rimuovere qualsiasi solvente residuo. </li><li> Aggiungere 100 ml di buffer di SUV per i lipidi, e vortice vigorosamente fino a quando non lipidico rimane attaccato alle pareti del flaconcino e la soluzione è uniformemente lattiginoso. </li><li> Sonicare la soluzione lipidica per formare SUV. Regolare la posizione di flaconcino fino ultrasuoni provoca la maggior parte dei movimenti e il flusso all&#39;interno del flacone, e fare attenzione a non riscaldare la soluzione inutilmente. Continuare sonicazione finché la soluzione diventa trasparente, o quando possibile, trasparente (2-5 min per la punta sonicazione, ~ 20 min per il bagno sonicazione). </li><li> Aliquot SUV (ad esempio, 10 microlitri o 20 microlitri) e congelamento (-20 ° C) per un uso successivo. NOTA: Lipidi, in particolare lipidi insaturi, può facilmente ripartizione. Solutions Store lipidiche a 20 ° C (o 80 ° C) sotto argon e utilizzare entro 6 mesi. Prodotti di degradazione lipidi possono essere rilevati con cromatografia su strato sottile. </li></ol></li></ol> 3. GUV crescita da Electroformation <ol><li> Preparare la camera electroformation. <ol><li> Se la camera non è stata pulita, rimuovere le finestre, pulire tutto sigillante e grasso, estrarre i cavi, e risciacquare e macchia la camera con un tessuto con acqua ed etanolo (≥70%) alternativamente. </li><li> Rub i fili ben, immergere i fili e camera in acetone e ultrasuoni per 5 min. Pulire il tutto con un panno di nuovo con acetone. Mettere la camera in etanolo ed ultrasuoni per 5 min. </li><li> Montare la camera inserendo i fili attraverso i fori, e ruotare e pulire i fili per assicurarsi che are pulito. Mettere la camera in acqua distillata, con ultrasuoni per 5 min e asciugare la camera con un flusso di azoto o aria. </li></ol></li><li> Preparare 30 ml di 3 mg / sospensioni SUV ml in tampone SUV. Per formare GUVs contenenti proteine, combinare 8 ml di Proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1,10), 2 ml di SUV fluorescenti (10 mg / ml DPhPC, 0.5 mol% TexasRed-DHPE) e 20 ml di SUV buffer in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per una proteina finale lipidi (massa) rapporto di 1: 12,5 e 0,1 moli% TexasRed-DHPE. Mescolare la soluzione vigorosamente. <ol><li> In alternativa, a praticare il protocollo con lipidi solo SUV, semplicemente unire 10 ml di SUV fluorescenti (10 mg / ml DPhPC e 0,5 mol% TexasRed-DHPE) con tampone SUV 20 microlitri. </li></ol></li><li> Depositare la soluzione SUV. <ol><li> Utilizzare una pipetta 2 microlitri o 5 microlitri siringa di vetro depositare piccole (&lt;0,2 microlitri) gocce della soluzione SUV sui fili. Circa è necessario 1 ml di soluzione per formare una serie di gocce lungo1 cm di filo. Assicurarsi che le gocce sono abbastanza piccoli e una distanza tra loro che non si tocchino o il fusibile. </li><li> Lasciate che i SUV depositati asciugare per ~ 30 minuti all&#39;aria aperta. Quando tutte le gocce sono insediati, ruotare il filo in modo depositi lipidici sono più facili da osservare con il microscopio. NOTA: Se i SUV non si asciugano abbastanza, si può solo lavare i fili quando si aggiunge il buffer di crescita, mentre l&#39;essiccazione troppo può danneggiare la proteina. Perché l&#39;umidità dell&#39;aria influenza la velocità di asciugatura, il tempo di asciugatura e / o umidità dell&#39;aria può essere regolata per ottenere risultati ottimali 30. Il film lipidico sui fili dovrebbe essere visibili al microscopio. </li></ol></li><li> Montare la camera. <ol><li> Sigillare il fondo della camera: utilizzare una siringa per applicare grasso per vuoto al fondo della camera intorno ai tre pozzi