Name: reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. 솔루션 준비 <ol><li> 5 mM의 KCl을, 1 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 트리스 (산도 7.5), 2 mM의 트레 할로 오스를 포함하는 &#39;SUV 버퍼&#39;5 mL를 준비합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 버퍼를 여과하고 -20 ℃에서 저장 될 수 1ml의 분취 량으로 나눈다. 참고 : 시약 및 장비에 대한 추가 세부 사항이 물질 목록에 나와 있습니다. </li><li> 영화 재수 동안 GUV 내부를 채울 것이다 GUV &#39;성장 버퍼&#39;40 ml의를 준비합니다. &#39;저염&#39;성장의 경우, 5 mM의 KCl을, 1 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 1 mM 트리스 (PH 7.5), 그리고 ~ 400 밀리미터 자당을 결합한다. &#39;생리 소금의 성장을 위해, 100 mM의 KCl을, 5 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 5 mM 트리스 (PH 7.5), 그리고 ~ 200 밀리미터 자당을 결합한다. </li><li> 100 mM의 KCl을 5 mM의 HEPES (PH 7.4), 5 mM 트리스 (PH 7.5) 및 ~ 200 mM의 글루코스를 조합하여 실험 챔버 외부 솔루션 &#39;관측의 버퍼 40㎖의 준비. 참고 :이 버퍼는 엑사 있습니다mples. 다른 실험에 대한 버퍼를 적응할 수있는 설명을 참조하십시오. </li><li> osmometer와 성장과 관찰 버퍼의 osmolarities을 측정합니다. GUVs가 용해 또는 관찰 챔버로 성장 실로부터 이송 될 때 붕괴되지 않도록 1 % 이내로 일치하도록 그들을 자당 또는 글루코오스의 과립을 추가한다. 참고 : 자당의 1 ㎜ (13.7 40ml의 당 MG) 또는 포도당 (40 ml를 당 7.2 mg)을 추가하는이 농도 범위에서 1 ~ mOsm하여 삼투압을 증가시킨다. </li><li> 0.2 μm의 필터로 성장과 관찰 버퍼를 필터 및 세균의 성장을 억제하기 위해 4 ℃에서 저장합니다. </li><li> GUVs가 스틱 확산 버스트 않도록 실험 챔버의 표면을 패시베이션하기 위해 필요한 5 ㎎ / ㎖ 베타 - 카제인 용액을 형성하는 20 mM TRIS (PH 7.5) 완충액 10ml에 베타 - 카제인 50mg을 녹인다. 베타 - 카제인 완전히 0.5 ml의 분취 량으로, 필터 (0.2 μm의) 정보 (39 ° C에서 몇 시간까지)에 용해되면 플래시 냉동 저장할 수있는나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 (4 ℃에서 보관 해동 된 분액 전형적 일주까지 사용할 수있다). </li></ol> 2. SUV 준비 <ol><li> 준비하고 이전에 발행 된 상세한 프로토콜 (28) 다음 proteo - 포드 SUV의 분량을 동결. KvAP 형광 (질량) 1:10 지질 비율로 단백질에 DPhPC SUV 차량으로 재구성 알렉사-488 말레이 미드 (10 ㎎ / ㎖)로 표지를 사용하십시오. 참고 : 야생 형 KvAP는 세포 내 C 말단 (아미노산 247) 근처에있는 단량체 당 하나의 시스테인이 포함되어 있습니다. </li><li> 형광등, 지질 전용 포드 SUV : 참고 : 니트릴 장갑과 보안경을 착용 흄 후드 클로로포름을 처리합니다. 클로로포름을 용해시킬 수있는 플라스틱의 사용을 피하십시오. 클로로포름 용액은 테플론 캡 호박색 유리 바이알에 저장 유리 주사기를 사용하여 전송 될 수있다. 