The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTE: L&#39;Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité a approuvé toutes les expériences. 1. Préparation des instruments échographie microinjection et d&#39;embryons <ol><li> Mettre en place scène, montage, et la sonde (Figure 1) ainsi que les instruments chirurgicaux (figure 2). Lieu tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4) dans un bain C de réchauffement de 37 °. Remplir entièrement l&#39;aiguille de micro-injection d&#39;huile minérale, en utilisant une seringue ml fixée à une seconde aiguille souple 25 G, à travers sa base. </li><li> Fixer aiguille sur la rotation bras monter, et l&#39;aiguille vide de la solution de l&#39;huile minérale. Re-remplir de 2,5 pi de solution de TL. Veiller à ce que les bulles d&#39;air sont présents au sein de l&#39;aiguille d&#39;injection. Tournez bras d&#39;aiguille vers le mur, loin de la scène. </li><li> Anesthésier la femme enceinte dans la chambre anesthésie par perfusion continue de l&#39;isoflurane. Quand la mère est rendu inconscient, transférer l&#39;anesthésie au tube de nez positionné sur le caudal côté de la scène, la mère et le lieu en position couchée avec le museau dans le tube de nez pour permettre la continuation d&#39;un état complètement anesthésiés. </li><li> membres de bande en angle de 45 °, ou avec les mains et les pieds reposaient et positionnés Overtop ECG onglets / de contrôle de la température. Il est important que le barrage enceinte est surveillé en permanence pour se assurer que l&#39;anesthésie est suffisante et que dans une pommade appliquée sur les yeux pour réduire le séchage. </li><li> Appliquer le produit d&#39;épilation dans le bas-ventre de la mère, essuyer doucement avec des cotons-tiges sèches, puis de nouveau avec 70% des cotons-tiges éthanol saturé de supprimer ne importe quel produit et l&#39;excès de poils. Assurez-vous de nettoyer la peau abdominale hors de tous les cheveux sur le site de l&#39;incision (Figure 3). </li><li> Effectuez une laparotomie sur la mère enceinte en utilisant des pinces et ciseaux chirurgicaux fines. Prenez soin d&#39;éviter de couper les gros vaisseaux ou organes viscéraux. Faire la première incision droite de l&#39;épiderme 1,5-2 cm au-dessus du vagin et continuent couper vers les côtes pour approximatEly 2-3 cm. Exposer la membrane sous-cutanée, repérez la ligne blanche (&quot;ligne blanche&quot;) (figure 3), et une coupe parallèle à l&#39;incision initiale, le long de la même longueur, pour exposer interne organes viscéraux et saccules utérines. </li></ol> 2. Extraction des embryons <ol><li> Utilisez applicateurs de coton-tige de 6 pouces à manoeuvrer mère et embryons. Poussez doucement (ne pas forcer) sur la peau avec applicateur à manipuler premier embryon de l&#39;ouverture de l&#39;incision. Après extraction de la première saccule de l&#39;embryon, doucement et lentement tirer le reste de la corne de l&#39;utérus à travers et sur l&#39;extérieur de la mère. Évitez de tirer intestin ou d&#39;autres organes via une incision à ce stade. </li><li> Quantifier embryons et placez doucement corne utérine arrière gauche en mère. Puis commencer à placer la corne utérine droit de retour dans la mère en commençant par le plus embryon de saccule du vagin sur la corne et le déplacement vers le bas. Continuer ainsi jusqu&#39;à ce que deux embryons restent exposés (Figure 4). Enfin, les embryons de position dans une colonne ci-dessus et parallèle à la ligne incision, en étant conscient de ne pas couper la circulation de l&#39;utérus. </li><li> Placer des blocs d&#39;argile et de la situation entre les bras et le corps, ainsi que des pattes et la queue. Veiller à ce que les surfaces d&#39;argile sont approximativement au niveau de laparotomie. Mouiller la boîte de Pétri fenestré avec 37 ° C PBS. </li><li> Saisissez étendant pince de la main droite et le plat fenêtrée Petri avec la main gauche (fenestration parallèle à embryons) et porter fermé pince ~ 5 cm à travers fenestration, du haut de la boîte de Pétri. Pince complètement ouvert sans déchirer fenestration maille. </li><li> Manœuvrer mains au-dessus des embryons et de se concentrer vue sur les deux saccules d&#39;embryons. Sans (ou légèrement) toucher saccules avec maillage de fenestration ou une pince, les glisser par la fente et mis boîte de Pétri sur l&#39;abdomen de la mère. Avec des pinces encore étendues, manipuler maille fenêtrée pour asseoir sur chaque côté et à la base de chaque embryon (figure 5 </strong&gt;) et tirez forceps sur l&#39;ouverture de la fente. </li><li> Ensuite, placez caoutchouc bleu contenant mur dans boîte de Pétri, sans pincement ou de blesser embryons (Figure 6). Assurez-vous que les blocs d&#39;argile sont fermement équilibrage boîte de Pétri, embryon, et le mur contenant du caoutchouc. Enfin, remplissez boîte de Pétri avec 37 ° C jusqu&#39;à ce que PBS embryons sont complètement submergés (Figure 6), tout en contrôlant les fuites au maillage fenêtrée. </li></ol> 3. Procédure d&#39;injection <ol><li> Étage inférieur d&#39;injection avec la mère et les embryons vers le bas en utilisant le réglage de niveau Z bouton (Figure 1), puis tourner l&#39;aiguille d&#39;injection et le bras de montage et