e premere 40 x 22mm coprioggetto delicatamente contro di essa per sigillare il fondo della camera in modo che aderisca senza fessure. Sigillare le pareti della camera in cui l&#39;uscita (fili) conpasta di tenuta. Applicare grasso per vuoto sulla parte superiore della camera di delineare i tre pozzi. </li><li> Lentamente aggiungere buffer di crescita fino a quando ogni bene è riempito al top. Evitare qualsiasi movimento rapido della soluzione nei pozzetti come questo può togliere il film lipidico fuori gli elettrodi. </li><li> Chiudere la camera premendo il coperchio slitta superiore delicatamente sul grasso, facendo attenzione a non spostare il coprioggetto fondo. Utilizzare un tessuto per rimuovere eventuali gocce di tampone ai bordi del coperchio superiore di slittamento. NOTA: Questo è un buon momento per esaminare la camera al microscopio per confermare che il film lipidico è rimasto sui fili. </li></ol></li><li> Collegare il generatore di segnale per i cavi utilizzando due morsetti a coccodrillo. Impostare la frequenza (10 Hz / 500 Hz onda sinusoidale per il buffer di sale basso / alto) e utilizzare un multimetro per misurare e regolare la tensione attraverso i fili di 0,7 / 0,35 V radice quadrata (Vrms) per il buffer di sale bassa / alta media. Coprire la camera con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce. Lascia tegli GUVs a crescere da 2 a 3 ore per il buffer di sale basso, e 12 ore o O / N per il buffer di sale. </li><li> Scollegare la camera dal generatore e con attenzione posizionarlo su un microscopio invertito per valutare la crescita GUV. Usa movimenti lenti e costanti o il flusso di liquido nei pozzetti possono staccarsi prematuramente GUVs dai fili. NOTA: GUVs sui bordi di filo sono di solito visibili in contrasto di fase (40X obiettivo lunga distanza di lavoro), mentre GUVs ovunque nella metà inferiore dei fili può essere visto con epifluorescenza. Se non GUVs sono visibili, provare a ruotare i fili di guardare la superficie superiore. GUVs possono essere conservati a 4 ° C in una camera di crescita per diversi giorni. </li></ol> 4. GUV crescita da gonfiore Gel-assistita <ol><li> Preparare 10 ml di una soluzione di agarosio 1% mescolando 100 mg di agarosio con 10 ml di acqua pura. Riscaldare fino ad ebollizione ponendolo in un forno a microonde a 480 W per ~ 20 sec. Mescolare per assicurarsi che il agarosio è completamente sciolto. NOTA: La soluzionepuò essere conservato a 4 ° C e riscaldato quando necessario. </li><li> Plasma-pulito (plasma ad aria) una copertura scorrevole per 1 min in modo che la soluzione di agarosio si diffonda bene su di esso. Utilizzare il coperchio-diapositive entro i prossimi 15 minuti, come l&#39;effetto di pulizia al plasma svanisce rapidamente. </li><li> Applicare 200 microlitri di soluzione di agarosio calda per ogni 22 x 22 mm 2 scorrimento per cui la soluzione bagna l&#39;intera superficie. Inclinare la slitta verticale e toccare il bordo inferiore di un tessuto per rimuovere il liquido in eccesso e lasciare solo uno strato liscio sottile di agarosio sul vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino su una piastra calda o forno a 60 ° C e lasciare asciugare per almeno 30 minuti. Il film agarosio è difficilmente visibile a occhio. Dopo i vetrini raffreddare a RT, utilizzarli immediatamente, o memorizzarli fino ad una settimana in un contenitore chiuso a 4 ° C. </li><li> Posizionare il vetrino agarosio rivestite in un piatto di serie 3,5 centimetri Petri. </li><li> Preparare la soluzione SUV come nella sezione 3.2 e applicare ~ 15 ml di soluzione di SUV (3 mg / ml lipidi) in~ 30 piccolissime gocce