이전과 지질을 피펫 팅 한 후 클로로포름으로 적어도 5-10 번 모든 유리를 씻어주의하십시오. <ol><li> 100 ㎕를 준비텍사스 레드 DHPE 용액 8.2 μL (1 ㎎ / ㎖로 DPhPC 용액 100 ㎕ (클로로포름 내의 10 ㎎ / ㎖)를 혼합하여 적색 형광 지질, 텍사스 레드 DHPE, 0.5 몰 %를 함유하는 10 ㎎ / ㎖ DPhPC SUV의 1.5 ml의 호박 유리 병)에 메탄올. </li><li> 바이알을 회전시키면서 화학 후드에서 질소 기류하에 지질을 건조. 영화는 건조로 표시되면, 잔류 용매를 제거하기 위해 3 시간 동안 진공 상태에서 지질을 배치합니다. </li><li> 지질에 SUV 버퍼의 100 μl를 추가하고, 소용돌이 적극적에는 지질은 유리 병의 벽에 붙어 남아 있지 않을 때까지 액이 균일하게 유백색이다. </li><li> SUV 차량을 형성하는 지질 용액을 초음파 처리. 초음파가 가장 움직임이 발생 될 때까지 병의 위치를​​ 조정하고 유리 병 내부의 흐름, 불필요하게 솔루션을 열주의 바랍니다. 가능하면 용액이 투명해질 때까지 초음파를 계속하거나, 투명 (팁 초음파 2-5 분 ~ 목욕 초음파 20 분). </li><li> Aliquot의 SUV 차량 (예를 들어, 10 μL, 20 μL)와 동결 (-20 ° C)에 대한 나중에 사용하기. 참고 : 지질, 특히 불포화 지질, 쉽게 고장. 아르곤에서 20 ° C (80 ° C)에서 보관 지질 솔루션 및 6 개월 이내에 사용한다. 지질 분해 산물을 박층 크로마토 그래피로 검출 할 수있다. </li></ol></li></ol> 전기 주조 3. GUV 성장 <ol><li> 전기 주조 챔버를 준비합니다. <ol><li> 챔버를 청소하지 않은 경우, 창문을 모두 제거 실란트와 기름을 닦아, 전선을 추출, 린스 물과 교대로 에탄올 (≥70 %)를 사용하여 조직과 챔버를 문질러. </li><li> 잘 전선을 문질러 아세톤에 전선 및 챔버 잠수함, 5 분 동안 초음파 처리. 조직이 다시 아세톤을 이용하여 모든 닦습니다. 5 분 동안 에탄올과 초음파 처리에 실을 넣어. </li><li> 관통 구멍 와이어를 삽입하여 챔버를 조립하고, 회전하고 아칸소 확인 와이어 닦아전자 깨끗한. 증류수 챔버 넣어 5 분 동안 초음파 처리하고, 질소 또는 공기의 흐름과 함께 챔버를 건조. </li></ol></li><li> SUV 버퍼에 3 ㎎ / ㎖ SUV 현탁액의 30 μl를 준비합니다. 단백질 함유 GUVs을 형성 proteo - 포드 SUV의 8 μl를 결합 (DPhPC 10 ㎎ / ㎖ KvAP 1시 10분), 형광 SUV 차량의 2 μL (10 ㎎ / ㎖ DPhPC, 0.5 몰 % TexasRed-DHPE)과 SUV의 20 μL 12.5 및 0.1 몰 % TexasRed-DHPE : 1의 지질 (질량) 비율에 최종 단백질을 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 버퍼. 적극적으로 솔루션을 섞는다. <ol><li> 또한, 단순히 형광 SUV 차량의 10 μl를 결합, 지질 전용 포드 SUV와 프로토콜을 연습 할 수있는 (10 ㎎ / DPhPC 0.5 몰 % TexasRed-DHPE ㎖)을 20 μL의 SUV 버퍼와. </li></ol></li><li> SUV 솔루션을 입금. <ol><li> 전선의 SUV 솔루션의 작은 (&lt;0.2 μL) 방울을 입금 2 μL 피펫 또는 5 μL 유리 주사기를 사용합니다. 약 1 ㎕의 용액을 따라 일련의 방울을 형성하는데 필요한와이어의 1cm. 방울 충분히 작고 충분히 그들이 만지거나 퓨즈하지 않는 것이 떨어져 있는지 확인합니다. </li><li> 증착 된 포드 SUV가 야외에서 30 분 ~에 대한 건조 시키십시오. 모든 상품이 정착되면 지질 보증금은 현미경으로 관찰하기 쉽게 때문에, 와이어를 회전 할 수 있습니다. 주 : SUV 차량이 충분히 건조되지 않으면 성장 버퍼가 추가 될 때 단백질을 손상시킬 수있는 너무 많은 건조하는 동안, 그들은 단지, 와이어 씻어있다. 