Nous remercions Bryan Venema et Eric Martinson pour la construction de l&#39;appareil de électroformation. Ce travail a été financé par des subventions des Instituts des sciences médicales générales de la National Institutes of Health National (R01GM100718 à SEG) et l&#39;Institut national de la National Institutes of Health des yeux (R01EY017564 à SEG).

1. Dépôt de lipides parmi les solvants organiques: protocole classique <ol><li> Éliminer les lipides de stockage à -20 ° C ou -80 ° C, réchauffer à température ambiante. Attention: les lipides sont très hygroscopiques, et beaucoup sont sensibles à l&#39;oxygène. Couvrir lipides dans l&#39;argon sec ou gaz azote et à toutes les étapes de minimiser l&#39;exposition à l&#39;air. </li><li> Si nécessaire, suspendre les lipides dans le chloroforme ou le cyclohexane à mg / ml 1-10; noter que les concentrations indiquées par le fabricant sont généralement nominale seulement ATTENTION: Porter des gants appropriés et d&#39;autres équipements de protection individuelle lors de l&#39;utilisation de solvants organiques.. Retirez le PPE rapidement si solvant est déversé sur eux, comme la plupart des matériaux sont encore perméables à ces solvants et ils ne fournissent qu&#39;une protection temporaire. </li><li> Nettoyez les deux côtés de deux 25 37,5 mm ITO lames de verre enduites x avec de l&#39;éthanol </li><li> Mélanger les lipides pour atteindre les ratios molaires souhaités. Pour chaque 1 cm 2 de surface de l&#39;ITO coulisse à revêtir avec la lèvreid, mélange ~ 15-20 mg de lipides. Par exemple, si les deux 25 x 37,5 diapositives mm devaient être entièrement recouvert, nous aurions utilisent généralement 30 ul de 10 mg / mélange lipidique ml. Remarque: ajouter 0,1% en moles Texas Red-DPPE pour l&#39;imagerie de fluorescence, et voir ci-dessous met en garde les colorants fluorescents. </li><li> Vérifiez que le côté enduit ITO des lames de verre est orientée vers le haut par la mesure de la résistance de surface avec un ohmmètre ou un multimètre. </li><li> Aspirer les lipides dans un solvant résistant à la seringue. Attention: Pas de colles ou de matières plastiques, autres que PTFE, doivent communiquer avec le solvant organique. </li><li> Avec l&#39;aiguille de la seringue n&#39;est pas tout à fait de toucher la surface d&#39;ITO, appliquer doucement le lipide déplacer l&#39;aiguille et d&#39;autre de la glissière. Couvrez la surface de manière aussi uniforme, à la recherche d&#39;un «éclat Rainbow&quot; sur la surface du verre. </li><li> Placer les lames rapidement sous &lt;1 Torr (1 mmHg) vide pendant 0,5-1 heures pour éliminer toute trace de solvant. Relâcher vide avec un gaz inerte. </li><li> Appliquer un joint de silicone, avec unefine couche de graisse à vide de silicone sur les deux côtés. Laisser au moins 5 mm de la lame exposée non recouverte d&#39;un côté de la glissière. </li><li> Procéder immédiatement à la section 4. </li></ol> 2. Petit Préparation des liposomes pour déshydratation contrôlée <ol><li> Préparer le mélange de lipides que dans les étapes 1.1 à 1.4. </li><li> Sécher les lipides en utilisant un courant d&#39;argon ou de l&#39;azote gazeux dans un tube de culture de diamètre de 10-15 mm. Pour les petites quantités de lipides, ≤ 0,5 mg, le film qui en résulte peut être hydraté directement après l&#39;avoir placé sous vide pendant 0,5-1 heures pour éliminer le solvant résiduel, passez à l&#39;étape 2.5. De plus grandes quantités de lipides ont tendance à piéger les solvants organiques en un gel épais, même sous vide, et sont mieux préparés par lyophilisation; voir les étapes 2.3-4. </li><li> Suspendre le film lipidique séché dans le cyclohexane, le couvercle à l&#39;Argon et sceller avec un bouchon, placer le tube dans un bloc froid et le gel à -80 ° C pendant 1 heure minimum. </li><li> Placer le bloc froid et de l&#39;échantillon de lipide dans un système de videcapable d&#39;atteindre 100 mTorr. Appliquer le vide, il sera «décrochage» à environ 1 Torr comme sublimes solvant de congé. Une fois solvant est