This study was supported by the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Project grant 1022839. AJH is an Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health acknowledges support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Grant.

NOTE: Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvés par l&#39;Institut Florey du comité d&#39;éthique de la santé animale Neuroscience &amp; mentale et conformes aux Conseil de recherches médicales national de santé et de l&#39;Australie a publié un code de pratique pour le soin et l&#39;utilisation des animaux à des fins scientifiques (7 e édition, 2004). 1. manipulations de l&#39;environnement <ol><li> Sexe Pairing <ol><li> Utilisez sexuellement matures (&gt; ancienne 8 semaines), mâle appariés pour l&#39;âge et les souris femelles. NOTE: Nous utilisons généralement souris C57BL / 6, mais avons eu les mêmes résultats en utilisant des souris Swiss dans ce protocole. Nous utilisons généralement n = 8 hommes et n = 8 femelles pour chaque expérience, divisé en n = 2 paires de mâles-mâle (n = 4 hommes), n = 2 femelle-femelle paires (n = 4 femmes), et n = 4 paires hommes-femmes (n = 4 mâles et 4 femelles n =). </li><li> À l&#39;arrivée dans le centre de détention des animaux, groupe-maison, les souris par sexe pour&gt; 3 jours pour se acclimater. Ici et throughout l&#39;appariement entre les sexes, garder stimuli environnementaux extérieurs (par exemple la température ambiante, la lumière: cycle d&#39;obscurité, de la nourriture, de l&#39;eau, la manipulation et le nettoyage) constante ou distribuer également à toutes les souris. </li><li> Affecter aléatoirement chaque souris à une paire de mâle-mâle, une paire de femelle-femelle, ou une paire de mâle-femelle. Placez chaque paire dans une cage propre dans l&#39;isolement (2 souris / cage) avec accès ad libitum à la nourriture et de l&#39;eau, et il suffit de les accueillir de cette manière continue pendant 7 jours. NOTE: Routine l&#39;élevage est OK cours de cette période, mais doit être répartie également entre toutes les souris. Prenez soin d&#39;éviter appariement des congénères masculins et féminins. </li></ol></li><li> Enrichissement de l&#39;environnement <ol><li> Utilisez, mâles ou femelles souris appariés selon l&#39;âge sexuellement matures (&gt; ancienne 8 semaines). NOTE: Nous utilisons généralement n = 18 souris pour chaque expérience, répartis en groupe n = 6 / de traitement. </li><li> À l&#39;arrivée dans le centre de détention des animaux garder logé dans la norme identique hébergé en groupe (SH) (par exemple, </em&gt; Voir ci-dessous) conditions à ce stade&gt; 3 jours pour se acclimater. Ici et toute l&#39;expérience, gardez stimuli environnementaux extérieurs (par exemple la température ambiante, la lumière: cycle d&#39;obscurité, de la nourriture, de l&#39;eau, la manipulation et le nettoyage) constante ou répartir équitablement à toutes les souris. </li><li> Pour commencer l&#39;enrichissement de l&#39;environnement, d&#39;attribuer au hasard chaque souris à l&#39;un des trois groupes: SH; roue en cours d&#39;exécution (RW), ou de l&#39;environnement enrichi (EE) et placer chaque groupe de souris ainsi que dans une cage propre identiques avec un accès ad libitum à la nourriture et de l&#39;eau. REMARQUE: Ici, de plus grandes cages de rats-tenant pour tous les groupes, mesure 27 cm de large, 42 cm de long et 16 cm de profondeur ont été utilisés. <ol><li> En outre, fournir les conditions suivantes environnementales à chaque groupe: SH comprenant seulement la litière (boulettes de papier ou de la sciure) sur le sol; RW comprenant SH plus 2 roues fonctionnement; EE comprenant RW ainsi que les jouets (cordes, échelles, tunnels, et des objets tels que vides rouleaux de serviettes en papier et des morceaux de papier de soie) avec lequel explore, jeu, grimper, se cacher, et le nid. </li><li> Les loger dans cette façon continue pendant 14 jours. NOTE: Routine l&#39;élevage est OK cours de cette période, mais doit être répartie également entre toutes les souris. </li></ol></li><li> EE souris soumises à des super-enrichissement &#39;additionnel (SE) en les plaçant ensemble dans une cage plus grande contenant de nouveaux jouets pour 1 heure / jour (même heure chaque jour), 5 jours / semaine. NOTE: Voici, un 46 cm de large, 69 cm de long et 40 cm de profondeur baignoire en plastique a été utilisé. <ol><li> Maintenir la nouveauté en présentant un ensemble différent de jouets chaque session. Jouets propres qui doivent être re-présentées à des souris avec de l&#39;eau savonneuse et 80% d&#39;éthanol pour éliminer les odeurs. </li><li> Après chaque séance SE, retourner les souris dans leur cage d&#39;EE. Poignée SH et souris RW même que les souris SE (sauf pour SE lui-même) tout au long de cette période (par exemple, retirer et restituer chaque SH et RW souris depuis et vers sa cage). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Préparation <ol><li> Utilisation des pompes osmotiques et des kits stériles de perfusion du cerveau, qui sont disponibles dans le commerce. Le jour avant l&#39;implantation, en utilisant une technique aseptique, les premiers implants en remplissant chaque pompe, tube et de raccordement de canule avec une solution stérile de médicament ou de véhicule (comme décrit dans les instructions fournies avec les pompes). Branchez-les ensemble et incuber dans une solution saline stérile nuit à 37 ° C. Incuber implants drogue et de véhicules remplis séparément pour éviter la contamination croisée. </li></ol></li><li> Surgery. REMARQUE: Selon le pays de l&#39;expérimentateur, permis ou de quotas de l&#39;expérimentation animale spéciaux sont nécessaires pour poursuivre ces types de chirurgie et expériences post-opératoires. <ol><li> Stériliser tous les équipements chirurgicaux et d&#39;employer une technique aseptique pendant. Anesthésier la souris (par exemple en utilisant 1-2% isofluorane dans l&#39;air) et le placer dans un stèrechevalement otaxic. Vérifiez la profondeur de l&#39;anesthésie pendant toute la procédure et administrer en outre anesthésique nécessaire (par exemple absence de retrait des membres de la patte nocive pincée est indicative de l&#39;anesthésie adéquate). Se assurer que les yeux sont protégés de la dessiccation par onguent lubrifiant oculaire, et que la température du corps de la souris reste normale tout au long de la procédure. </li><li> Faire une incision médiane à travers la peau à partir d&#39;entre les yeux et de finition 2 cm en arrière du bord arrière du crâne. Blunt disséquer la peau loin de l&#39;aponévrose sous-jacente à l&#39;arrière de la souris pour créer une «poche» sous-cutanée assez grand pour accueillir confortablement la pompe et tube de liaison une fois la canule est implanté (le tube de liaison ne doit pas être plié à la fin). Grattez effacer le fascia de plus de la face dorsale du crâne. </li><li> Utiliser un diamètre fraise dentaire environ 1,5 mm, descendre dans le crâne à la stéréotaxique appropriée coordonne uusqu&#39;à une couche mince, souple des restes osseux. Peel cette couche loin en utilisant une pince fine (cela évite d&#39;endommager la dure-mère sous-jacente et le cerveau avec le fraise dentaire). Assurer le crâne est nettoyé de tous les fragments de sang et d&#39;os, et qu&#39;il n&#39;y a pas de saignement plus loin. </li><li> Avec la canule détenu par un porte-canule, placer la pompe et le tube de raccordement dans la «poche» sous-cutanée recouvrant le dos de la souris. Ensuite, placez la pointe de la canule aux coordonnées stéréotaxiques appropriées et sur la surface du cerveau. Abaisser avec précaution la canule dans le cerveau, mais arrêter environ 1 mm de moins que la profondeur requise. NOTE: La profondeur restante sera négocié après l&#39;application de la première couche de l&#39;acrylique dentaire. </li><li> Vérifiez à nouveau la surface du crâne est propre et sec, puis préparer un petit volume de l&#39;acrylique dentaire et utiliser un cure-dent pour lisser sur toute la surface exposée du crâne, y compris dans le trou de trépan à travers le crâne autour èmee canule. Avant durcit l&#39;acrylique, abaisser la canule basculer la profondeur reste dans la cible. </li><li> Préparer un autre petit volume de l&#39;acrylique dentaire et cette couche sur le premier, ainsi que sur le support de plastique blanc pour la canule, de fixer la canule en place. Répéter l&#39;opération avec des couches supplémentaires de acrylique que nécessaire. </li><li> Une fois l&#39;acrylique a durci, retirer délicatement le porte-canule et de couper la languette blanche en plastique amovible de la canule en utilisant une lame de scalpel chauffé avec une flamme de butane. Enfin, suturer la peau fermée sur toute implant. </li></ol></li><li> Traitement post-opératoire des animaux <ol><li> Appliquer une pommade antiseptique pour les marges de la peau, et d&#39;administrer un anti-inflammatoire à la souris (par exemple le méloxicam, 3 mg / kg sc). Débranchez la souris de la trame, le placer sous une lampe chauffante, et observer jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. REMARQUE: Experimental manipulations telles que le jumelage entre les sexes et à l&#39;enrichissement de l&#39;environnement peuvent être lancés ou repris le jour suivant la chirurgie au plus tôt. </li><li> Surveiller leur poids corporel, le comportement général et l&#39;apparence quotidienne. Traiter les signes d&#39;infection (gonflement, rougeur, pus) autour des incisions chirurgicales avec une pommade topique antiseptique. Traiter tous les signes de maladie, la douleur, le stress ou d&#39;inconfort (par exemple perte de poids corporel&gt; 10%, retrait social, absence de toilettage, &quot;bouffer&quot;, le