습도는 건조 속도, 건조 시간 및 / 또는 습도에 영향 때문에 최적의 결과 (30)를 조정할 수있다. 전선의 지질 필름은 현미경으로 볼 수 있어야합니다. </li></ol></li><li> 챔버를 조립합니다. <ol><li> 상공 회의소 아래 인쇄 :이 틈없이 준수 있도록 챔버 바닥을 밀봉에 대해 세 개의 우물 주위의 챔버의 바닥에 진공 그리스를 적용하고 부드럽게 40mm X 22mm 커버 슬립을 눌러 주사기를 사용합니다. 챔버의 측면 (전선 출구)와 인감붙여 넣기를 밀봉. 세 개의 우물을 요약 챔버의 상부에 진공 그리스를 적용합니다. </li><li> 각 웰이 정상에 채워질 때까지 천천히 성장 버퍼를 추가합니다. 이 전극 떨어져 지질 필름을 벗겨 수있는 우물에서 솔루션의 빠른 움직임을 피하십시오. </li><li> 하단 커버 슬립을 제거 않도록주의하면서, 그리스에 부드럽게 상단 커버 슬라이드를 눌러 챔버를 닫습니다. 상단 커버 슬립의 가장자리에 버퍼의 방울을 제거하기 위해 조직을 사용합니다. 참고 :이 지질 필름이 전선에 남아 있는지 확인하기 위해 현미경 실을 검사 할 수있는 좋은 시간입니다. </li></ol></li><li> 두 악어 클립을 사용하여 와이어 신호 발생기를 연결한다. 낮은 / 높은 소금 버퍼 광장 (Vrms의)을 의미하는 주파수 (저 / 고 소금 버퍼 10 Hz에서 / 500 Hz의 정현파)를 설정하고 측정하고 0.7 / 0.35 V 루트에 전선에서의 전압을 조정하는 멀티 미터를 사용합니다. 형광 광으로부터 보호를 위해 알루미늄 호일로 덮고 챔버. t을 남겨주세요그는 GUVs 낮은 소금 버퍼 2 ~ 3 시간, 그리고 높은 소금 버퍼에 대한 12 시간 또는 O / N에 대한 성장합니다. </li><li> 발전기에서 챔버를 분리하고 조심스럽게 GUV 성장을 평가하기 위해 거꾸로 현미경에 놓습니다. 중간에 전선에서 GUVs를 분리 할 수​​있다 우물에 느린, 꾸준한 운동 또는 유체 흐름을 사용합니다. 참고 : 아무 곳이나 전선의 아래쪽에 GUVs는 표면 형광로 볼 수 있습니다 동안 와이어 가장자리에 GUVs는 위상차 (40 배 긴 작동 거리 목적)에서 일반적으로 볼 수 있습니다. 더 GUVs 볼 수없는 경우, 상부면을보고 전선을 돌려보십시오. GUVs 며칠 동안 성장 챔버에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 젤 이용한 붓기 4. GUV 성장 <ol><li> 순수한 물 10 mL로 100 mg의 아가로 오스를 혼합하여 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖를 준비한다. 그것이 ~ 20 초 동안 480 W에서 전자 레인지에 배치하여 끓을 때까지 가열한다. 아가로 오스가 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 저어. 참고 :이 솔루션4 ° C에 저장하고 필요할 때 다시 가열 될 수있다. </li><li> 플라즈마 청소 (에어 플라즈마) 아가로 오스 솔루션이 멋지게 확산되도록 1 분의 커버 슬라이드. 플라즈마 세정의 효과가 빨리 닳아으로 다음 15 분 이내에 커버 슬라이드를 사용합니다. </li><li> 전체 표면을 적시 솔루션 있도록 각 22 X 22mm 2 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 솔루션 200 μl를 적용합니다. 수직 슬라이드를 기울여 물기를 제거하고 슬라이드에 아가로 오스의 단지 얇은 부드러운 층을 떠날 조직에 하단을 터치합니다. </li><li> 60 ° C에서 핫 플레이트 또는 오븐에 슬라이드를 삽입하고 적어도 30 분 동안 건조 둡니다. 아가로 오스 필름은 눈에 거의 볼 수 있습니다. 