complètement enlevé (~ 1 heure) vide descend en dessous de ce niveau. Relâchez vide avec un gaz inerte et sceller le tube ou hydrate immédiatement. </li><li> Alors que les lipides sont sous vide, tampon d&#39;hydratation Degas utilise vide et barbotage 15-17. </li><li> Hydrater les lipides en utilisant un tampon dégazée à une concentration finale 1-10 mg / ml. Autoriser les lipides pour hydrater doucement. Après 30 min-1 heure, vortex pour briser les mottes restantes. Attendre une 0,5-1 heures supplémentaires pour permettre une hydratation complète. Utiliser un osmoticant, tels que le sorbitol ou le saccharose jusqu&#39;à 200 mm, pour éviter la déshydratation complète dans les étapes ci-dessous. </li><li> Préparer 100-200 liposomes nm de diamètre par extrusion. Consultez le protocole d&#39;extrusion du fabricant pour plus de détails. Notez que le tampon doit avoir moins de ~ mM force ionique 25 ou protocoles spéciaux de tension électroformation seront nécessaires dans la section 4. </li></ol> 3.Dépôt de lipides par déshydratation contrôlée de petits liposomes <ol><li> Attention: Notre protocole nécessite lipides pour être placés dans l&#39;équilibre vapeur avec des solutions salines saturées pendant de nombreuses heures. Nous vous recommandons vivement d&#39;effectuer le protocole dans une atmosphère de gaz inerte, en utilisant une boîte à gants ou un endroit similaire. </li><li> Attention: Si la préparation des échantillons contenant des protéines, éviter la déshydratation complète. Hydratez l&#39;atmosphère dans une enceinte avec un gobelet d&#39;eau tiède, ou un humidificateur à base d&#39;ultrasons. Utilisation d&#39;un hygromètre pour assurer qu&#39;il ya au moins 30% d&#39;humidité relative. Utilisez le sorbitol ou le saccharose dans le petit tampon liposome comme une précaution supplémentaire pour éviter la déshydratation totale. </li><li> Préparer une solution de sel saturée d&#39;humidité relative approprié. humidité cible dépend de l&#39;osmolarité de la préparation de vésicules. Pour les préparations avec osmolarité physiologique, utiliser 30-45% d&#39;humidité relative, tandis que de faibles préparations de vésicules d&#39;osmolarité peuvent être suffisamment déshydratééquilibre avec 75-90% d&#39;humidité relative (voir aussi tableau 1). </li><li> Mettez la solution saturée de sel et l&#39;excès de sel dans un récipient hermétiquement scellé avec une tablette intérieure. Contenants d&#39;aliments commerciaux pour le yogourt et granola fonctionnent très bien. Remplacer le plateau après le remplissage, et assurez-vous fluide est de 5-10 mm en dessous de la tablette. </li><li> Nettoyer les lames recouvertes d&#39;ITO de l&#39;article 1. Utilisez le multimètre pour déterminer de quel côté est conducteur, et d&#39;étiqueter le côté non-conducteur avec le nom de l&#39;échantillon. </li><li> Graisser légèrement deux côtés de l&#39;(USP classe VI) joint en silicone (s) avec un ou plusieurs trous. </li><li> Placez le côté conducteur de diapositives sur le banc, et appliquer le joint silicone (s) à chaque diapositive à laquelle lipidique sera appliqué, s&#39;assurer qu&#39;il ya au moins 5 mm de lame exposée à une extrémité pour se connecter à l&#39;appareil de électroformation. Lisser le joint d&#39;étanchéité pour assurer une bonne étanchéité. </li><li> Diluer la préparation de vésicules dans un tampon pauvre en sel iso-osmotique à ~ 2.1 mg / ml. Nous constatons que concentr supérieurtions produisent des résultats médiocres. </li><li> Appliquer lipidique à la diapositive en gouttes ul 1-10. Gouttes plus petites produisent généralement de meilleurs résultats. </li><li> Placer la lame sur le plateau intérieur au-dessus de la solution de sel saturée et sceller hermétiquement le récipient. Laisser à température ambiante pendant 3 heures à O / N. Le récipient peut être placé à 4 ° C, mais il faut noter que, pour certains sels, l&#39;humidité relative dépend fortement de la température, et que le froid va augmenter le temps d&#39;équilibration. </li><li> Le film qui en