Un soutien partiel pour ce travail a été fourni par l&#39;Institut national de la santé (R01GM100470 et 1R01GM095959-01A1; à MA et JDS) et une subvention Core Facility de l&#39;Institut des sciences clinique et translationnelle Indiana (financé en partie par le NIH subvention # TR000006 UL1; à JDS).

1. Swarm Assay médias Préparation et inoculation 4,5,7,8,11 <ol><li> Préparation médias NOTE: La composition du milieu décrit ci-dessous est applicable à P. aeruginosa études de formation vrille. Se il vous plaît voir cahier des médias sur le tableau 1 pour P. aeruginosa, B. subtilis, et M. xanthus tests de motilité de surface. <ol><li> Mélanger 200 ml de FAB-moins (NH 4) 2 SO 4 moyennes essaim (Tableau Matériaux), 0,9 g d&#39;agar Noble, et 0,2 g de casaminoacides (Tableau 1) par agitation avec un barreau d&#39;agitation magnétique. Utilisez de petits volumes (100 à 300 ml) d&#39;améliorer la cohérence entre les expériences. </li><li> Autoclave le mélange 200 ml d&#39;agar / media en utilisant un temps d&#39;exposition de 22 min, la température d&#39;exposition de 121,1 ° C, et une option d&#39;évacuation rapide. Les réglages de l&#39;autoclave permettront une bonne stérilisation et la fusion agar, mais éviter la caramélisation agar. REMARQUE: agar Noble est sujette à caramelsation; motilité bactérienne est modifiée sur gélose caramélisé. </li><li> Immédiatement après le cycle de stérilisation a finalisé, fermer le bouchon de la bouteille de médias pour prévenir la perte d&#39;eau par évaporation. Toutefois, notez que le plafonnement serré peut provoquer un «vide d&#39;étanchéité« effet -comme sur la bouteille. </li><li> On refroidit le support à 50 ° C tout en agitant à la température ambiante (RT) et ajouter 2 ml de 1,2 M de glucose stérile. Sinon, placez le support dans un incubateur ou un bain d&#39;eau à 60 ° C jusqu&#39;au moment de servir (jusqu&#39;à 15 heures plus tard), et procéder comme indiqué. Pour éviter la formation de bulles dans les médias, bien mélanger à l&#39;aide de la barre d&#39;agitation magnétique; des bulles à la surface de l&#39;agar empêchera même essaimage. NOTE: Pour les autres essais, ajouter à cette étape composants sensibles à la chaleur qui ne peuvent être passés à l&#39;autoclave comme les éléments nutritifs ou des colorants supplémentaires, au besoin (par exemple, plus de 8 pi Invitrogen Syto 63 colorant par 100 ml de gélose fondue à l&#39;image M. xanthus comme le montre dans Representative Résultats, ci-dessous). Ajout de certains colorants peut influer sur le comportement d&#39;essaimage de base, qui doit être vérifiée par rapport à un témoin non colorant. </li><li> Dans une hotte de laboratoire, aliquote 7,5 ml de milieu stérile par 60 mm de diamètre polystyrène boîte de Pétri et maintiennent les plaques en une seule couche (non empilées). Pour une plus grande surface de l&#39;essaimage, aliquote de 25 ml de milieu par mm de diamètre boîte de 100 Petri. Il est important de remplir les plats sur une surface plane horizontale. Utilisez la hauteur des yeux d&#39;un taureau pour vérifier si la surface est nivelée. NOTE: Pour P. dosages aeruginosa, en utilisant un volume de support spécifiques par plaque sera d&#39;améliorer la cohérence et la reproductibilité. Pour B. subtilis et M. dosages xanthus, versant main donne des résultats comparables à des aliquotes de volume spécifiques. </li></ol></li><li> Plate durcissement <ol><li> Pour les petites plaques (60 mm), permet le milieu gélose fondu pour guérir (tous deux réglés sur semi-liquide-solide et sec excès) dans la hotte à découvert (ce est à dire, sans couvercle) pendant 30 min. Agrandirplaques (100 mm) nécessitent un temps de durcissement plus long (voir Discussion). REMARQUE: Sinon, certains tests peuvent nécessiter plaques de guérir sur le dessus du jour au lendemain de banc (20-24 h) couverte (c.-à-couvercles sur) en une seule couche (tableau 1). L&#39;essaimage est sensible à la fois l&#39;humidité excessive et inadéquate. L&#39;humidité, la circulation d&#39;air, et la température de tout laboratoire donné peuvent nécessiter une variation à la plaque de durcissement de promouvoir l&#39;essaimage optimale de vous bactérie. </li><li> Ensemencer immédiatement après la période de séchage est terminé. Ne pas stocker les plaques pour une utilisation ultérieure. <ol><li> Effectuer le «test de diffusion d&#39;encre&quot; en repérant une plaque d&#39;essai avec un mélange de 10 pi de 0,50% (vol / vol) Higgins étanche encre de Chine noire et inoculum bactérien 11. Si le mélange encre / inoculum se propage facilement (ce est à dire ne conserve pas sous forme de gouttelettes) à la surface des médias, les médias auront besoin de temps supplémentaire pour sécher. NOTE: Pour les espèces qui sont particulièrement sensibles à l&#39;humidité (&lt;em&gt; par exemple, P. aeruginosa), effectuer un «test de l&#39;encre de propagation&quot; rapide 11 pour déterminer si les plaques sont assez sec. </li></ol></li></ol></li><li> Swarm Assay inoculation <ol><li> Inoculer 6 ml de milieux de culture de bouillon (voir le tableau 1 pour plus de détails) avec une colonie isolée à partir d&#39;un (&lt;5 jours si laissé à température ambiante) Lysogénie Broth (LB) la culture de la plaque frais. Incuber les bouillons de culture pendant une nuit (≤18 RH) à 30 ° C ou 37 ° C avec une agitation horizontale (240 rpm). </li><li> Ensemencer essaim en repérant avec 1-5 pi de bouillon de culture pendant la nuit, ou en &quot;poussant&quot; la gélose avec une dent stérile ou une aiguille choisir fil de l&#39;inoculation. REMARQUE: On préfère le dernier procédé, car elle diminue la probabilité de l&#39;inoculum et les éclaboussures empêche ajouter de l&#39;humidité supplémentaire à la zone de surface d&#39;essaims. </li></ol></li><li> Swarm Assay Incubation <ol><li> Pour l&#39;analyse générale, incuber les plaques de dosage d&#39;essaims à 30 °C ou 37 ° C (ou même 42 ° C pendant B. subtilis; Tableau 1) -Il se agit d&#39;une bactérie spécifique. Inverser les plaques pendant l&#39;incubation de telle sorte que l&#39;excès d&#39;humidité se