슬라이드를 실온으로 냉각 한 후, 즉시 사용하거나 4 ° C에서 밀폐 용기에 1 주일까지 저장합니다. </li><li> 표준 3.5 cm 페트리 접시에 아가로 오스 코팅 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 3.2 절과 SUV 솔루션을 준비하고 적용 ~ SUV 용액 (3 ㎎ / ㎖ 지질)에 15 μL~ 아가로 오스 표면에 30 아주 작은 방울 부드럽게. 너무 많은 아가로 오스 층을 왜곡하지 않도록주의하십시오. </li><li> 약 10 ~ 15 분 동안 질소의 부드러운 흐름에서 슬라이드를 놓고 방울 건조로 눈으로 버퍼의 증발을 따릅니다. </li><li> 즉시 건조 SUV 차량 것처럼, 슬라이드면을 덮도록 성장 버퍼를 추가한다. 작은 3.5 cm 페트리 접시 사용 버퍼의 ~ 1 ml의하십시오. </li><li> 붓기는 30 분 ~ 동안 진행 한 후 위상차 또는 차동 간섭 대비 (DIC)과 거꾸로 현미경을 사용하여 실 GUVs의 성장을 검사 할 수 있습니다. 주 : 표면 형광 관측으로 인해, 아가 로스 겔의 자동 형광 강한 형광의 배경으로 어렵다. </li></ol> 5. 수확 및 관측 GUVs <ol><li> 관찰 챔버 (예를 들어, 작은 페트리 접시 또는 유리 커버 슬립) GUVs 스틱하지 않도록, 확산 챔버 바닥에 버스트 보호막을. 참 커버BER 베타 - 카제인 용액과 바닥은, 5 분 동안 부화 공기 또는 질소 스트림으로 건조 순수한 물 카제인 용액을 씻어 내고, 마지막 관찰 완충액 추가 (예를 들면, ~ 작은 배양 접시에 5 mm 깊이). </li><li> GUVs을 수확. 오프닝이 더 큰 (~ 2mm 직경) 그래서 100 μL 피펫 팁의 끝을 잘라 쉽게 GUVs를 파괴 할 수 피펫의 전단 응력으로 천천히 열망. <ol><li> 전기 형성 GUVs를 들어, 부드럽게 상단 커버 슬립을 제거하여 성장 챔버를 엽니 다. GUVs를 분리 와이어를 따라 피펫 팁을 이동하는 동안 ~ 각 전선 및 흡인 바로 위에 50 μl를 피펫 팁을 놓습니다. 주 : 와이어의 &quot;다른 쪽&quot;에 GUVs를 수집하는 와이어를 회전하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> &quot;젤 이용한 붓기&quot;GUVs를 들어, 첫 번째 GUVs가 커버 슬립 표면에서 분리하는 데 도움이되는 몇 번 페트리 접시의 측면을 누릅니다. P 동안 50 μL 단지 커버 슬립과 흡인 위의 피펫 팁의 위치를다시 표면 위에 팁을 ulling. 직접 최대 1 주일 동안 4 ° C에 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 관찰 챔버, 또는 저장소에 수확 GUVs을 전송합니다. </li></ol></li><li> , 거꾸로 현미경에서 관찰 챔버를 놓고 관찰 챔버에 GUVs을 추가하고 GUVs 챔버 바닥에 정착 몇 분을 기다립니다. </li><li> 빠르고 부드러운, 구형 ( &#39;무 결함&#39;) &quot;GUV 후보&quot;를 찾습니다 위상 대비 또는 DIC와 챔버를 조사. 내부 중첩 된 모든 포함하는 작은 리포좀을 제외 표면 형광의 각 &quot;GUV 후보&quot;를 검사합니다. 마지막으로, 지질 형광 강도가 단일 막 (즉, 단일 층)와 균일하고 호환되는지 확인합니다. 참고 : 그들은 위상 대비 또는 DIC 이미지에서 단일 층 나타나도록 일부 bilamellar (또는 다중 층상) 소포에서, 멤브레인은 해결 될 너무 가까이 있습니다. 그러나, 이들 객체는 실제 unilame 구별 될 수있다두 번 (또는 그 이상)의 밝은 자신의 지질 형광에 의해 llar GUVs. </li></ol> 6. 패치 클램핑 GUVs <ol><li> 피펫 풀러 추천 프로그램을 사용하여 표준 붕규산 모세관 유리에서 1-2 μm의 팁 직경 패치 피펫을 확인합니다. 