résulte peut avoir un léger éclat d&#39;arc-en pour lui, mais en tout cas devrait apparaître presque desséché. Solutions de départ très osmotiques peuvent être impossibles à sécher complètement à un film lipidique, ce qui n&#39;affectera pas les résultats. </li></ol> 4. Électroformation de liposomes géants <ol><li> films lipidiques, en particulier ceux formés à partir des liposomes déshydratés, sont facilement délogés. soigneusement hydrate chaque puits en plaçant une aiguille de seringue 27 sur le bord du joint et l&#39;application d&#39;un tampon lentement. Tampons peuventinclure l&#39;eau, ≤ 200 mM de saccharose, ≤ 1 M sorbitol et ≤ 5 HEPES. Solution de sel de plus de 10 mM peut exiger de rechange protocoles de tension électroformation. Débordement chaque joint et par environ 10%. </li><li> Remarque: une fois que les lipides sont hydratés, procéder rapidement à travers les étapes restantes, depuis films lipidiques commencent à se décoller immédiatement. Le rendement et la taille sont maximisés si électroformation commence rapidement. </li><li> Dans un mouvement lisse, appliquer une deuxième lame ITO, face conductrice dans, vers le haut de la garniture. Assurez-vous d&#39;avoir au moins 5 mm de débord extérieur de la zone du joint et en face de la première porte à faux. Appuyez doucement pour assurer une bonne étanchéité. </li><li> Nettoyez les deux surplombs à l&#39;éthanol et de vérifier que les côtés face à la garniture sont conductrices avec votre multimètre. </li><li> La chambre peut encore être fixée avec du parafilm ou des pinces à ressort de traction légères, si désiré. </li><li> Branchez la chambre de électroformation à une source de tension en obtenant des barres en aluminium ou en cuivre, &quot;EMI gasket mousse &quot;, ou bande conductrice adhésive aux surfaces conductrices des deux diapositives. Nous employons la mousse joint EMI. plans pour un gabarit et le collier sont illustrés à la figure 5. </li><li> Vérifiez qu&#39;il n&#39;ya pas de court-circuit électrique entre les contacts, et que les contacts se connectent correctement aux surfaces d&#39;ITO, en utilisant le multimètre. </li><li> Chauffer la chambre à 10 ° C supérieure à la température de fusion le plus élevé de l&#39;un des lipides présents, par exemple pour la DPPC, de la chaleur à 52 ° C au minimum, de 10 ° C supérieure à la température de fusion de la chaîne de 42 ° C. </li><li> Pour tampons faible teneur en sel, appliquer une onde sinusoïdale 10 Hz, ~ 0,7 V RMS pour chaque millimètre écart entre les deux surfaces revêtues d&#39;ITO, pour 60-90 min. Pour tampons élevées de sel, d&#39;autres protocoles de tension devraient être utilisés (voir références). </li></ol> 5. Imagerie et dépannage <ol><li> Image du liposome en utilisant un microscope inversé équipé d&#39;un cube de filtre pour la rhodamine ou Texas colorants rouges. Le liposome doit être de forme sphérique,majoritairement unilamellaires à l&#39;oeil, et exempt de défauts tels que les &quot;cordes&quot; pendait au liposome. </li><li> Si les liposomes sont trop petites, utilisez moins de lipides. </li><li> S&#39;il ya beaucoup de défauts ou quelques liposomes, cela peut être dû à des lipides en phase de gel. Envisager de relever la température de électroformation. </li><li> Si peu ou pas de liposomes géants formées à partir de tous les petits liposomes déshydratés, de réduire la force osmotique du tampon de liposomes, ou augmenter la force osmotique du tampon de électroformation. Un appel d&#39;un tampon dans la solution tampon interstitielle concentré peut provoquer une délamination du film lipidique déposé. </li><li> Si le rendement de la vésicule, la qualité ou la taille sont pauvres, et tu inclus sels ou tampons de pH dans les électroformation ou liposome tampons, envisager des protocoles de tension électroformation alternatives. Par exemple, Pott, et al. 11, recommander un protocole en trois étapes en utilisant une onde sinusoïdale de 500 Hz, augmentant la tension de 50-1,300 Vpp / m en 30 min, maintien pendant 90 mn, l&#39;n diminuant la fréquence de 50 Hz sur 30 à 60 min. Platinum ou titane électrodes peuvent être nécessaires dans ce cas, mais cela ne modifie pas substantiellement le protocole. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Électroformation de liposomes géants s&#39;est développé en une technique souple compatible avec divers lipides, des préparations et des tampons. Un contrôle minutieux du processus de dépôt de lipides est plus critique pour le succès. Nous avons présenté des outils simples pour rendre dépôt contrôlé de lipides provenant de petites préparations de liposomes un processus simple. L&#39;humidité relative est essentielle à la bonne déshydratation des liposomes initiaux, et la valeur optimale varie avec la ...

Liposomes géants (souvent appelés vésicules unilamellaires géantes, ou GUVS) ont principalement été utilisées pour étudier la physique et la chimie physique de bicouches lipidiques, y compris les études de déformation bicouche, la coexistence de phase latérale (&quot;rafts&quot;), la fusion de la membrane, etc 1-4. Elles ont une structure cellulaire grossière comme: coque sphérique de la membrane entourant un intérieur aqueux qui peut facilement être fait différent de celui du tampon aqueux environnant. Ils sont, par définition, ≈ 1-100 m de diamètre, de sorte qu&#39;ils peuvent être visualisés en utilisant une variété de méthodes de microscopie optique. Ils peuvent être fabriqués en utilisant des gradients osmotiques tendue ou la tension appliquée mécaniquement, de sorte que même si généralement doux, leurs propriétés peuvent être manipulées pour une manipulation aisée. En particulier, le contrôle de la &quot;rigidité&quot; du liposome, il est facile de former des plaques &quot;liposome-inscrits&quot; ou excisés pour l&#39;électrophysiologie. Dans le passé, la reconstitution des canaux ioniques a été en grande partie réalisée en plan lipidique bilayers. Maintenant, la capacité à former des plaques de liposomes géants et utiliser le carquois considérable d&#39;outils développés pour l&#39;électrophysiologie classique (microscopie à fluorescence, micropipette aspiration, perfusion rapide et un contrôle de la température, etc) rend liposomes géants de plus en plus attrayant pour les études de reconstitution 5,6. Liposomes géants ont été faites par de nombreuses stratégies. En effet, les liposomes géants forment spontanément par un processus de gonflement lors d&#39;un film lipidique séché est réhydraté 4,7,8. Le désir de préparer plus rapidement plus, les liposomes plus uniformes conduit les chercheurs à d&#39;autres approches, au premier rang desquels électroformation 1,9. Électroformation s&#39;appuie également sur l&#39;hydratation d&#39;un film lipidique séché, mais accélère le processus par l&#39;application d&#39;un champ électrique oscillant à travers le film lipidique. Le champ est appliqué au moyen de deux électrodes, soit des fils de platine ou de l&#39;indium-étain (ITO) des lames de verre recouvertes, séparés par de l&#39;eau outampon et sur laquelle les lipides sont déposées. En accélérant le gonflement des liposomes, on obtient un rendement plus élevé des grands liposomes. Ainsi, électroformation est devenue la méthode par défaut pour produire des liposomes géants 4. Le mécanisme de électroformation n&#39;est pas entièrement comprise, et la plupart des protocoles sont développés de manière empirique (par exemple 10,11). Néanmoins, nous pouvons en apprendre un peu plus sur ce à quoi s&#39;attendre en tenant compte de la théorie et des résultats empiriques. Il est largement admis que électroformation se produit en conduisant flux électro-osmotique de tampon entre les bicouches lipidiques individuels empilés dans le film lipidique déposé 10,11. Couplage électrostatique aux fluctuations thermiques des bicouches lipidiques est probablement aussi impliquée 12. Ces hypothèses prédisent qualitativement limites supérieures de la fréquence du champ électrique et de la force qui peut être utilisé 10,12. En particulier, il est prévu que les solutions à