condense sur le couvercle, et non la gélose. REMARQUE: La température peut affecter le phénotype ainsi que la cinétique. Pour P. essaims aeruginosa, l&#39;incubation à 37 ° C conduit à l&#39;expansion de la croissance et plus rapide que essaim incubation à 30 ° C; toutefois, la morphologie de ces essaims diffère souvent avec ce changement de température. </li><li> Pour l&#39;imagerie time-lapse, incuber les plaques d&#39;essaims à la température appropriée avant le transfert dans la station d&#39;imagerie (voir le tableau 1 pour plus de détails). NOTE: Cette incubation pré-imagerie permet essaims commencent leur développement et se établir avant d&#39;être déplacé à un nouvel environnement, qui peut ou peut ne pas être optimale pour l&#39;essaimage motilité. </li></ol></li></ol> 2. imagerie macroscopique de Surface motilité dosages 7,8 &lt;ol&gt; <li> Pour l&#39;imagerie time-lapse, après les pré-imagerie dosage essaim période d&#39;incubation lieu plaques sur une plaque d&#39;imagerie clairement l&#39;intérieur d&#39;un in vivo station d&#39;imagerie commerciale. Image jusqu&#39;à six, 60 mm de diamètre ou quatre, plaques de 100 mm de diamètre à la fois. Etant donné que la caméra capte des images à partir de sous le plan de formation d&#39;image, inverser les plaques de telle sorte que le trajet optique ne est pas obstrué 8. En variante, incuber à 30 ° C ou 37 ° C (Tableau 1) pour la durée de l&#39;expérience, et enlever les plaques à imager de l&#39;incubateur à intervalles de temps fixés. </li><li> Placer les couvercles des boîtes de Pétri en position verticale au-dessus de la contre-plaque qui contient le support inoculé. Remplissez les couvercles des boîtes de Pétri à l&#39;eau pour empêcher une déshydratation excessive lors de l&#39;imagerie, et joindre l&#39;ensemble à l&#39;aide d&#39;un autre bac clair pour maintenir l&#39;humidité tout au long de l&#39;expérience. </li><li> En utilisant l&#39;imagerie moléculaire (MI) 12 logiciels, test (s) de fonctionner à la température ambiante en utilisant l&#39;imvieillissement de paramètres décrits dans le tableau 2. Pour l&#39;imagerie time-lapse, mettre en place un protocole avec les étapes et les spécifications nécessaires. </li></ol> 3. Traitement et interprétation des données 7,8 <ol><li> Traitement d&#39;image <ol><li> Utilisez le logiciel MI pour exporter des images par lots sous forme de fichiers TIFF 16 bits: Fichier&gt; Exporter ou exporter plusieurs&gt; Sélectionnez le fichier (s) d&#39;exporter et de localisation de l&#39;exportation. </li><li> Utilisez ImageJ pour ouvrir une seule image ou importer une série time-lapse: <ol><li> Ouvrez une seule image: Fichier&gt; Ouvrir </li><li> Importer time-lapse séquence d&#39;images: Fichier&gt; Importer séquence, et sélectionnez &quot;Trier les noms numériquement&quot;. <ol><li> Pour les fichiers de time-lapse grandes, sélectionnez «Utiliser pile virtuelle&quot; dans la fenêtre &quot;Importer séquence&quot; d&#39;empiler les images exportées en catégories appropriées (c.-à-GFP, RFP, etc.). </li></ol></li></ol></li><li> Si nécessaire, changer les images à partir de fichiers 16 bits vers des fichiers 8 bits: Image&gt; Type de&gt; 8-bit NOTE: Certains outils de ImageJ exigent images 8-bits. </li><li> Déterminer si le signal d&#39;intensité pour une séquence d&#39;images ou temporisation doit être inversée. Placez le curseur sur un point lumineux dans l&#39;image (par exemple, la croissance marqué par fluorescence) et noter l&#39;intensité du signal &quot;Value&quot; de la barre d&#39;outils ImageJ. Ensuite, placez le curseur dans un endroit sombre à l&#39;extérieur de la zone de plaque et noter l&#39;intensité du signal. Si l&#39;intensité du signal pour la tache sombre est plus grande que l&#39;intensité de la tache lumineuse, l&#39;intensité du signal d&#39;image doit être inversée (suivre les sous-étapes 1-2 ci-dessous). <ol><li> Inverser les signaux d&#39;intensité: Edition&gt; Inverser </li><li> Inversez la table de consultation: Image&gt; Tableaux Lookup&gt; Inverser LUT </li></ol></li><li> Soustraire l&#39;arrière-plan: Processus&gt; Soustraire fond, et d&#39;utiliser un &quot;rayon de Bille roulante&quot; avec un rayon de pixel qui est une moitié d&#39;une dimension d&#39;image (par exemple, 1 000 pixels pour une p 2000 x 2000l&#39;image Ixel). </li><li> Colorer artificiellement une image ou time-lapse séquence: Image&gt; Tableaux Lookup, et sélectionnez la couleur appropriée dans les options de la liste. </li><li> Pour les films avec deux ou plusieurs canaux, de fusionner et d&#39;équilibrer les couleurs avant d&#39;enregistrer comme un film (traitement d&#39;image, l&#39;étape 8). Pour fusionner les images ensemble, ouvert tous les piles d&#39;images dans ImageJ, puis sélectionnez Image&gt; Couleur&gt; Fusionner les couches, et attribuer à chaque pile à un canal de couleur. </li><li> Enregistrer séquence time-lapse en AVI ou QuickTime: Fichier&gt; Enregistrer sous et choisissez le format et les spécifications souhaitée. </li></ol></li><li> Analyse des données <ol><li> Acquisition bactérienne secteur de croissance de la surface pour quantifier Expansion Taux <ol><li> Ouvrir l&#39;image (s) dans ImageJ </li><li> Pour calculer le diamètre de la plaque en pixels, tracer une ligne à travers le centre d&#39;une plaque d&#39;essai avec l&#39;outil &quot;Straight&quot; du et mesurer sa longueur: Analyse&gt; Mesure </li><li> L&#39;unité de mesure par défaut dans ImageJ est le pixel. Obtenir un facteur de conversion en divisant le diamètre de la plaque de dosage (par exemple, 60 pour une plaque de 60 mm) par la longueur de pixel obtenu à l&#39;étape précédente. </li><li> Changer l&#39;unité de mesure de pixel en mm: Image&gt; Propriétés <ol><li> Changer le &quot;Unité de longueur&quot; à &quot;mm&quot;, et le &quot;Pixel Largeur&quot;, &quot;Pixel Hauteur&quot; et &quot;Profondeur Voxel» pour le facteur de conversion calculé à l&#39;étape précédente. Cochez la case &quot;Global&quot; de maintenir ce facteur de conversion sur plusieurs images. NOTE: Si ImageJ est fermé et rouvert, ou