aligner directement avec sonde à ultrasons, avec ½ aiguille cm à gauche et sous la pointe de la sonde (Figure 7) . Poussez l&#39;aiguille-bras (pas aiguille) 45 ° par rapport à la sonde. Veillez à ne pas frapper la pointe de l&#39;aiguille avec la sonde de plat ou ultrasons. </li><li> Levez étape d&#39;injection revenir à hauteur d&#39;origine, avec des ultrasons probe directement au-dessus de la sonde embryons doit être légèrement submergé et dans 3-4 mm du tissu embryonnaire. Utilisez X &amp; Y ajustement stade boutons (figure 8) de modifier la position embryon / mère / étape pour localiser systématiquement cœur battant embryonnaire. </li><li> Directement centre de l&#39;écran de l&#39;échographie observer un marqueur cible centrale noire dessinée (*). Localiser ventricule gauche (de préférence) ou atrium en utilisant les boutons de réglage de scène X &amp; Y (Figure 8), puis augmenter ou diminuer la scène avec le bouton tournant sur ​​la scène pour positionner la cible d&#39;injection précisément sur ​​le centre marqueur noir sur l&#39;écran de l&#39;échographie. </li><li> Utilisez X bouton de réglage de scène pour déplacer embryon vers la droite, hors de l&#39;écran de l&#39;échographie. Repositionner l&#39;aiguille de microinjection et le bras en place, ½ cm de distance et 90 ° à la sonde à ultrasons (figure 7). </li><li> Avec microinjection montage boutons de réglage (Figure 9C-G), l&#39;aiguille de position avec la pointe clairement alSIGNÉ avec le repère central. Ajuster l&#39;angle d&#39;injection (en utilisant les boutons de la figure 9C &amp; EG), et X, Y, Z et vecteurs de micro-aiguille pour assurer pointe de l&#39;aiguille est concentrée dans le bon plan. Rentrer aiguille de microinjection utilisant uniquement le bouton &quot;injection&quot; (figure 9F), attention de ne pas ajuster les autres dimensions. </li><li> Encore une fois, en utilisant uniquement l&#39;X fine bouton de réglage de scène mouvement embryon de retour sous la sonde, avec la cible exactement sur la marque centrale sur l&#39;écran de l&#39;échographie. Assurez-vous que le ventricule gauche est maintenant exactement sur la même X, Y, et Z avion. </li><li> Ensuite, avec juste la &quot;injection&quot; bouton sur le micro-injection de montage, percer lentement embryon avec l&#39;aiguille de microinjection et porter doucement pointe dans le ventricule gauche. Injecter la totalité des 2,5 pi de solution de TL dans le ventricule gauche ou jusqu&#39;à ce que les avertissements sonores vides, en tenant «vide» et en tapant &quot;remplir&quot; une fois (Figures 2A et B). À ce momentinjection d&#39;observer une ombre émanant de la pointe de l&#39;aiguille qui est la TL entrant dans la chambre cardiaque (figure 10). À l&#39;inverse, se rétracter rapidement aiguille de microinjection tournant le &quot;injection&quot; bouton (Figure 9F) sur la micro-injection de montage lorsque l&#39;injection est terminée. </li><li> Continuer à côté embryon et répétez cette procédure pour embryons restants suivants cette série d&#39;étapes et enfin placer les embryons finales retour dans l&#39;abdomen de la mère. Mettez l&#39;anesthésie à la boîte de chambre et déplacez doucement mère ici pour 15 min de temps de la dernière injection. </li></ol> 4. récolte embryons et analyse <ol><li> Sacrifiez barrage par dislocation cervicale. Développez la laparotomie pour enlever facilement cornes utérines de la mère. Garder les embryons dans les utérine sac. Placez les embryons in réfrigérés PBS. </li><li> Disséquer embryons de l&#39;utérus sac (si le tissu collecte nécessaires pour le génotypage) et placer le tout embryon in 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit, puis dans 30% de saccharose nuit, geler en coupe cryostat moyenne. Ensuite, couper l&#39;cryosection et le placer sur des lames pour l&#39;analyse immunohistochimique. Vous pouvez éventuellement utiliser des tissus pour l&#39;ensemble de montage par déshydratation dans 100% de méthanol, après fixation dans 4% PFA. </li><li> Pour l&#39;analyse immunohistochimique placer les cryosections dans PBS pour éliminer les PTOM. Puis bloquer les sections avec 10% de sérum de âne normale pendant 30 min. Puis ajouter anticorps primaire PECAM au 1: 100 dilution nuit à 4 ° C. Le lendemain, laver les lames dans PBT trois fois pendant 10 min chacun et ajouter d&#39;âne anti rat 594 secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante. NOTE: Ce est une technique très exigeantes nécessitant l&#39;optimisation et la coordination de l&#39;échographie et de la micro-injection. Il ya une courbe d&#39;apprentissage très raide liés à cette technique et nécessite de quatre à six semaines d&#39;injections encadrés avant on devient compétent. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microinjection anesthésie et délais En ce qui concerne l&#39;anesthésie de la mère, il est essentiel de maintenir constant d&#39;air (2-3 L / min) et à faible PSI. Le débit de la sédatif doit être maintenue à environ 1,75 à 2 L / min. Simultanément, les délais dans lesquels les injections ont lieu doivent être étroitement surveillés et contrôlés pour chaque portée. Pour chaque portée de la procédure d&#39;injection doit être maintenu sous 45 min. L&#39;importance de ce d...