haute conductivité ( <eM&gt; ie solutions salines physiologiques) réduisent les forces électrohydrodynamiques qui peut engager la électroformation liposome 12. Taux d&#39;écoulement électro-osmotique diminuent généralement avec l&#39;augmentation de la concentration en sel et sont fréquemment atteint un sommet à une certaine fréquence d&#39;oscillation du champ électrique (par exemple, bien que dans une géométrie différente, Green et al. 13). Ainsi, les intensités de champ supérieures et des fréquences plus élevées sont raisonnables pour des solutions à haute conductivité, dans les limites de 10. Toutefois, les protéines membranaires sont susceptibles d&#39;être incompatible avec la méthode habituelle de dépôt de lipides sur des électrodes pour la procédure electroswelling, notamment dans les solvants organiques qui sont ensuite évaporés pour laisser un film lipidique mince. Il ya deux voies principales de contourner cette difficulté: pour incorporer des protéines après la formation du liposome géant, ou d&#39;adapter la manière dont les lipides sont déposés. Notre approche s&#39;appuie sur d&#39;autres 5,11 à déposer les lipides et reconstitutiontuait une protéine de la membrane ainsi que d&#39;une suspension de petites ou grandes &quot;protéoliposomes&quot;. Nous décrivons le processus long et plus difficile de produire des protéoliposomes de protéines et de lipides purifiés ailleurs (Collins et Gordon, en révision). Nous décrivons ici le protocole en l&#39;absence de toute protéine, mais il est le même lorsque la protéine est constituée, nous incluons les résultats montrant que protéoliposomes contenant le canal TRPV1 ion peuvent être transformés en GUVs et utilisés pour patch-clamp électrophysiologie. Dans toute approche électroformation, une inspection visuelle de l&#39;échantillon de lipides au cours du processus de dépôt lipidique est essentielle au succès. Notre approche peut être pertinent au-delà de l&#39;application spécialisée pour la reconstitution du canal ionique. Dans le même temps depuis que nous avons mis au point ce protocole, et maintenant, il a également été montré comment la façon dont les lipides sont déposés sur des électrodes pour électroformation affecte l&#39;hétérogénéité compositionnelle des GUVs en résultent. Bayk14 Al-Caglar et al. ont montré que GUVs liposomes formés à partir soigneusement déshydratés ont un 2,5 fois plus faible variation de la température de transition de miscibilité de GUVs formés à partir de mélanges de divers phospholipides et de cholestérol. Leurs travaux indiquent que les lipides, et en particulier le cholestérol, peut précipiter à partir du mélange de lipides déposés lors de solvants organiques, ce qui entraîne une grande variation spatiale dans la composition du film lipidique déposé. Ceci est particulièrement important pour les études sur le comportement de phase de membrane lipidique, mais peut aussi être critique aux expériences quantitatives sur le fonctionnement des canaux ioniques. Baykal-Caglar et al &#39;s. Protocole est similaire, mais pas identique à la nôtre, et les lecteurs sont encouragés à étudier aussi. Ce protocole (voir l&#39;aperçu, figure 1) est l&#39;un des nombreux qui pourrait être utilisé. Dans succès de électroformation de principe dépend du mélange de lipides, de l&#39;hydratation, de la température, d&#39;autres solutés (en particulier des ions), et deBien entendu la tension et la fréquence utilisée dans la formation. Comme électroformation devient mieux comprise, nous nous attendons à affiner notre protocole plus. Enfin, il ya souvent une courbe d&#39;apprentissage abrupte dans galvanoplastie liposomes géants. Nous suggérons la maîtrise du protocole classique (articles 1 et 4, et, si nécessaire, la section 5) avant d&#39;apprendre à déposer lipides à partir de suspensions de liposomes (articles 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