le champ de vision d&#39;une image est modifiée (ce est à dire, une image est agrandie de plus qu&#39;un autre), le facteur de conversion doit être recalculée. Sinon, effectuer toutes les analyses en pixels puis converti en mm. </li></ol></li><li> Pour chaque image, tracer et mesurer la superficie des essaims en utilisant l&#39;outil &quot;main levée Sélections» dans la barre d&#39;outils pour tracer l&#39;UOtline de l&#39;essaim et de mesurer la surface à l&#39;aide: Analyse&gt; Mesure. Cela va générer un mesures journal qui peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie dans Microsoft Excel ou des programmes similaires: Fichier&gt; Enregistrer sous </li></ol></li><li> Acquisition bactérienne Intensité de croissance de la surface pour quantifier Surface Taux de croissance <ol><li> Une fois le fond est soustraite (traitement d&#39;image, étape 5), utiliser la dernière image de la séquence pour déterminer la superficie maximale d&#39;essaim (analyse des données, étape 1). </li><li> Utilisez l&#39;outil de sélection &quot;Oval&quot; de la barre d&#39;outils pour dessiner une zone autour de la croissance de la surface bactérienne. </li><li> Définir la mesure d&#39;intensité de pixels dans la boîte à l&#39;aide signifie: Analyse&gt; Définir les mesures et sélectionnez &quot;moyenne valeur de gris&quot;. </li><li> Pour obtenir des mesures de signaux d&#39;intensité pour chaque image de la séquence time-lapse, tandis que sur la première image de la séquence aller à: Analyse&gt; Mesure. Cela va générer un mesures journal qui peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie dans Microsoft Excel ou des programmes similaires: Fichier&gt; Enregistrer sous </li></ol></li><li> Alternative à la section précédente (Analyse de données, étape 2). Utilisez le plugin ImageJ macros à installer et exécuter un script de mesure de l&#39;intensité de la croissance de la surface Macros. <ol><li> Configuration d&#39;un script de mesure automatisé pour analyser plusieurs images simultanément: Plugin&gt; Nouveau&gt; Macro et collez le script fourni (ci-dessous) dans la boîte et enregistrer sous un fichier texte ImageJ Macros: Fichier&gt; Enregistrer et enregistrer dans le dossier de demande de ImageJ sous &quot; macros &quot;. numberOfFrames = N for (i = 0; i &lt;numberOfFrames; i ++) { exécuter («mesure»); exécuter («Suivant Slice [&gt;] &#39;); } NOTE: Voici la variable &quot;N&quot; est pour un nombre indéfini de cadres. </li><li> Modifier les &quot;numberOfFrames&quot; dans le plugin Macros pour chaque expérience afin de refléter le nombre d&#39;images dans la séquence d&#39;image avant d&#39;exécuter le script. Utilisation: Plugin&gt; Macros&gt;Modifier et tapez le nombre correct d&#39;images dans la séquence et enregistrer (Fichier&gt; Enregistrer). </li><li> Suivez sous-étapes 1-3 en Analyse des données Étape 2, et tandis que sur la première image de la séquence de fonctionner le plugin Macros: Plugin&gt; Macros&gt; Exécuter. Cela va générer un mesures journal qui peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie dans Microsoft Excel ou des programmes similaires: Fichier&gt; Enregistrer sous </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility.">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li><li>Burall, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Proteus+mirabilis.+genes+that+contribute+to+pathogenesis+of+urinary+tract+infection:+Identification+of+25+signature-tagged+mutants+attenuated+at+least+100-fold.">et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold.</a> Infection and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa.+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa.">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS One. 6 (6), e20888 (2011).</li><li>Tremblay, J., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+motility+assays.">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li><li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li><li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+waves+of+the+bacterium+Pseudomonas+aeruginosa.+in+propagating+swarms+result+in+efficient+colonization+of+surfaces.">High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 601-609 (2012).</li><li>Morris, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+and+rhamnolipid+production.">Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (23), 8310-8317 (2011).</li><li>Tremblay, J., Richardson, A. P., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa.+swarming+motility+behaviour.">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li><li>Partridge, J. D., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarming:+flexible+roaming+plans.">Swarming: flexible roaming plans.</a> J Bacteriol. 195 (5), 909-918 (2013).</li><li>Patrick, J. E., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+strains+of+Bacillus+subtilis+.do+not+exhibit+swarming+motility.">Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility.</a> Journal of Bacteriology. 191 (22), 7129-7133 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging. , (2014).</li><li>Harshey, R. M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimorphic+transition+in+Escherichia+coli.+and+Salmonella+typhimurium.:+surface-induced+differentiation+into+hyperflagellate+swarmer+cells.">Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91 (18), 8631-8635 (1994).</li><li>Rashid, M. H., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+polyphosphate+is+needed+for+swimming,+swarming,+and+twitching+motilities+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97 (9), 4885-4890 (2000).</li><li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa.+PA14.">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14.</a> Journal of Bacteriology. 189 (9), 3603-3612 (2007).</li><li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic-di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa.:+the+pilY1.+gene+and+its+impact+on+surface-associated+behaviors.">Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors.</a> J Bacteriol. 192 (12), 2950-2964 (2010).</li></ol>