Pendant le développement embryonnaire, deux processus vasculaires discrets, mais simultanées ont lieu: l&#39;angiogenèse, le processus par lequel un navire se développe à partir d&#39;un grand navire et vasculogenèse pré-existante, qui est une formation de novo de vaisseaux de progéniteurs endothéliaux résidentiels 1,2. Respectivement, le premier est synonyme de flux sanguin, tandis que le second est pensé à prendre largement en l&#39;absence de celui-ci. Simultanée à la formation des vaisseaux sanguins, un processus cyclique et dynamique de la synthèse rénale des cellules progénitrices, la prolifération et la différenciation commence à se dérouler le jour embryonnaire 9,5 (de E9.5). À ce stade, le bourgeon urétéral (UB) envahit le dos en entourant mésenchyme métanéphrique (MM), et se poursuit jusqu&#39;à la naissance 3. Répétées ramification de la condensation dans UB rapidement métanéphrique bouchon mésenchyme commence la formation des unités fonctionnelles du rein, néphron. Avec chaque nouvelle génération de UB et nephron, les générations plus âgées sont déplacés dans des régions intérieures corticales et médullaires, où ils subissent ensuite encore maturation et la différenciation dans des environnements essentiellement vasculaire denses. Comme le montre Dressler et al., 3, ce procédé est précipité par embryologique signalisation inductive, telle que la diaphonie entre UB et MM, et une myriade de facteurs extracellulaires 6.3. Deux facteurs extracellulaires récemment étudiés dans le pancréas et les reins en développement comprennent la tension d&#39;oxygène et la circulation sanguine 7,8. Ce dernier sera discuté plus en détail ci-dessous en relation avec le développement du rein. Afin d&#39;exposer le rôle inductive que le flux sanguin peut jouer dans la différenciation néphrons des cellules progénitrices, ainsi que dans d&#39;autres processus d&#39;organogenèse, méthodes précises et exactes de cartographie de flux sanguin embryonnaire est impératif. D&#39;autres méthodes de mesurer le flux sanguin comprennent la prescription de ulimagerie trasound et de résine jette 9,10. En conclusion, ces modes ont été montré à faire défaut en soi dans leur capacité à dévoiler simultanément juxtapositions temporelles et spatiales entre la circulation sanguine et différenciation des cellules souches. moulages en résine, par exemple, offrent un modèle valide de formation de motifs de navire dans les tissus adultes, mais dans des vaisseaux immatures, tels que les points de temps avec embryonnaires, les navires sont nettement sous-développé et qui fuit. Par conséquent, la résine jette ne parviennent pas à tenir dans les petits vaisseaux, souvent poreuse,. Pour ces obstacles apparents, entre autres, nous avons choisi d&#39;intégrer guidée par échographie in vivo intra-cardiaques lectine de tomate embryonnaire (TL) en micro-injections dans nos enquêtes de développement du rein. Dans cette procédure, nous utilisons une sonde à ultrasons pour guider l&#39;aiguille d&#39;une manière synchrone monté micropipette remplie de 2,5 pi de solution de TL dans le ventricule gauche d&#39;embryons de souris E11.5 en des points, E13.5, E15.5 et E17.5 temps. E170,5 est le stade de développement plus tard que les aiguilles ne sont pas assez fort pour pénétrer l&#39;embryon plus développé. Les avantages de ce procédé de micro-injection sont abondants. microinjection guidée par échographie permet un positionnement précis d&#39;une aiguille d&#39;injection dans le ventricule embryonnaire gauche, l&#39;expulsion passif et contrôlée de solution dans le cœur battant de l&#39;animal, un minimum de dommages à cœur et les tissus environnants, et la prévention de l&#39;insuffisance cardiaque soudaine et la mort du embryon avant la perfusion de plein-corps. Avec l&#39;utilisation d&#39;un TL marqué au FITC, ne importe quel système vasculaire perfusé maintiendra le marqueur le long de sa membrane apicale endothéliale. En combinaison avec l&#39;immunohistochimie, en utilisant Pecam (CD31, plaquettes endothéliale molécule d&#39;adhésion cellulaire) et divers autres marqueurs vasculaires, nous sommes en mesure de distinguer clairement entre les navires perfusés et ONU-perfusé, ainsi que de caractériser toute coloration anormale de tissus environnants.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