delicatamente sulla superficie agarosio. Fare attenzione a non alterare lo strato di agarosio troppo. </li><li> Posizionare il vetrino sotto leggera corrente di azoto per circa 10-15 min e seguire l&#39;evaporazione del buffer occhio come goccioline asciugare. </li><li> Non appena le SUV sono asciugati, aggiungere buffer di crescita per coprire la superficie di scorrimento. Per un piccolo 3,5 centimetri Petri dish uso ~ 1 ml di tampone. </li><li> Lasciare che il gonfiore di procedere per ~ 30 minuti, e poi esaminare la crescita del GUVs nella camera utilizzando un microscopio invertito con contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale (DIC). NOTA: osservazione epifluorescenza è difficile a causa della forte background di fluorofori nel gel e l&#39;auto-fluorescenza del agarosio. </li></ol> 5. Raccolta e Observing GUVs <ol><li> Passivare la camera di osservazione (ad esempio, piccola scatola di Petri o vetrino di vetro) in modo che non si attacchino GUVs, diffondere e scoppiò sul fondo della camera. Coprire il chamber fondo con soluzione di beta-caseina, incubare per 5 min, sciacquare la soluzione di caseina con acqua pura, secco con una corrente di aria o azoto, e infine aggiungere buffer di osservazione (ad esempio, ~ 5 mm di profondità in una piccola capsula di Petri). </li><li> Raccogliere le GUVs. Tagliare la fine di un 100 puntali delle pipette microlitri modo che l&#39;apertura è più grande (~ 2 mm di diametro), e aspirare lentamente la sollecitazione di taglio di pipettaggio può facilmente distruggere GUVs. <ol><li> Per GUVs elettro-formato, aprire la camera di crescita rimuovendo delicatamente il vetrino superiore. Posizionare la punta della pipetta direttamente sopra ogni filo e aspirare ~ 50 ml mentre si muove la punta della pipetta lungo il filo per staccare i GUVs. NOTA: Può essere utile per ruotare il filo di raccogliere GUVs sul &quot;dall&#39;altra parte&quot; del filo. </li><li> Per GUVs &quot;gel assistita gonfiore&quot;, prima toccare il lato della capsula di Petri un paio di volte per aiutare i GUVs staccano dalla superficie coprioggetto. Posizionare il puntale appena sopra il vetrino e aspirare 50 ml mentre pulling la punta di nuovo sulla superficie. Direttamente trasferire GUVs raccolte ad una camera di osservazione, o conservare in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a 4 ° C per 1 settimana. </li></ol></li><li> Posizionare la camera di osservazione su un microscopio invertito, aggiungere i GUVs alla camera di osservazione, e attendere alcuni minuti per i GUVs di stabilirsi sul fondo della camera. </li><li> Indagine la camera con contrasto di fase o DIC per individuare rapidamente lisci, sferici («difetto liberi&quot;) &quot;candidati GUV&quot;. Esaminare ogni &quot;GUV candidato&quot; in epifluorescenza per escludere eventuali contenenti liposomi minori annidati dentro. Infine, verificare che l&#39;intensità di fluorescenza lipidica è uniforme e compatibile con una sola membrana (cioè, unilamellare). NOTA: In alcuni bilamellar (o multi-lamellari) vescicole, le membrane sono troppo vicini per essere risolti in modo che appaiono unilamellare in contrasto di fase o immagini DIC. Tuttavia, questi oggetti possono essere distinti da UNILAME realeGUVs Llar di loro fluorescenza dei lipidi, che è due volte (o più) più brillanti. </li></ol> 6. GUVs-Patch di serraggio <ol><li> Fai pipette di patch con un 1-2 micron punta di diametro in vetro borosilicato capillare standard utilizzando il programma consigliato per l&#39;estrattore pipetta. NOTA: trattamenti speciali come lucidatura fuoco non sono necessari, e pipette possono essere utilizzati per diversi giorni dopo che sono stati tirati se sono tenuti in una scatola chiusa. </li><li> Passivare la camera di incubazione con una soluzione di beta-caseina (5 mg / ml) per garantire che non aderiscono GUVs, diffondono e rottura sulle superfici della camera. Risciacquare la caseina dopo 5 min. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo di terra, riempire la camera con il tampone di osservazione, trasferire 10 ml di sospensione GUV come descritto al punto 5.2 e 5.3, e attendere alcuni minuti per i GUVs di stabilirsi sul fondo. </li><li> Riempire una pipetta di patch fresco con la soluzione (tampone di osservazione o un&#39;altra soluzione iso-osmotica) emontarlo dell&#39;amplificatore headstage patch-clamp. </li><li> Ricerca attraverso la camera di individuare un GUV &quot;senza difetti&quot;, come descritto nella sezione 5.4, e controllare che contiene la proteina fluorescente. </li><li> Applicare una costante pressione positiva (&gt; 100 Pa, o circa 1 cm H 2 O in un manometro) per mantenere la pipetta di patch interno pulito, e inserire la pipetta di patch nella camera. Portare la pipetta di patch nel campo di vista, applicare impulsi di prova per misurare / risarcire l&#39;offset e la resistenza di tensione pipetta, ed esaminare la pipetta sotto illuminazione fluorescente per confermare che la punta è pulito. </li><li> Portare la pipetta di patch verso il GUV, e se necessario, ridurre simultaneamente la pressione positiva in modo che il flusso verso l&#39;esterno dalla pipetta di patch non rende il GUV &quot;scappare&quot;. Quando la pipetta patch è vicino alla GUV, applicare una pressione negativa (fino a 5 cm H 2 O) per tirare la GUV contro la pipetta patch. Monitorare la resistenza come &quot;, La lingua &quot;della membrana GUV entra nella pipetta di patch e le forme gigaseal. </li><li> Se un gigaseal non formano, rimuovere la pipetta di patch dalla camera e tornare al punto 6.4. Se la patch di membrana formato un gigaseal, ma il GUV rimane attaccato alla pipetta, asportare la patch tirando dalla GUV, scoppiando il GUV contro il fondo della camera, o brevemente spostare la pipetta dalla soluzione. </li><li> Quando la patch membrana inside-out è stato asportato dal GUV e gigaseal è stabile, spegnere gli impulsi di prova e applicare un protocollo di tensione come quello mostrato in Figura 13. NOTA: Figura 13 segue la convenzione elettrofisiologico standard per una patch inside-out in cui la corrente che scorre nel patch-elettrodo è &quot;positivo&quot;, e bagno V = V - V pipetta. Tenendo la patch ad un potenziale negativo (ad esempio, V = -100 mV) per ~ 30 secondi posti KvAP in stato di riposo, mentre passi (100 msec a 5 sec) a potenziali più positivi (ad esempio, V = 100 mV) può quindi guidare in conduttivi (cioè, aperti) stati attivi. </li><li> Dopo misurazioni su un cerotto membrana sono finiti, rompere la patch con un impulso zapping o pressione e verificare che l&#39;offset dell&#39;elettrodo cerotto tensione non è spostata. Rimuovere la pipetta di patch dalla camera, e tornare al punto 6.4. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Sistemi modello biomimetici sono uno strumento importante per lo studio delle proprietà e le interazioni delle proteine ​​e delle membrane. Rispetto ad altri sistemi ricostituiti come BLM o membrane lipidiche supportati, GUV sistemi basati presenti diverse opportunità anche notevole controllo della composizione di membrana, la tensione e la geometria, oltre ad essere veramente senza olio. Tuttavia, incorporando proteine ​​transmembrana, come KvAP, in GUVs richiede adeguamenti significativi di protocolli conven...