Publication frais pour cet article ont été partiellement parrainés par Bruker Corporation.

Atteindre essaimage reproductible dans un laboratoire peut être difficile, que des tests d&#39;essaims sont très sensibles à des facteurs environnementaux, tels que l&#39;humidité et les éléments nutritifs disponibles. L&#39;aspect le plus critique d&#39;un essai sur plaque de la motilité de surface est l&#39;humidité sur la surface de la gélose. Avant l&#39;inoculation, les médias d&#39;essaims doivent être suffisamment sec pour empêcher les cellules bactériennes de la natation à travers le liquide de surface, mais pas si sec que pour inhiber la motilité 5 essaimage. L&#39;incubation devrait avoir lieu dans un environnement suffisamment humide: trop peu d&#39;humidité peut entraîner dans le dosage dessèchement pendant l&#39;incubation, alors que trop d&#39;humidité peut conduire à la diffusion de surface artificielle, soit un artéfact. Sauf un incubateur à humidité contrôlée est à portée de main, incubateur et laboratoire d&#39;humidité peut varier considérablement. Par conséquent, un réservoir d&#39;eau supplémentaire, un humidificateur, un déshumidificateur ou à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur peuvent être nécessaires pour éviter un séchage excessif ou l&#39;accumulation de l&#39;excès d&#39;humidité tout en maintenant la relative humidité près de 80%. Le maintien de ce taux d&#39;humidité idéal peut se avérer difficile si des changements d&#39;humidité saisonniers sont importants. Si ce est le cas, le protocole de dosage essaim exigera certains ajustements pour tenir compte des variations saisonnières de l&#39;humidité. Nous avons trouvé que la modification du temps de séchage des médias essaim est la façon la plus simple pour ajuster les changements d&#39;humidité saisonniers. Contrôle de l&#39;humidité constante, à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur, est recommandée. En outre, il est recommandé que les chercheurs calibrer et valider leurs instruments, des incubateurs, des échelles, etc. erreurs comme mineures dans la température, le volume ou quantités de composants de médias peuvent avoir un impact reproductibilité de ces essais. Il convient également de noter que le type et la taille de la plaque utilisée dans le dosage peuvent affecter plaque humidité, et donc l&#39;essaimage. Plaques hermétique Ne pas évacuer l&#39;excès d&#39;humidité, ainsi piscine encourageants motilité. En revanche, les plaques ouvertes face permettent trop d&#39;humidité de se échapper. Une boîte de Pétrifournit un environnement idéal car il évacue l&#39;excès d&#39;humidité assez large pour empêcher le liquide se accumuler, mais conserve suffisamment d&#39;humidité pour empêcher les médias de se dessécher. Cette méthode détaille un protocole de dosage de la motilité de surface qui permet la formation d&#39;image de haute qualité. Pour garder l&#39;agar clair pour les plats imagerie 60 mm de diamètre sont remplis avec 7,5 ml de milieu agar. Si l&#39;imagerie détaillée ne est pas nécessaire, le volume jusqu&#39;à 20 ml peuvent également fournir des résultats reproductibles. Alors que la motilité essaimage peut être réalisé sur un large éventail de concentrations de gélose, la plage optimale d&#39;agar requis pour essaimage dépend de l&#39;espèce. Dans l&#39;ensemble, les concentrations de gélose élevés inhibent la motilité essaimage, et par conséquent le temps nécessaire pour produire un essaim augmentations d&#39;image prêt. P. aeruginosa grouille généralement sur ​​les concentrations de gélose entre 0,4-0,7% 1, mais nous constatons que l&#39;essaimage optimale se produit dans une gamme beaucoup plus étroite (0,4 à 0,5% de). D&#39;autres, comme B. subtilis et S. entériqueun essaim à 0,6% d&#39;agar, et Vibrio parahaemolyticus à 1,5% d&#39;agar 10. La concentration nécessaire agar est également déterminée par le type et la marque d&#39;agar. Géloses de pureté plus élevée, comme l&#39;agar Noble, améliorer fortement pullulent dans les P. aeruginosa et on préfère plus granulé agar 13,14. Toutefois, ces versions purifiées de gélose sont également plus susceptibles de caramélisation pendant le cycle de stérilisation en autoclave; en fonction de l&#39;instrument, une séquence raccourci / modifiées de stérilisation (pour modifier éventuellement le cycle d&#39;échappement pour éviter toute exposition prolongée à la chaleur) peut être nécessaire pour préparer les médias essaim utilisant agar Noble. Composition de médias jouent également un rôle dans l&#39;essaim phénotype observé trois. P. aeruginosa études de motilité essaimage sont généralement effectuées à l&#39;aide des milieux nutritifs minimaux. Nous préférons FAB moyenne 4,8 (tableau des matériaux), mais d&#39;autres médias, tels que M9, LB, ou de légères variations à ces médias communs,ont été utilisés avec succès 9,15,16. Formation vrille est mieux réalisée sur FAB milieu minimum complété avec du glucose comme source de carbone et d&#39;hydrolysat acide de caséine (CAA), mais sans source d&#39;azote supplémentaire (ce est-(NH 4) 2 SO 4) 6,13. Si la formation de vrille ou la morphologie ne est pas l&#39;objectif principal de l&#39;étude, puis FAB milieu minimal (tableau Matériaux; Tableau 1) dépourvu de CAA est recommandé de sorte que les effets des sources de carbone spécifiques et / ou des nutriments supplémentaires peuvent être étudiés en détail. D&#39;autres espèces, telles que B. subtilis (présenté ici), sont swarmers polyvalents, capables d&#39;essaimage sur LB agar et granulé. Ces espèces pullulent facilement, nécessitant seulement ~ 10 h à développer un essaim plein. Ce taux essaimage rapide fait suite à la progression de l&#39;essaim potentiellement difficile, mais notre protocole rend une telle suivi très faisable. La possibilité d&#39;effectuer essaim imagerie time-lapse fournit un intérêt detiel facilité dans l&#39;acquisition de données essaim, en particulier de ces swarmers avides. Nous introduisons un solide, complet, le protocole à deux phases et des lignes directrices visant à améliorer l&#39;exécution et la reproductibilité de la recherche de la motilité de surface bactérienne et avons surtout mis l&#39;accent sur les aspects important d&#39;examiner essaimage flagellaire médiation. Ce protocole d&#39;essai essaim détails des aspects importants de la composition et la manipulation des plaques de la motilité de surface médias à fournir une plus grande cohérence et la reproductibilité à l&#39;intérieur et entre les groupes de recherche. Cela permettra d&#39;améliorer la base de la comparaison entre les différentes études de recherche. En outre, l&#39;approche présentée et le protocole fournit les moyens de faire des recherches sur l&#39;essaimage et la surface motilité moins sensibles aux variations de l&#39;environnement en faisant chercheurs conscients que ces facteurs influent sur ​​leur travail et fournir des solutions possibles (par exemple, comment de petits changements dans la gélose affectent essaimage 4,5 ). En outre, le protocole prévu pourquantifier aspects macroscopiques de l&#39;essaimage, fournit l&#39;occasion de mesurer de nombreux attributs de la croissance de la surface bactérienne qui étaient auparavant impossibles à quantifier. Nous ne avons pas examiné toutes les bactéries mobiles de surface dans le développement de ce protocole. En tant que tel, il est prévu que les modifications du protocole seront requis pour les espèces ne sont pas présentés ici. L&#39;efficacité de ce protocole est restreint par les limites inhérentes de l&#39;équipement et des matériaux employés. Par exemple, des études sur les températures ne sont pas encore possible avec la station de formation d&#39;image Bruker, étant donné que la régulation de température ne est pas une fonction de l&#39;équipement. En outre, l&#39;utilisation de colorants (comme le rouge Nil pour colorer rhamnolipides) peut avoir des limitations cinétiques et de concentration 8. Cette technique repose fortement sur le traitement et l&#39;analyse d&#39;images numériques; amélioration de l&#39;automatisation de l&#39;analyse des données (par exemple, en utilisant des macros supplémentaires de la fonction de script dans ImageJ) permettrait de réduire le temps nécessaire pour l&#39;analyseet d&#39;élargir l&#39;utilité des données. Enfin, en raison de la robustesse du protocole d&#39;imagerie, les applications futures devraient viser à développer cette technique pour examiner les surfaces de croissance moins uniformes qui sont plus pertinents pour les surfaces colonisées par des bactéries de l&#39;environnement et pathogènes.