참고 : 화재 연마 같은 특수 치료가 필요하지 않으며, 피펫은 그들이 닫힌 상​​자에 보관하는 경우가 당겨 한 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. </li><li> GUVs가 부착 챔버 표면 상에 확산되고 파열되지 않도록 베타 - 카제인 용액 (5 ㎎ / ㎖)로 배양하여 챔버 보호막. 5 분 후 카제인을 씻어. </li><li> 접지 전극을 삽입 관찰 버퍼 챔버를 작성 단계 5.2 및 5.3에 설명 된대로 GUV 현탁액의 10 μl를 전송하고, GUVs가 바닥에 정착 몇 분을 기다립니다. </li><li> 솔루션 (관찰 버퍼 또는 다른 삼투압 용액)와 신선한 패치 피펫을 입력하고패치 클램프 증폭기 headstage에 마운트. </li><li> 챔버를 통해 검색 5.4 절에 설명 된대로 &quot;무 결함&quot;GUV을 찾은이 형광 단백질이 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 일정한 양의 압력 적용 (&gt; 100 파를, 또는 약 1cm 압력계의 H 2 O) 깨끗 한 인테리어 패치 피펫을 유지하고, 챔버에 패치 피펫을 삽입합니다. 시야에 패치 피펫을 가져와 / 측정 오프셋 및 저항 피펫 전압을 보상하고, 끝이 깨끗한 지 확인하기 위해 형광 조명 아래 피펫을 검사 테스트 펄스를 적용합니다. </li><li> GUV으로 패치 피펫을 지참하고, 필요한 경우 동시에 &quot;도망&quot;GUV을하지 않는 패치 피펫에서 바깥쪽으로 흐름 있도록 긍정적 인 압력을 줄일 수 있습니다. 패치 피펫 GUV에 가까운 경우, 패치 피펫에 대한 GUV를 당겨 (5cm H 2 O까지) 부압을 적용합니다. 같은 저항을 모니터 &quot;; GUV 막 혀 &quot;패치 피펫과 기가 시일 형태로 들어갑니다. </li><li> 기가 시일이 형성되지 않은 경우, 챔버에서 패치 피펫을 제거하고 6.4 단계로 돌아갑니다. 막 패치가 기가 시일을 형성하지만, GUV가 피펫에 부착 된 상태로 유지하는 경우, GUV 떼어 파열 GUV을 실 바닥에, 또는 간단히 솔루션에서 피펫을 이동하여 패치를 절제. </li><li> 인사이드 - 아웃 막 패치 GUV로부터 잘라 내고 기가 시일이 안정되면, 시험 펄스를 스위치 오프 및도 13에 도시 한 바와 같이 전압 프로토콜을 적용한다. 참고 : 그림 13은 현재 패치 전극에 흐르는 &quot;긍정적&quot;인 내부 아웃 패치에 대한 표준 전기 생리학 규칙을 따르며, V = V 목욕 - V 피펫. 음의 전위 패치를 잡고 (예를 들어, V = -100 MV) 휴식 상태에서 ~ 30 초 장소 KvAP을위한 단계 동안 (10긍정적 인 전위 (예를 들어, V = 100 MV)이 다음 실시 (즉, 개방) 활성 상태로 구동 할 수있는 5 초에 0 밀리 초). </li><li> 막 패치에 대한 측정을 완료 한 후, 보내 겠 또는 압력 펄스로 패치를 끊고 패치 전극의 오프셋 전압이 표류하지 않았 음을 확인합니다. 챔버에서 패치 피펫을 제거하고 6.4 단계로 돌아갑니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

생체 모방 모델 시스템은 단백질과 세포막의 특성과 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구입니다. BLMs 또는 지원 지질막과 같은 다른 재구성 시스템에 비해 GUV 시스템에게 상당한 막 조성, 긴장과 형상 제어뿐만 아니라 진정되는 오일 프리를 포함하여 현재 여러 기회를 기반으로. 그러나 GUVs로, 같은 KvAP으로 횡단 단백질을 포함하는 지질 전용 GUVs에 대한 기존의 프로토콜의 상당한 적응을 필요?...

