This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Des échantillons de sang de-identifiés de personnes en bonne santé ont été de l&#39;Université de Colorado Hospital (Aurora, Colorado). L&#39;utilisation d&#39;échantillons sanguins bancaires dépersonnalisées pour les études de validation ainsi que pour la préparation des étalons et d&#39;échantillons de contrôle de qualité a été considéré comme «exonéré» par le Conseil Colorado multi-institutionnel de révision (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Préparation de références et Solutions <ol><li> Achat tacrolimus et l&#39;étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus auprès des vendeurs figurant dans la liste des matériaux. <ol><li> Préparation des solutions mères dans du methanol pur à une concentration de 1 mg / ml pour le tacrolimus et une concentration de 10 ug / ml pour 13 D 2, C-tacrolimus. Assurez solutions de stockage de matériaux de référence basé sur trois pondérations indépendants. Aliquote solutions mères et conserver à -70 ° C ou moins. </li></ol></li><li> Préparer la solution pour précipiter les protéineset extraire le tacrolimus en utilisant du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 dans l&#39;eau (7: 3, v: v). Cette solution contient également de l&#39;étalon interne D 2, C-13 tacrolimus à une concentration de 2,5 ng / ml et est utilisé pour l&#39;extraction de tous les échantillons à l&#39;exception de l&#39;extraction des échantillons à blanc (s&#39;il vous plaît voir 1.3.3). <ol><li> Préparer cette solution de protéines de précipitation fraîchement chaque jour d&#39;extraction et définir l&#39;expiration de la solution à 12 h. </li></ol></li><li> Préparation de la courbe d&#39;étalonnage et de contrôle de qualité (QC) échantillons <ol><li> Préparer des solutions mères de tacrolimus en effectuant des dilutions appropriées de la solution mère en utilisant du méthanol pur. </li><li> Pour préparer les étalons et les échantillons de contrôle de la qualité, spike 20 pi de solution stock diluée de manière appropriée dans le sang total EDTA, incuber à 37 ° C sous agitation dans un bain d&#39;eau douce pour permettre une distribution homogène de tacrolimus dans les composants cellulaires du sang pour 20 min et aliquote dans 1,5 ml polyperopylene tubes à fond conique et enfichable sur les couvercles. Assurez-vous que le volume relatif de solvant organique ne dépasse pas 5%. </li><li> Point 50 pi du sang total à pointes dans le milieu de chaque cercle sur les cartes de filtre à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Sécher les taches de sang sur les cartes de filtre à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Préparer des normes d&#39;étalonnage de tacrolimus dans le sang total humain de l&#39;EDTA à des concentrations de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, et 50 ng / ml. Préparer un échantillon à blanc pour l&#39;extraction comme les normes d&#39;étalonnage avec la solution de protéines de précipitation contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus («échantillon zéro&quot;). </li><li> Préparer les échantillons de CQ en tout EDTA sang humain à des concentrations de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Préparer un échantillon témoin. A la différence des échantillons QC qui sont extraits par précipitation contenant le standard interne D 2, C-13 tacrolimus, extraire cette solution échantillon à blanc avec la protéine de précipitations qui faitpas contenir de l&#39;étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus (&quot;échantillon blanc&quot;). </li></ol></li><li> Collection d&#39;échantillons cliniques <ol><li> Recueillir taches de sang séché comme décrit dans 43,44. </li></ol></li></ol> 2. Extraction de Tacrolimus sang séché des échantillons ponctuels <ol><li> Visuellement inspecter la tache de sang séché pour assurer une qualité acceptable et le volume 45 échantillon. </li><li> Frappe du centre tache de sang sur la carte du filtre avec une perforation de 6 mm. Remarque: La qualité des poinçons peut être contrôlée par pesée. Un disque de filtre saturé de poing pèse en moyenne 5,02 mg ± 0,09 mg (gamme: 4.83- 5.14 mg, n = 12). </li><li> La place des disques dans 1,5 ml tubes en polypropylène à fond conique et couvercles encliquetables. </li><li> Ajouter 20-30 balles à chaque tube. </li><li> Ajouter 500 ul de la solution