De nombreuses bactéries se déplacent sur des surfaces en utilisant divers moyens d&#39;auto-propulsion. Des phénotypes de motilité peuvent être recherchés dans le laboratoire en utilisant des dosages de plaques qui sont affectées par l&#39;environnement liquide associé à la composition de dosage de plaque semi-solide. Un sous-ensemble de la surface utile essais sur plaque de motilité implique en outre un air en phase gazeuse, généralement chambre. En conséquence, le résultat de tout essai de motilité de surface particulier, exige un contrôle minutieux de l&#39;interface de trois phases: la surface solide de l&#39;environnement locale, de l&#39;environnement, liquide et propriétés de l&#39;environnement de gaz. Le mode de motilité plus couramment étudié dans un tel essai triphasé est connue comme l&#39;essaimage. Essaimage motilité est le mouvement coordonné de groupe de cellules bactériennes qui sont propulsés par leurs flagelles par des films minces sur des surfaces liquides 1. Il est généralement étudiée dans des laboratoires utilisant des dosages de plaques semi-solides contenant 0,4% -0,8% (poids / volume) d&#39;agar 1. Un tableau deagents pathogènes humains exploitent cette motilité comportement d&#39;explorer et de coloniser l&#39;hôte humain. Par exemple, Proteus mirabilis utilise essaimage motilité se déplacer jusqu&#39;à l&#39;urètre, d&#39;atteindre et de la colonisation de la vessie et les reins 2. Motilité essaimage est généralement considéré comme une étape de précurseur de la formation de biofilm, la principale cause de la pathogenèse dans de nombreux agents pathogènes humains 3. Le phénotype essaimage est très varié parmi les espèces bactériennes; le succès et la reproductibilité expérimentale se appuient fortement sur ​​des facteurs tels que la composition en éléments nutritifs, le type et la composition de la gélose, le protocole de stérilisation (par exemple, autoclavage), semi-solide durcissement des médias, et de l&#39;humidité ambiante (par exemple, les changements saisonniers), entre autres 3-5. La variabilité des réponses de la motilité de surface souligne les difficultés rencontrées dans ces études et les médias d&#39;influence notable et environnement peuvent exercer. Pour certaines espèces, grouillant comme Pseudomonas, mot essaimageilité peut se produire sur une variété de compositions de presse, bien que le phénotype observé et accompagnant taux d&#39;expansion de l&#39;essaim peuvent varier grandement 3. Ensemble, ces facteurs peuvent faire des études de la motilité de surface extrêmement difficile. La variabilité saisonnière dans un laboratoire peut influencer ces essais en trois phases: tests peuvent mieux fonctionner dans l&#39;air humide de l&#39;été et pire dans l&#39;air sec de l&#39;hiver. Nous présentons ici des lignes directrices générales pour contourner certains des défis les plus remarquables lors de la réalisation des études de la plaque de la motilité de surface. Pour certaines études de motilité de surface, le développement de phénotypes spécifiques est d&#39;un grand intérêt. La plupart, mais pas tous, les études publiées à examiner essaimage de P. aeruginosa correspond à la formation de vrilles ou fractales rayonnant à partir d&#39;un centre d&#39;inoculation 9.3. Différences entre P. souches aeruginosa ont été documentés 5,8, mais une grande partie de la présence ou l&#39;absence de vrilles peuvent être attribué au spécifimilieu de c et le protocole utilisés pour ces essais sur plaque essaim de la motilité. Ici, nous inclure des détails sur la façon de promouvoir essaims de vrille formation pour P. aeruginosa. Parce que P. aeruginosa est juste une des nombreuses bactéries essaimage, nous incluons aussi les détails de notre méthode pour examiner l&#39;essaimage de Bacillus subtilis et de glisse des Myxococcus xanthus. Comme P. aeruginosa, la recherche actuelle sur B. subtilis et M. xanthus couvre un éventail de sujets que les chercheurs travaillent à discerner les aspects de la sporulation, la motilité, la réponse au stress, et le comportement transitoire 1,10. Il est nécessaire de quantifier les caractéristiques et la dynamique du comportement (s) spécifique de ces cellules dans des groupes essaimage. acquisition de données de la motilité de surface, l&#39;analyse et l&#39;interprétation peut être lourd et qualitative. Nous avons élaboré un protocole pour l&#39;analyse macroscopique détaillée des essaims bactériennes qui fournit en plus à essaimer zone morphologie et sIze (par exemple, de diamètre), des informations dynamiques quantitatives concernant le taux d&#39;expansion de la nuée et de la distribution ou de la densité bactérienne de bioproduits 7. En outre, cette méthode peut profiter de protéines fluorescentes disponibles, la luminescence, et des colorants pour obtenir une vue complète des interactions bactériennes 8, ainsi que de suivre la synthèse des bioproduits (par exemple, P. aeruginosa rhamnolipide 7,8) dans un essaim.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