La reconstitution des canaux ioniques dans les membranes lipidiques chimiquement définis pour l&#39;enregistrement électrophysiologique a été une technique puissante pour identifier et d&#39;explorer la fonction de ces protéines importantes. Cependant, les préparations classiques, tels que les bicouches planaires, limiter les manipulations et expérimentations qui peuvent être effectuées sur le canal reconstitué et son environnement membranaire. La structure cellulaire plus comme des liposomes géants permet des expériences de patch-clamp traditionnels sans pour autant sacrifier le contrôle de l&#39;environnement lipidique. Électroformation est un moyen efficace pour produire des liposomes géants&gt; 10 um de diamètre, qui repose sur l&#39;application de la tension alternative d&#39;un mince film lipidique ordonnée déposée sur une surface d&#39;électrode. Toutefois, depuis le protocole classique appelle les lipides à déposer à partir de solvants organiques, il n&#39;est pas compatible avec les protéines membranaires moins robustes comme les canaux ioniques et doit être modifié. Récemment, protocols ont été développés pour électroforme liposomes géants de petits liposomes partiellement déshydratés, que nous avons adapté à des liposomes contenant des protéines dans notre laboratoire. Nous présentons ici l&#39;arrière-plan, de l&#39;équipement, les techniques et les pièges de électroformation de liposomes géants de petites dispersions de liposomes. Nous commençons avec le protocole classique, qui doivent être maîtrisées avant de tenter les protocoles les plus difficiles qui suivent. Nous démontrons le processus de déshydratation partielle contrôlée de petits liposomes en utilisant équilibre vapeur avec des solutions salines saturées. Enfin, nous démontrons le processus de électroformation lui-même. Nous allons décrire l&#39;équipement simple et peu coûteuse qui peut être fait en interne pour produire des liposomes de haute qualité, et de décrire l&#39;inspection visuelle de la préparation à chaque étape afin d&#39;assurer les meilleurs résultats.

Dans nos exemples, nous préparons des liposomes à partir d&#39;un mélange d&#39;environ 55% mol POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphocholine), 15% mol POPS (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphoserine , 30% mol de cholestérol, et de 0,1% en moles Texas Red-étiqueté 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoéthanolamine (TxR-DPPE). Cette composition a été choisi comme environ représentant des dorsales lipides ganglions de la racine 18. Nous constatons que 15% molaires chargé...

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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

La reconstitution de protéines membranaires fonctionnelles dans des liposomes géants de composition définie est une approche puissante lorsqu&#39;elle est combinée avec l&#39;électrophysiologie patch-clamp. Cependant, la production de liposome géant conventionnel peut être incompatible avec la stabilité des protéines. Nous décrivons les protocoles de production de liposomes géants de lipides purs ou des petits liposomes contenant des canaux ioniques.

Préparation des liposomes de géant pour l&#39;imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K vues.  University of Washington. La reconstitution de protéines membranaires fonctionnelles dans des liposomes géants de composition définie est une approche puissante lorsqu'elle est combinée avec l'électrophysiologie patch-clamp. Cependant, la production de liposome géant conventionnel peut être incompatible avec la stabilité des protéines. Nous décrivons les protocoles de production de liposomes géants de lipides purs ou des petits liposomes contenant des canaux ioniques.

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Recherche

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Préparation de bicouches artificielle pour des expériences d&#39;électrophysiologie

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord électrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introduction à la membrane solide étayée par électrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...