dysfonctionnement de mouvement, convulsions) avec des analgésiques et / ou des antibiotiques systémiques que nécessaire. </li><li> Euthanasier les souris si&gt; 15% de perte ou de symptômes de la maladie, la douleur, le stress ou d&#39;inconfort poids sont non-recouvrables à moins 1 semaine de traitement curatif. </li></ol></li></ol> 3. tissu cérébral préparation, la transformation immunohistochimique et Stéréologie <ol><li> Perfusion <ol><li> Immédiatement après manipulations / de drogue environnementaux, préparer le cerveau pour l&#39;étude. <br/&gt; Remarque: Dans les expériences rapportées ici le nombre de neurones TH + SNc été mesurée et comparée à chacun des différents groupes de traitement. </li><li> Première administrer une surdose d&#39;anesthésique pour tuer les souris (par exemple, 100 mg / kg ip pentobarbital sodique). Une fois anesthésié, mais avant que le cœur cesse de battre, mettre la souris sur son dos et cravate ou épingler les deux pattes avant. </li><li> En utilisant un scalpel découpé la peau recouvrant le thorax incise ensuite à travers le muscle juste en dessous de la cage thoracique dans la cavité abdominale. Placez une pince sur la pointe du sternum de la cage thoracique et soulever la cage thoracique et loin de le foie exposer le diaphragme. </li><li> Couper à travers la membrane et à travers les nervures latéralement des deux côtés à l&#39;aide de grands ciseaux jusqu&#39;à la cage thoracique peut être replié sur la tête pour exposer les poumons et le cœur. Avec des ciseaux fins font une petite incision dans l&#39;oreillette droite comme un point de sortie pour le sang et les solutions perfusés, puis couper à travers la base du ventricule gauchecle et placer une canule à travers le ventricule gauche, l&#39;oreillette gauche, et dans l&#39;aorte. </li><li> Fixer la canule en place puis pomper chaude (37 ° C) héparine et 0,1 M tampon phosphate salin physiologique (PBS) à travers le système vasculaire jusqu&#39;à ce que la solution sortant de l&#39;oreillette droite est entièrement libre de sang. Ensuite, la pompe à froid (4 ° C) une solution de fixateur (tels que 4% de paraformaldehyde dans du PBS) à travers le système vasculaire jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemble souris est bien fixé. Retirez le cerveau et dans PBS avec 30% de saccharose pendant 2-3 jours jusqu&#39;à ce que les puits de cerveau. NOTE: D&#39;autres types de préparation de tissu pourraient être appliquées en fonction de l&#39;expertise en laboratoire correspondant. </li></ol></li><li> Préparation de cryosections flottant <ol><li> Couper des sections en série à travers les régions du cerveau d&#39;intérêt et de recueillir ceux-ci dans PBS. NOTE: Nous avons réduit de 40 sections um d&#39;épaisseur en utilisant un cryostat. Autres types de sectionnement de tissu pourraient être appliquées en fonction de l&#39;expertise dans le corresponding laboratoire. </li></ol></li><li> Immunohistochimie <ol><li> Effectuer immunohistochimie standard pour des protéines d&#39;intérêt. Incuber les coupes dans 5% de sérum de chèvre normal et 0,3% de Triton X-100 dans du PBS à température ambiante pendant 30 min, puis immunoréagissent avec polyclonal de lapin anti-TH (1: 400) à 4 ° C pendant 48 heures, puis polyclonal biotinylé de chèvre anti -rabbit (1: 1000) à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Ensuite, laisser incuber à l&#39;avidine-peroxydase (1: 500) à la température ambiante pendant 1 heure, puis dans de cobalt et de diamino-benzidine de nickel intensifié (0,5 mg / ml) à la température ambiante pendant 18 à 20 min; pour le dernier 5/3 min d&#39;incubation de la diamino-benzidine ajouter du peroxyde d&#39;hydrogène (0,01%) pour catalyser la précipitation chromogène. Laver les sections trois fois pendant 10 minutes chacune dans du PBS avant, après, et entre chacune des étapes ci-dessus. </li><li> Montez les sections sur des lames de microscope gélatinisées, l&#39;air de les sécher, puis Nissl tache (rouge neutre), déshydrater dans l&#39;alcool, clair (X-3B), et lamelle. </li></ol></li><li&gt; Stéréologie <ol><li> Estimer le nombre total de neurones TH + et TH- SNC (LC et VTA) et en utilisant des méthodes stéréologiques impartiales. Assurez-vous que l&#39;stereologist est aveugle au traitement reçu. Exclure glie sur la base du diamètre de soma &lt;5 um et compter que les cellules avec un noyau visible. </li><li> Identifier le SNC (et VTA et LC) par les emplacements spatiaux de cellules TH + et anatomiques Monuments / limites selon l&#39;atlas du cerveau de Paxinos et Watson 7. Comptez TH + cellules dans un cadre de comptage (55 x 55 um = 3,025 um 2) à des intervalles prédéterminés réguliers (x = 140 um, y = 140 um pour SNC; x = 100 um, y = 100 um pour VTA et LC) tout au long de chaque noyau dans chaque quatrième section. </li></ol></li></ol>