Quando si studiano i principi fisici che governano i sistemi viventi, approcci bottom-up permettono uno sperimentatore di controllare la composizione del sistema e altri parametri che non sono facilmente manipolabili in sistemi basati su celle 1. Per i processi basati membrana, Giant unilamellari vescicole (GUVs, diametro ~ 1-100 micron) hanno dimostrato di essere un sistema molto utile biomimetico 2-7 in quanto sono adatti per gli studi di microscopia e micromanipolazione 8-10. Mentre ci sono molti protocolli diversi per produrre GUVs, la maggior parte rientrano in due categorie - emulsione a base avvicina 11,12 e tecniche basate su reidratante un film lipidico 13-16. Nei metodi basati emulsione, i volantini interni ed esterni delle membrane GUV sono assemblati sequenzialmente da monostrati lipidici alle interfacce acqua / olio. Questo approccio è ideale per incapsulare proteine ​​solubili connei GUVs, e per formare GUVs con asimmetrico composizione lipidica volantino. Tuttavia, GUVs formati da emulsioni possono conservano tracce di solvente che modificano le proprietà meccaniche della membrana 17, e l&#39;approccio non è particolarmente adatto a trans-membrana proteica ricostituzione. Metodi reidratazione Film basano sul fatto che l&#39;essiccazione (disidratazione) provoca molti miscele lipidiche a formare una pila multi-lamellare membrane. Se questo stack viene poi messo in contatto con un tampone acquoso, membrane della pila si sposteranno flussi a parte come solventi tra loro e sulla superficie della pila, singoli membrane possono staccarsi per formare GUVs 13,18 (così un vero e proprio zoo altri oggetti lipidiche). Tuttavia, anche per il tampone e lipidi composizioni ottimali, questo classico metodo di &quot;gonfiore spontaneo&quot; ha una relativamente bassa resa di GUVs prive di difetti. Un metodo ampiamente utilizzato per aumentare la resa di GUVs privi di difetti è &quot;electroformation221 ;, in cui si applica un campo di corrente alternata (AC) durante pellicola reidratazione. Mentre il meccanismo resta poco conosciuto, &quot;electroformation&quot; può dare rendimenti GUV spettacolari (&gt; 90% in circostanze favorevoli) per i buffer di concentrazione bassa di sale (&lt;5 mm) 14,19, e può anche lavorare in tamponi fisiologici (~ 100 mm) con una frequenza più alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e elettrodi di platino 15. Un approccio alternativo per aumentare la resa di GUVs senza difetti è &quot;gel assistita rigonfiamento&quot;, in cui la soluzione lipidica viene depositato su un substrato di gel polimerico piuttosto che passiva (ad esempio, di vetro, PTFE) substrati usati in classica &quot;gonfiore spontanea &quot;. Quando il film lipidico / gel risultante viene reidratato, GUVs possono rapidamente formare anche per i buffer fisiologici 16,20. Tutti questi metodi possono produrre solo GUVs lipidi che possono essere utilizzati per studiare membrana associata fenomeni come lainterazione tra proteine ​​solubili e le membrane. Tuttavia, a includere una proteina trans-membrana nella GUVs, sono necessarie modifiche significative per garantire che la proteina rimane in uno stato funzionale durante la procedura di ricostituzione. Mentre le soluzioni di lipidi in solventi organici (ad esempio, cloroformio, cicloesano) sono ideali per la produzione di film lipidici, proteine ​​transmembrana sono tipicamente stabile solo quando la loro idrofoba dominio trans-membrana viene incorporato in un doppio strato lipidico, o circondato da una micella detergente ( ad esempio, durante la purificazione della proteina). Così, il materiale di partenza per una ricostituzione è tipicamente membrane native, proteina purificata in una soluzione detergente, o piccole vescicole contenenti proteine ​​unilamellari (Proteo-SUV) e / o vescicole