살아있는 시스템을 지배하는 물리적 원리를 연구하면, 상향식 접근법 실험가 시스템 조성물 쉽게 셀 기반 시스템 (1)에 조작되지 않은 다른 매개 변수를 제어 할 수있다. 10 - 그들은 현미경 연구 및 미세 조작 8에 적합하다로 7 - 멤브레인 기반 프로세스의 경우, 거대한 단일 층 소포 (GUVs, 직경 ~ ~ 100 μm의)는 매우 유용한 생체 모방 시스템 2를 입증했다. GUVs을 생산하는 여러 가지 프로토콜이 있지만, 대부분은 두 가지 범주로 구분 - 16 - 기반 에멀젼은 지질 필름 (13)을 재수에 따라 11, 12 및 기술에 접근한다. 에멀젼 계 방법에서, GUV 막의 내측과 외측 소엽 물 / 오일 계면에서 지질 단층으로부터 순차적으로 조립된다. 이 접근 방식과 수용성 단백질을 캡슐화에 이상적입니다GUVs, 그리고 비대칭 전단지 지질 조성 GUVs을 형성. 그러나, 에멀젼으로부터 형성된 GUVs 멤브레인의 기계적 특성을 변경 (17) 용매의 흔적을 유지할 수 있고, 방법은 트랜스 멤브레인 단백질 재구성에 특히 적합하지 않다. 필름 재수 방법 (탈수)에 의한 건조 막의 다중 층상 스택을 형성하기 위해 많은 지질 혼합물을 유발한다는 사실에 의존한다. 이 스택이어서 수성 완충액으로 접촉하여 배치되는 경우, 스택 막은 그들 사이 스택의 표면에서 떨어져 용매 흐름을 이동 개별 막은 GUVs 13,18 (도 전함 동물원을 형성하도록 분리 할 다른 지질 개체). 그러나, 최적의 버퍼와 지질 조성에 대해,이 고전 &quot;자연 붓기&quot;방법은 결함이없는 GUVs의 상대적으로 낮은 수율을 가지고있다. 무 결함 GUVs의 수율을 향상하기위한 한 방법은 널리 사용되는 &quot;전기 주조 인교류 (AC) 필드가 막 중에 수분 공급 적용한 221 ;,. 메커니즘이 제대로 이해 남아있는 동안, &quot;전기 주조&quot;아름다운 GUV 수익률을 제공 할 수 있습니다 (&gt; 유리한 상황에서 90 %) 낮은 소금 농도 버퍼 (&lt;5 mM)을 14,19, 심지어 (~ 100 mM)을 생리 학적 버퍼에서 작업 할 수 사용 더 높은 주파수 (10 Hz에서 500 Hz로 대) AC 필드 백금 전극 (15). 무 결함 GUVs의 수율을 높일 수있는 대안이되는 지질 용액 (예, 유리, PTFE) 기판이 클래식 &quot;자발적 팽창에 사용보다는 수동보다는 중합체 겔 기판 상에 증착되며,&quot;겔 - 보조 팽윤 &quot;입니다 &quot;. 얻어진 지질 / 겔 막을 재수되면 GUVs 급속 심지어 생리 버퍼 16, 20에 대해 형성 할 수있다. 이러한 모든 방법들은 같은 멤브레인 관련된 현상을 연구하는데 사용될 수있는 전용 GUVs 지질을 생산할 수있다수용성 단백질과 세포막 사이의 상호 작용. 그러나 GUVs로 트랜스 막 단백질을 포함하는, 상당한 변형 단백질 재구성 절차 내내 작동 상태로 유지되도록 요구된다. 유기 용매 (예, 클로로포름, 시클로 헥산)에 지질 용액은 리피드 필름의 제조에 적합하지만 소수성 트랜스 멤브레인 도메인이 지질 이중층에 내장되거나 세제 미셀에 의해 포위되는 경우, 트랜스 멤브레인 단백질은 전형적으로 안정 ( 예를 들어, 단백질 정제 동안). 이와 같이, 재구성을위한 출발 물질은 통상적 세제를 제거함으로써 형성 네이티브 막, 세제 용액 중의 정제 된 단백질, 또는 작은 단일 라멜라 단백질 - 함유 소포 (proteo-의 SUVs) 및 / 또는 멀티 라멜라 베 시클 (proteo-MLVs) 인 지질의 존재. GUVs에 이러한 막 단백질을 포함하는 대부분의 방법은 세 가지 범주로 분류된다. 직접 InsertioN : 세제 현탁 트랜스 멤브레인 단백질이 예비 형성된 지질 단지 약간 용해 GUVs 세제와 혼합 한 후 biobeads 세제 (21)를 사용하여 제거된다. 개념적으로 단순하지만,이 방법은 너무 높은 세정제 농도는 단백질 농도가 전개 또는 응집의 원인이 너무 낮 동안 GUVs을 용해 할 수있는 바와 같이, 세제 농도의 정밀 제어를 필요로한다. GUV / Proteo-SUV 퓨전 : proteo - 포드 SUV의 단백질은 미리 형성, 지질 전용 GUVs와 결합 및 융합 특별한 융해 펩티드 (22) 또는 세제 (21)와 용이하게된다. 일반적으로 융합의 정도가 낮은 단백질 밀도 GUVs을 선도 제한됩니다. 