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J., Noonan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+of+laboratory+rats+for+potentially+enriching+stimulus+objects.">Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects.</a> Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).</li><li>Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+runway+paradigm+to+assess+the+relative+strength+of+rats'+motivations+for+enrichment+objects.">Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects.</a> Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).</li><li>Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions+and+construct+validity+in+preclinical+models+of+psychiatric+disorders.">Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders.</a> Progress in neuro-psychopharmacology &amp; biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).</li><li>Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+preference+for+nesting+material+as+environmental+enrichment+for+laboratory+mice.">Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice.</a> Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).</li><li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+on+gene+expression+in+the+brain.">Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).</li><li>Eckert, M. J., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+exposure+on+synaptic+transmission+and+plasticity+in+the+hippocampus.">Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).</li><li>Sztainberg, Y., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmental+enrichment+model+for+mice.">An environmental enrichment model for mice.</a> Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).</li><li>Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+brain+plasticity:+towards+an+endogenous+pharmacotherapy.">Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy.</a> Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Manipulations de l&#39;environnement La motivation derrière la conception de ces manipulations de l&#39;environnement (d&#39;appariement entre les sexes et d&#39;enrichissement de l&#39;environnement) était de déterminer si l&#39;environnement, et / ou le comportement suscité par l&#39;environnement, est associée à des changements dans le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale. L&#39;accent est donc sur la fourniture d&#39;environnements et de stimuler des compor...