multi-lamellari (Proteo-MLV) formate da rimozione del detersivo nel presenza di lipidi. La maggior parte dei metodi per incorporare queste proteine ​​di membrana in GUVs rientrano in tre categorie. Diretta insertion: proteine ​​transmembrana sospeso nel detergente viene mescolato con preformati, lipidi-solo, GUVs solubilizzate leggermente detergenti, e il detersivo poi rimosso utilizzando biobeads 21. Mentre concettualmente semplice, questo metodo richiede un controllo preciso della concentrazione di detersivo, come troppo alta concentrazione di detersivo può sciogliere i GUVs mentre una concentrazione troppo bassa può causare la proteina di dispiegarsi o aggregata. GUV / Proteo-SUV Fusion: Proteine ​​in Proteo-SUV è combinato con preformati, lipidi soli GUVs e la fusione è facilitata con particolari peptidi fusogeniche 22 o detersivo 21. In genere il grado di fusione è limited portando a GUVs a bassa densità di proteine. Disidratazione / reidratazione: Un film lipidico contenente proteine ​​è formata mediante disidratazione parziale di un proteo-SUV (o Proteo-MLV) e soluzione GUVs vengono poi coltivata come un film lipidico pura. La sfida è ovvio per proteggere la proteina durante la dehydrati parzialiil passo 23, ma il metodo è stato utilizzato con successo per la ricostituzione delle proteine ​​trans-membrana, come batteriorodopsina, calcio-ATPasi, integrina e VDAC in GUVs 7,23 - 25. Questo articolo descrive i protocolli disidratazione / reidratazione per rendere GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP, dalla iper-termofila Archaea, Aeropyrum PERNIX. KvAP ha un alto grado di omologia con i canali del potassio voltaggio dipendenti eucariotiche 26 e una struttura cristallina nota 27 , il che rende un buon modello per studiare il meccanismo di tensione gating. Produzione di Proteo-SUV è stato descritto nel dettaglio in precedenza e non è parte di questo tutorial 26,28,29. È importante sottolineare che, KvAP Proteo-SUV non devono essere prodotte per ogni preparazione GUV, in quanto possono essere memorizzati in piccoli (ad esempio, 10 ml) aliquote a -80 ° C per lunghi periodi di tempo (&gt; 1 anno). Electroformationo gonfiore gel assistita può quindi essere utilizzato per far crescere GUVs dalle KvAP Proteo-SUV (o Proteo-MLV). I passi fondamentali per il protocollo electroformation sono illustrati nella Figura 1. Goccioline di una soluzione di SUV contenenti la proteina si depositano sui fili di platino (mostrati nella Figura 2). Disidratazione parziale della sospensione SUV porta alla formazione di un film lipidico proteine ​​mediante la fusione di SUV. Durante reidratazione, un campo AC viene applicata agli elettrodi per aiutare gli strati lipidici delaminazione e formare GUVs. Un campo 10 Hz funziona bene quando si usa &quot;basso contenuto di sale&quot; (&lt;5 mm) buffer di reidratazione 28 e GUVs richiedere diverse ore a crescere. Al contrario, i buffer fisiologici (contenente ~ 100 mM sale) lavorare bene con una tensione più bassa, 500 Hz campo AC ma richiedono un prolungato (~ 12 ore) gonfiore periodo 15. Questo metodo si basa su un protocollo precedente utilizzando ITO vetrini 24, ma utilizza una camera di cont personalizzatoaining due fili di platino, come illustrato nella figura 2 (vedi la discussione per i dettagli di design e suggerimenti per semplificare, camere improvvisato). La figura 3 illustra il metodo di soffiatura gel assistita. Il protocollo funziona bene con tamponi con concentrazioni saline fisiologiche, è rapido, e produce GUVs con una distribuzione più omogenea della proteina. Tuttavia, il rendimento di isolati, GUVs apparentemente difetto liberi (cioè, la membrana GUV è uniforme a lunghezza-righe ottiche e non racchiude oggetti) è inferiore, anche se fornisce un numero sufficiente di patch-clamp