탈수 / 재수 : 단백질 함유 지질 필름 부분 proteo-SUV의 탈수 (또는 proteo-MLV) 솔루션과 GUVs에 의해 형성된다은 순수한 지질 필름으로 성장하고 있습니다. 명백한 도전 부분 dehydrati 동안 단백질을 보호하기위한 것이다25 - 23 단계 있지만 방법에서 성공적으로 GUVs 7,23 박테리오로돕신 예컨대 칼슘 ATP 아제, 인테그린 VDAC와 같은 트랜스 막 단백질을 재구성하는 데 사용되어왔다. 이 문서는 하이퍼 고온 성 고세균, 에로 피 룸속의 pernix에서 전압 개폐 칼륨 통로, KvAP을 함유 GUVs 있도록 탈수 / 재수 프로토콜을 설명한다. KvAP 진핵 전압 의존성 칼륨 채널 (26)에 높은 상 동성 및 공지 된 결정 구조를 갖는 27 전압 게이팅의 메커니즘을 공부 그것에게 좋은 모델을 만들기. proteo-SUV 차량의 생산 이전에 상세하게 설명이 튜토리얼 26,28,29의 일부가되었습니다. 중요한 KvAP의 proteo-한 SUV들이 장시간 (&gt; 1 년)에 대해 -80 ° C에서 작은 (예를 들면, 10 μL) 분취 액에 저장 될 수 있으므로, 각 GUV 제제에서 제조 할 필요가 없다. 전기 주조또는 겔을 이용한 붓기는 KvAP의 proteo - 포드 SUV에서 GUVs을 성장하는 데 사용 (또는 proteo-MLVs) 할 수 있습니다. 전기 주조 프로토콜의 핵심 단계는도 1에 도시되어있다. 단백질을 포함 SUV 차량 용액의 방울 (도 2에 도시), 백금 와이어 상에 증착된다. SUV 현탁액 부분 탈수 SUV 차량의 융합을 통하여 지질 단백질 막의 형성을 유도. 재수 화 동안 AC 필드 GUVs을 박리하고 형성하는 지질 층을 돕기 위해 전극에인가된다. &quot;저염&quot;를 사용하는 경우 10 Hz의 필드가 잘 작동 (&lt;5 mM)을 재수 버퍼 (28)와 GUVs는 몇 시간이 걸릴 성장합니다. 대조적으로, 생리 학적 완충액은 낮은 전압, 500 Hz의 AC 필드에서 잘 작동하지만, 필요 (~ 100 mM의 염을 포함하는) 장기간 (~ 12 시간) 동안 15 팽윤. 이 방법은 ITO (24)를 슬라이드하여 초기 프로토콜에 기초하지만, 맞춤 챔버를 계속 이용한다그림 2와 같이 두 개의 백금 와이어를 aining (간단한을위한 설계 세부 사항 및 제안 사항에 대한 설명을 참조하십시오, 챔버를 즉석에서). 도 3은 보조 팽윤 겔 방법을 나타내는 도면. 이 프로토콜은, 생리 소금 농도 버퍼와 함께 잘 작동 신속하고,보다 균일 한 단백질 분포 GUVs을 생산하고 있습니다. 그러나, 절연, 분명히 결함이없는 GUVs의 수율 (즉, GUV 막은 균일 한 광 길이 규모에 있고, 어떤 물체를 동봉하지 않음)에서 패치 클램프 및 마이크로 조작 실험에 충분한을 제공하지만, 낮은 . 이 방법은 지질 전용 GUVs 16을 제조하고 전기 주조 방법보다 덜 특수한 장비를 필요로 아가 로스 겔을 사용하는 프로토콜에 기초 하였다. 형광 현미경과 GUVs의 특성은 표준 패치 클램프 설정 최대를 사용하는 절차뿐만 아니라, 설명&quot;인사이드 아웃 (inside-out)&quot;에 KvAP 활동을 측정 멤브레인 패치를 절제. 성장 단백질 함유 GUVs 지질 전용 GUVs보다 더 어려울 수 있습니다. 특히, 최종 GUV 수율은 막 스택을 형성하는 방법을 정확히 SUV 용액이 증착되고, 탈수에 민감하게 의존 할 수있다. GUVs와 이전의 경험이없는 사람의 경우, 제 막 필름이 유기 용매로부터 지질을 증착함으로써 형성되는 종래의 프로토콜 15,16 다음 지질 GUVs 만 성장하는 것이 도움이 될 수있다. 기존의 프로토콜이 잘 작동되면, SUV의 증착 및 부분적인 탈수는 새로운 지질 조성물 프로토콜을 조정할 때 매우 유용 지질 전용 SUV 차량을 사용하여 마스터 할 수 있습니다. GUVs 지질 전용 SUV 차량에서 안정적 성장할 때 proteo-SUV의 발 - 함유 단백질을 생산하는 GUVs 단지 작은 단계 후이다.