La formation et la perfusion de développer des vaisseaux sanguins rénaux (en dehors de glomérules) sont grandement sous-étudiées. Comme vasculaire développe via l&#39;angiogenèse (qui est l&#39;embranchement des gros vaisseaux) et la vasculogenèse (formation de novo de la cuve), des techniques de cartographie de perfusion telles que des moulages en résine, l&#39;imagerie in vivo de l&#39;échographie, et les micro-dissection ont été limitées à démontrer les relations intimes entre ces deux processus et les structures rénales en développement au sein de l&#39;embryon. Ici, nous décrivons la procédure in utero intra-cardiaques marqués au FITC tomates microinjections de lectine ultrasons guidées sur des embryons de souris pour mesurer l&#39;ontogenèse de la perfusion rénale. Tomate lectine (TL) a été perfusé dans tout l&#39;embryon et les reins récoltés. Les tissus ont été co-colorées pour diverses structures rénaux y compris: progéniteurs néphron, les structures de néphrons, urétéral épithélium, et la vascularisation. À partir de E13.5 grands navires de gros calibre ont été perfusé, cependant périphériqueles navires sont restés unperfused. Par E15.5 et E17.5, petits vaisseaux périphériques ainsi que glomérules a commencé à devenir perfusé. Cette technique expérimentale est essentielle pour l&#39;étude du rôle du système vasculaire et la circulation sanguine au cours du développement embryonnaire.

Formation vasculaire précède flux dans le développement de reins Une majorité de tissu embryonnaire (y compris le rein) contient une vascularisation dense (deux unperfused et perfusé), même au début des points de temps embryonnaires. Pour mieux mesurer et analyser le flux sanguin dans le rein en développement, nous avons utilisé une méthode in utero embryonnaires micro-injections intracardiaques. Avec l&#39;utilisation d&#39;une haute résolution ultrasons pour identifier le coeur ...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Dans injections intra-cardiaque Utero tomate-lectine sur les embryons de souris pour évaluer le flux sanguin rénal

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K vues.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Recherche

Biologie du développement

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Déficitaires et approche Gain de fonction d&#39;enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Structure-fonction des études chez la souris à l&#39;aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d&#39;échange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Utilisation de la cytométrie du débit pour détecter et quantifier la formation de sang altérée chez le poisson zèbre en développement

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.