DArgic la signalisation par les neurones dans la région tegmentale ventrale (VTA) et substantia nigra pars compacta de (SNC) du mésencéphale est considéré comme important pour les comportements cognitifs, émotionnels et moteurs récompense motivés. Cependant, la signalisation de DA trop ou trop peu mésencéphale provoque de nombreux symptômes invalidants dans une variété de troubles neurologiques (par exemple la maladie de Parkinson, déficit de l&#39;attention et hyperactivité, schizophrénie et la toxicomanie). Médicaments qui augmentent ou diminuent DA signalisation soulager ces symptômes, mais ils produisent également des effets secondaires attribuables à la signalisation dérégulée et les effets hors-cible. L&#39;efficacité du médicament diminue également au fil du temps en raison des réponses compensatoires du cerveau. Le défi est donc de rétablir la signalisation DA mésencéphale normale, de façon plus ciblée et physiologique, et une approche favorisée est en augmentant ou en diminuant le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale. La preuve a été accumulé pendant sevsieurs décennies que l&#39;expression des gènes et des protéines impliquées dans le métabolisme et le trafic DA et d&#39;autres catécholamines dans les cellules adultes matures est modifiable (examinés dans une). Dans le mésencéphale, le nombre de tyrosine hydroxylase immunopositif (TH +, l&#39;enzyme limitant la vitesse à Da synthèse) neurones diminue puis augmente suite à l&#39;administration de la neurotoxine 2,3, tandis que le nombre de TH immunonegative (TH) neurones montre la tendance inverse (ce est à dire des augmentations puis diminue 3). Ceci est cohérent avec la perte ensuite gain du «phénotype DA &#39;par certaines cellules. Le nombre de neurones TH TH + et CNS a également été démontré que le changement dans des directions égales mais opposées suivant divers traitements qui modifient l&#39;activité électrique de ces cellules à 4,5. Par exemple, la perfusion de la petite conductance, de potassium activé par le calcium (SK) dans le canal antagoniste apamine mésencéphale pendant 2 semaines diminue le nombre de TH + et augmente (par la même quantité) à la numbre de TH- SNc neurones 4,5. En revanche, la perfusion de l&#39;agoniste des canaux SK-1 EBIO augmente le nombre de TH + et diminue (par le même montant) le nombre de neurones TH SNc 4,5. Des changements similaires ont été observés suite à une variété de traitements ciblant SNc activité neuronale, y compris certains qui visait entrées afférentes 4. Ce règlement apparente du nombre de neurones SNc DArgic par l&#39;activité neuronale et entrée afférente soulève la possibilité que l&#39;environnement ou le comportement peuvent influer sur le nombre de neurones de SNC. En effet, des souris adultes exposés à des environnements différents ont plus ou moins mésencéphale (SNC et VTA) TH + neurones, et au moins certains de ces changements induits par l&#39;environnement sont abolis par le blocage simultané de l&#39;entrée synaptique dans le mésencéphale 6. Les objectifs de cette communication sont les suivants: (1) fournir plus de détails sur la façon de mettre en œuvre nos manipulations de l&#39;environnement et des perfusions de médicaments; et (2) fournir des données à l&#39;appui de notre affirmation selon laquelle le environnement régule le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale, via l&#39;entrée afférente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1300">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:636px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:636px;">Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td>
			<td style="width:119px;">AHN3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Osmotic pump 1002</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Brain infusion kit 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET cannula holder 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0008860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Self Curing (dental acrylic powder)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">METACAM (Meloxicam)</td>
			<td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td>
			<td style="width:119px;">L10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Sodium Pentobarbitone</td>
			<td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td>
			<td style="width:119px;">571177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Normal goat serum</td>
			<td>chemicon-temecula, CA</td>
			<td style="width:119px;">S26-Litre</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">1.08603.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td>
			<td style="width:119px;">EO432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin peroxidase</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">A3151-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamino-benzidine</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">D-5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Investigator</td>
			<td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