<table><tbody><tr><td>DPhPC (1,2-diphytanoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>Egg PC L-&amp;alpha;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>840051P</td><td></td></tr><tr><td>Egg PA L-&amp;alpha;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>840101P</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&amp;Delta;9-&lt;em&gt;cis&lt;/em&gt;) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (ovine wool, &gt;98%)&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids&amp;nbsp;</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>TRed-DHPE</td><td>Invirtogen</td><td>T-1395MP</td><td>labeled lipid</td></tr><tr><td>BPTR-Ceramide</td><td>Invirtogen</td><td>D-7540&amp;nbsp;</td><td>labeled lipid</td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>VWR</td><td>20066.296</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>AnalaR Normapur</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringes&amp;nbsp;</td><td>Hamilton Bonaduz AG</td><td></td><td>diverse</td></tr><tr><td>Amber vials and Teflon cups</td><td>Sigma</td><td>SU860083 and SU860076</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>diverse</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Euromex</td><td>LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma</td><td>T9531-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Euromex</td><td>EU0011-A</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Wescor</td><td>Vapro</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Schott instruments</td><td>Lab850</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elmasonic</td><td>S 180 H</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sartorius steim</td><td>Minisart 16532</td><td></td></tr><tr><td>Function generator</td><td>TTi</td><td>TG315</td><td></td></tr><tr><td>Platinum wires</td><td>Goodfellow</td><td>LS413074</td><td>99.99+%, d = 0.5 mm</td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene</td><td>Goodfellow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning &#039;high vacuum grease&#039;</td><td>VWR</td><td>1597418</td><td></td></tr><tr><td>sealing paste</td><td>Vitrex medical A/S, Denmark</td><td>REF 140014</td><td>Sigillum Wax</td></tr><tr><td>Cover slides 22 x 40 mm No1.5</td><td>VWR</td><td>631-0136</td><td></td></tr><tr><td>Cover slides 22 x 22 mm No1.5</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td>airplasma, setting &#039;high&#039;</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcon BD</td><td>REF 353001</td><td>3.5 cm x 1 cm</td></tr><tr><td>patch clamp amplifier</td><td>Axon instruments</td><td>Multiclamp700B</td><td></td></tr><tr><td>DAQ Card</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td>version 8.6</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipettes boro silicate OD 1&amp;nbsp;mm ID 0.58&amp;nbsp;mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>Q45W-T10P</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P-2000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>ProSilica&amp;nbsp;</td><td>GC1380</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>40X long working distance, Phase contrast</td></tr><tr><td>Objective&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>100X Plan-Apochromat NA 1.3</td></tr><tr><td>Filterset GFP (for Alexa-488)</td><td>Horiba</td><td>XF100-3</td><td></td></tr><tr><td>Filterset Cy3 (for TexasRed)</td><td>Horiba</td><td>XF101-2</td><td></td></tr><tr><td>beta-casein</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C6905-1G</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon Eclipse TE 2000-E</td><td></td><td>D-Eclipse C1 confocal head</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 100X NA 1.3</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>for image processing and analysis of the current traces</td></tr></tbody></table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

거대한 단일 층 소포 (GUVs)는 멤브레인 관련 현상 연구를위한 인기있는 생체 모방 시스템이다. 그러나, 일반적으로 트랜스 GUVs 기능적 단백질을 함유 GUVs 형성하기 위해 수정되어야 성장 프로토콜을 사용했다. 전기 주조 및 겔을 이용한 붓기 - - 전압 - 문이 칼륨 채널, KvAP를 포함 GUVs을 형성하기 위해이 문서에서는 두 탈수 수분 보충 방법을 설명합니다. 두 방법 모두에서, 단백질 - 함유 작은 단층 라멜라 소포 용액을 재수 버퍼 팽윤시킨다 막 스택을 형성하기 위해 부분적으로 탈수된다. AC 필드 막 재수 동안에인가 될 수 있도록 전기 주조 방법의 경우, 필름은 백금 전극 상에 증착된다. 대조적으로, 보조 팽윤 겔 방법은 막 재수 향상 아가 로스 겔 기판을 사용한다. 두 방법 (예를 들어, 5 mM)을 낮은 생리 (예를 들어, 100 mM)을 소금 농도 GUVs를 생성 할 수 있습니다. 얻어진 GUVs는 형광 현미경을 통해 특성화되고, 재구성 된 채널의 기능은 인사이드 아웃 (inside-out) 패치 - 클램프 구성을 사용하여 측정. 교번 전계 (전기 주조)의 존재 하에서 팽윤 무 결함 GUVs의 고 수율을 제공하는 동안, 보조 팽윤 겔 방법은보다 균일 한 분포 단백질을 생산 및 특별한 장치를 필요로하지 않는다.

GUVs의 성장을 현미경으로 신속하게 성장 실을 조사함으로써 평가 될 수있다. 전기 주조를 들어 GUVs도 4에 도시 된 바와 같이, 백금 와이어 다발을 따라 성장하는 경향이있다. 겔 - 보조 팽윤 중에 GUVs 빠르게 성장하고 (그림 5)이 함께 융합 구형 구조로 나타난다. 결함이없는 GUVs보다 쉽게​​ 파악하고 관찰 챔버에 전송 한 후 평가됩니다. 캘리브레이?...

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Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K 조회수.  Université Pierre et Marie Curie.  전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다. 

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

연구

생물학

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

화학

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

생체공학

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...