ed esperimenti micro-manipolazione . Questo metodo è basato su un protocollo utilizzando gel di agarosio per produrre solo lipidi GUVs 16 e richiede attrezzature meno specializzata rispetto al metodo electroformation. La caratterizzazione dei GUVs con microscopia a fluorescenza è descritto, così come procedure utilizzando uno standard patch-clamp set-up dimisurare l&#39;attività KvAP in &quot;inside-out&quot; escisse patch di membrana. Growing GUVs contenenti proteine ​​può essere più difficile che GUVs solo lipidi. In particolare, la resa finale può dipendere GUV sensibilmente esattamente come la soluzione SUV viene deposto e disidratato per formare la pila membrana. Per qualcuno senza alcuna precedente esperienza con GUVs, può essere utile a crescere prima GUVs solo lipidi seguendo un protocollo convenzionale 15,16 in cui il film membrana è formata depositando lipidi da un solvente organico. Una volta che il protocollo tradizionale funziona bene, SUV deposizione e disidratazione parziale possono essere masterizzati utilizzando SUV solo lipidi, che sono anche molto utile quando si regola il protocollo per una nuova composizione lipidica. Quando GUVs crescono in modo affidabile da SUV solo lipidi, è quindi solo un piccolo passo per la produzione di proteine ​​contenenti GUVs da Proteo-SUV.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Giant unilamellari vescicole (GUVs) sono un popolare sistema biomimetico per studiare membrana fenomeni associati. Tuttavia, comunemente usato protocolli di crescere GUVs devono essere modificati in modo da formare GUVs contenenti proteine ​​transmembrana funzionali. Questo articolo descrive due metodi disidratazione-reidratazione - electroformation e gonfiore gel assistita - per formare GUVs contenenti il ​​canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP. In entrambi i metodi, una soluzione di piccole vescicole unilamellari contenenti proteine ​​è parzialmente disidratato per formare una pila di membrane, che viene poi lasciata rigonfiare in un buffer reidratazione. Per il metodo electroformation, il film si deposita sugli elettrodi di platino in modo che un campo AC può essere applicato durante pellicola reidratazione. Al contrario, il metodo gonfiore gel assistita utilizza un substrato gel di agarosio per migliorare pellicola reidratazione. Entrambi i metodi possono produrre GUVs in (ad esempio, 100 mm) concentrazioni basse (ad esempio, 5 mm) e fisiologici di sale. I GUVs risultanti sono caratterizzati tramite microscopia a fluorescenza, e la funzione di canali ricostituiti misurate utilizzando la configurazione patch-clamp dentro-fuori. Mentre rigonfiamento in presenza di un campo elettrico alternato (electroformation) fornisce un alto rendimento di GUVs esenti da difetti, il metodo gonfiore gel assistita produce una distribuzione più omogenea della proteina e non richiede attrezzature speciali.

La crescita di GUVs può essere rapidamente valutata esaminando la camera di crescita al microscopio. Per electroformation, i GUVs tendono a crescere in grappoli lungo i fili di platino, come mostrato in Figura 4. Durante gonfiore gel assistita, GUVs appaiono come strutture sferiche che crescono rapidamente e si fondono insieme (Figura 5). GUVs senza difetti sono più facilmente individuati e valutati dopo il trasferimento ad una camera di osservazione. Misu...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Views.  Université Pierre et Marie Curie.  La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia. 

Video: Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Metodi per la registrazioni Morsetto capacità patch dal Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Esaminando BCL-2 Funzione Famiglia con grandi vescicole unilamellari

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...