environmental modulations of the number of midbrain dopamine neurons in adult mice

Des changements durables dans le cerveau ou «plasticité cérébrale» sous-tendent le comportement adaptatif et la réparation du cerveau après les maladies ou des blessures. En outre, les interactions avec notre environnement peuvent induire la plasticité du cerveau. De plus en plus, la recherche tente d&#39;identifier les environnements stimuler la plasticité cérébrale bénéfique pour traiter les troubles cérébraux et comportementaux. Deux manipulations de l&#39;environnement qui sont décrits augmenter ou diminuer le nombre de tyrosine hydroxylase immunopositif (TH +, l&#39;enzyme limitant la vitesse dans la dopamine (DA) synthèse) des neurones dans le mésencéphale de souris adulte. La première comprend appariement souris mâles et femelles de façon continue pendant 1 semaine, ce qui augmente TH mésencéphale + neurones d&#39;environ 12% chez les hommes, mais diminue TH mésencéphale + neurones d&#39;environ 12% chez les femmes. La seconde comprend les souris de logement en continu pendant deux semaines dans des «environnements enrichis» (EE) contenant roues de roulement, des jouets, des cordes, des matériaux de nidification, etc., qui increases TH mésencéphale + neurones d&#39;environ 14% chez les hommes. En outre, un protocole est décrite pour infuser simultanément des médicaments directement dans le mésencéphale au cours de ces manipulations de l&#39;environnement pour aider à identifier les mécanismes sous-jacents de l&#39;environnement induite par la plasticité du cerveau. Par exemple, EE-induction de plus TH mésencéphale + neurones est abolie par le blocage simultané de l&#39;entrée synaptique sur les neurones du mésencéphale. Ensemble, ces données indiquent que l&#39;information sur l&#39;environnement est relayé via l&#39;entrée synaptique des neurones du mésencéphale pour allumer ou éteindre l&#39;expression de gènes «DA». Ainsi, la stimulation environnementale appropriée, ou le ciblage de médicaments des mécanismes sous-jacents, peut être utile pour le traitement de troubles cérébraux et comportementaux associés à des déséquilibres dans le mésencéphale DA (par exemple la maladie de Parkinson, déficit de l&#39;attention et hyperactivité, la schizophrénie et la toxicomanie).

Les souris adultes soumis à ces manipulations de l&#39;environnement ont modifié nombre de mésencéphale (SNC et VTA), mais pas LC, neurones TH +, et EE plus perfusion mésencéphale concurrente soit picrotoxine ou bicuculline (GABA A antagonistes des récepteurs) abolit EE-induction de plus SNc TH + neurones. Ces données ont déjà été publiés dans les six. Les présentes données ont été compilées dans des expériences répétées effectuées dans le cadre de cette étude précédente, ...

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Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulations environnementaux du mésencéphale Nombre de dopamine neurones chez la souris adulte

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

environmental-modulations-number-midbrain-dopamine-neurons-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vues.  The University of Melbourne. This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Vidéo: Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Application d&#39;une conductance des récepteurs NMDA dans les neurones dopaminergiques mésencéphale de rat utilisant la technique du clamp dynamique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Recherche

Neurosciences

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Etudier l&#39;intégration des adultes-né Neurones

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Évaluation de l’homéostasie des dopaminergiques chez les souris par l’utilisation de l’analyse de chromatographie liquide à haute performance et l’absorption de la Dopamine

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...