La motilité de surface bactériennes, telles que l&#39;essaimage, est couramment examinée dans le laboratoire en utilisant des dosages de plaques qui nécessitent des concentrations spécifiques de gélose et parfois inclusion de nutriments spécifiques dans le milieu de croissance. La préparation de ces milieux explicites et les conditions de croissance de la surface sert à fournir les conditions favorables qui permettent la croissance bactérienne, mais pas seulement la motilité coordonnée de bactéries sur ces surfaces à l&#39;intérieur films liquides minces. Reproductibilité de la plaque d&#39;essaim et d&#39;autres essais sur plaque de la motilité de surface peut être un défi majeur. Surtout pour les plus &quot;swarmers tempérées&quot; qui présentent la motilité seulement dans des plages de gélose de 0,4% -0,8% (poids / vol), de modifications mineures dans le protocole ou l&#39;environnement de laboratoire peut grandement influencer les résultats d&#39;analyse de l&#39;essaim. &quot;Mouillabilité&quot;, ou la teneur en eau à l&#39;interface liquide-solide-air de ces essais sur plaque, est souvent une variable clé à contrôler. Un défi supplémentaire dans l&#39;évaluation de l&#39;essaimage est comment quantifier observed différences entre deux (ou plusieurs) des expériences. Ici, nous en détail un protocole polyvalent en deux phases pour préparer et analyses d&#39;image essaim. Nous incluons des lignes directrices pour contourner les difficultés généralement associées à dosage essaim préparation des milieux et la quantification des données de ces essais. Nous démontrons spécifiquement notre méthode en utilisant des bactéries qui expriment journalistes génétiques fluorescentes ou bioluminescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP), la luciférase (lux opéron), ou des taches cellulaires pour permettre l&#39;imagerie optique time-lapse. Nous démontrons encore la capacité de notre méthode pour suivre les espèces essaimage concurrence dans la même expérience.

Variation en préparation de la plaque peut grandement influencer la motilité essaimage. Le durcissement ou le séchage après la coulée du milieu gélose fondu affecte la mince pellicule de liquide présent sur les dosages de la motilité de surface et la motilité des bactéries au cours du temps. Changements dans la composition des nutriments affectent également l&#39;essaimage pour plusieurs bactéries. Figure 1A montre un effet à court terme de temps de séchage sur la diffusion de l&#39;encre de Chine et la diffusion d&#39;un inoculum initial de Bacillus subtilis 11. Figure 1B montre l&#39;effet du temps de séchage et spectacles figure 1C les effets du sulfate d&#39;ammonium [(NH 4) 2 SO 4] sur le développement de vrille ultérieure par essaimage P. 5 aeruginosa. Données chiffrables peuvent être obtenus à partir d&#39;images de la motilité extrémité de la surface de formation d&#39;image en utilisant des stratégies multiples. La figure 2 montre les résultats de la croissance de la surface de représentation pour <em&gt; P. aeruginosa fourmillement et son image de fluorescence de la GFP est associé; B. subtilis essaimage et son image de bioluminescence associé; et la croissance de la surface de Myxococcus xanthus et l&#39;image de fluorescence rouge associée de SYTO 64 cellules colorées. Expansion de l&#39;acquisition de données au-delà de l&#39;inspection et de l&#39;imagerie des résultats de point final permet l&#39;étude du comportement dynamique (s) pour la croissance des bactéries de surface. Figure 3 7 montre un exemple de P. aeruginosa essaimage (imagée pour les cellules exprimant la GFP) et sa production de rhamnolipide associé (imagée en utilisant du Nil Rouge lipides tache) -le quantification des données de ces images est également affichée pour montrer le taux de P. d&#39;expansion aeruginosa essaimage. Vidéo 1 montre un time-lapse de B. subtilis essaimage imagé en utilisant une luminescence d&#39;une souche dites-vous de lux. Vidéo 2 8 montre un time-lapse de P. aeruginosa </em&gt; (vert-exprimant la GFP) et de Salmonella enterica sérotype Typhimurium (lux rouge exprimant) dans un essai essaim concurrentiel. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> Figure 1: Exemples de facteurs dans la préparation du test de motilité de surface qui affectent le résultat essai Effet de (A) un temps de séchage de l&#39;humidité sur agar-agar de surface et d&#39;étalement de l&#39;inoculum de B.. subtilis (réf 8), (B) le temps de séchage de gélose sur P. aeruginosa essaimage (tiré à part de Réf 5 avec permission), et (C) la présence ou l&#39;absence de sulfate d&#39;ammonium sur P. aeruginosa essaimage et la formation de vrille. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> Figure 2: Alternative approches pour la croissance de la surface de formation d&#39;image et la motilité des bactéries en utilisant une station d&#39;imagerie Bruker. latéral image latérale d&#39;un appareil photo (à gauche) et l&#39;image par Bruker (à droite) montrant (A) P. aeruginosa exprimant la GFP-imagée en utilisant les paramètres fluorescence verte, (B) B. subtilis exprimant lux bioluminescence journaliste imagée en utilisant les paramètres de luminescence, et (c) M. xanthus colorées avec SYTO 64 imagées en utilisant les paramètres Rouge fluorescence II. Voir le tableau 2 pour les détails de configuration. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> Figure 3:. L&#39;analyse qualitative et quantitative d&#39;un essai de motilité de surface (A) analyse time-lapse de distribution de la densité cellulaire, la production rhamnolipide (tache rouge Nil lipide imagée en utilisant la fluorescence rougeJe paramètres; barre d&#39;échelle = 15 mm), et (B) quantification du taux à partir d&#39;images de distribution de la densité des cellules d&#39;une extension de P. essaim aeruginosa. (Tiré de 6 Réf avec permission.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">Vidéo 1.</a> d&#39;imagerie time-lapse d&#39;un B. subtilis essaim. B. subtilis exprimant lux et enregistré en utilisant les paramètres de luminescence. Voir le tableau 2 pour les détails de configuration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">Vidéo 2.</a> concurrence interspécifique visualisée par imagerie time-lapse. Des essaims de P. aeruginosa (vert; exprimant la GFP et enregistré en utilisant les paramètres fluorescence verte) et S. enterica sérotype Typhimurium (rouge; expreschanter lux et enregistré en utilisant les paramètres de luminescence). Voir le tableau 2 pour les détails de configuration. (Réimpression avec la permission de 7 Réf.) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> P. aeruginosa </td><td> P. aeruginosa études de formation de vrille </td><td> B. subtilis </td><td> M. xanthus </td></tr><tr><td> Bouillon nuit milieux de culture </td><td> FAB plus 30 mM de glucose </td><td> FAB plus 30 mM de glucose </td><td> LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td> Bouillon nuit la température d&#39;incubation de la culture </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 h à 30 ° C </td></tr><tr><td> médias Swarm </td><td> FAB </td><td> FAB moins (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2% (poids / volume) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>médias Swarm: composants supplémentaires </td><td> 12 mM de glucose a </td><td> 10% (poids / volume) de CAA, 12 mM de glucose a </td><td> n / a </td><td> SYTO® 64 a </td></tr><tr><td> Type Agar </td><td> Agar, Noble </td><td> Agar, Noble </td><td> Agar granulé </td><td> Agar, Noble Affymetrix </td></tr><tr><td> Agar concentration (poids / volume) </td><td> 0,45% </td><td> 0,45% </td><td> 0,60% </td><td> 1,50% </td></tr><tr><td> Taille de la plaque Swarm </td><td> 60 mm </td><td> 60 mm </td><td> 100 mm </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> volume de médias par plaque </td><td> 7,5 ml </td><td> 7,5 ml </td><td> Coulé à la main </td><td> Coulé à la main </td></tr><tr><td> réglage du support de Swarm / méthode de séchage </td><td> Hotte; plaques découvert </td><td> Hotte; plaques découvert </td><td> Paillasse; plaques recouvertes </td><td> Paillasse; plaques recouvertes </td></tr><tr><td> réglage du support de Swarm / temps de séchage </td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> Nuit (20 -24 h) </td><td> Nuit (20 -24 h) </td></tr><tr><td> Swarm température dosage d&#39;incubation </td><td> 30 ou 37 ° C </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> Incubation de déchéance imagerie en temps </td><td> 30 ° C pendant au moins 4 heures </td><td> 30 ° C pendant au moins 4 heures </td><td> 37 ° C pendant 2 heures </td><td> RT pendant 12 heures </td></tr><tr><td> Time-lapse durée de capture </td><td> 24 h </td><td> 24 h </td><td> 10 h </td><td> 66 h </td></tr><tr><td> Paramètre Time-lapse </td><td> 1 image / 10 min </td><td> 1 image / 10 min </td><td> 1 image / 6 min </td><td> 1 image / 10 min </td></tr><tr><td colspan="3"> A ajoutée après l&#39;autoclavage. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Spécifications pour Surface motilité Assay préparation comprend surfaceanalyse de la motilité spécifications de préparation pour P. aeruginosa, B. subtilis, et M. xanthus. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Signal </td><td> Fluorescence Verte </td><td> Red Fluorescence je </td><td> Red Fluorescence II </td><td> Luminescence </td></tr><tr><td> Protéine ou colorant </td><td> Vert Fluorescence Protein (GFP) </td><td> protéines mCherry ou rouge Nil rhamnolipide tache </td><td> SYTO® 64 </td><td> Luciférase de lux opéron </td></tr><tr><td> Excitation longueur d&#39;onde (nm) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> De </td></tr><tr><td> longueur d&#39;onde d&#39;émission (nm) </td><td> 535 ± 17,5 </td><td> 600 ± 17,5 </td><td> 670 ± 17,5 </td><td> Pas de filtre </td></tr><tr><td> Temps d&#39;exposition (s)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> arrêt f- </td><td> 4.0 </td><td> 4.0 </td><td> 2,5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> FOV (mm) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Plan focal (mm) </td><td> 27,5 </td><td> 27,5 </td><td> 12,2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Binning (pixels) </td><td> Aucun </td><td> 2 x 2 </td><td> Aucun </td><td> 8 x 8 </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Imagerie Spécification des spécifications de la station d&#39;imagerie Bruker pour la fluorescence rouge et vert, et l&#39;imagerie de luminescence de la croissance de la surface bactérienne..

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays at JoVE.com

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Préparation, imagerie, et la quantification de la surface bactérienne motilité dosages

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vues.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Vidéo: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Recherche

Biologie

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Surveiller la motilité gastro-intestinale (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

L&#39;avidité d&#39;un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imagerie et analyse automatisées pour la quantification des macropinosomes marqués par fluorescence

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

Quantification de la concurrence interbactérienne à l’aide de l’imagerie par fluorescence unicellulaire

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualisation de la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...