de précipitation de protéines (methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, v: v à 2,5 ng / ml d&#39;étalon interne) dans chaque tube. Pour l&#39;extraction des échantillons blancs, utiliser la solution de précipitation des protéines sans l&#39;étalon interne. </li><li> Homogénéiser les disques dans le mélangeur de balle pendant 1 min (vitesse maximale, le réglage &quot;10&quot;). </li><li> Agiter les échantillons à température ambiante sur la multi-tubes vortex (vitesse maximale, le réglage &quot;10&quot;) pendant 10 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 16 000 x g et 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Transférer le surnageant dans des flacons de HPLC en verre équipé d&#39;un insert de 300 ul. Utilisez pré-fente joints en téflon. Remarque: Extrait échantillons peuvent être conservés à -20 ° C ou moins jusqu&#39;à l&#39;analyse LC-MS / MS. </li></ol> 3. LC-MS / MS Analysis <ol><li> Charge: 100 pi de surnageant de l&#39;extrait de l&#39;échantillon sur la colonne d&#39;extraction de la cartouche d&#39;C8 et laver avec un 7: 3 de l&#39;acide formique à 0,1% dans l&#39;eau: acétonitrile à un débit de 5 ml / min pendant 1 min. Les connexions de la soupape de commutation sont représentés sur la figure 2 et le gradient gérées par la pompe d&#39;extraction dans le tableau 1 </stRong&gt;. </li><li> Ci-après, activer la soupape de commutation résultant à l&#39;arrière-ras des analytes de la pré-colonne sur la colonne analytique. </li><li> Réglez la colonne thermostat à 65 ° C. </li><li> Éluer les analytes de la colonne analytique à l&#39;aide des débits et gradient indiquées dans le tableau 1. </li><li> Branchez la colonne analytique à un spectromètre de masse en tandem via la source d&#39;ionisation électrospray turbo. Régler les paramètres clés du spectromètre de masse selon le tableau 2. </li><li> Détecter les ions positifs ([M + Na] +) de dans le mode de réaction multiple (MRM). Utilisez les transitions d&#39;ions suivants pour la quantification: tacrolimus: m / z (masse / charge) = 826,6 → 616,2 et D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Remarque: La durée totale est de 4,6 min. </li></ol> 4. Quantification <ol><li> Pour chaque terme, générer une courbe d&#39;étalonnage sur la base des calibrateurs préparés et 1.3.5inclure dans chaque série d&#39;analyses. <ol><li> Générer une courbe d&#39;étalonnage en portant les concentrations nominales par rapport facteur d&#39;analyte de réponse (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) en utilisant le logiciel du spectromètre de masse. </li><li> Monter les calibrateurs en utilisant un ajustement quadratique en combinaison avec 1 / X pondération. </li></ol></li><li> Pour la quantité de tacrolimus dans les taches de sang séché intégrer le tacrolimus et de l&#39;étalon interne dans les chromatogrammes MRM extraites. Calculer le facteur de réponse pour le tacrolimus (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) et comparer avec la courbe d&#39;étalonnage en utilisant le logiciel de spectrométrie de masse. </li></ol> 5. Les procédures de validation <ol><li> Limite inférieure de détection (LLOD) et la limite inférieure de quantification (LIQ). <ol><li> Considérons la plus faible concentration de tacrolimus avec un rapport de crête à bruit de 4: 1 comme limite inférieure de détection (LLOD). Définir la limite inférieure de quantification (LIQ) en tant quela plus faible concentration de la courbe d&#39;étalonnage avec une précision égale ou supérieure à ± 20% d&#39;écart de la concentration nominale et une précision égale ou supérieure à 20% (coefficient de variation). </li></ol></li><li> Intra- et précision inter-jour et précisions. <ol><li> Testez l&#39;exactitude et la précision à quatre niveaux de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) et 40 ng / ml (QC4) concentration. </li><li> Préparer les échantillons QC de chaque jour de la validation dans le sang total EDTA humain, sèche sur les cartes de filtre, extraire et analyser comme décrit ci-dessus. </li><li> Déterminer la précision intra-jour et la précision avec 6 échantillons par niveau de concentration de QC. </li><li> Évaluer la précision inter-journée et une précision de plus de 20 jours. Mesurer chaque niveau QC avec 4 échantillons par jour. </li><li> Analyser les deux courbes d&#39;étalonnage avec des échantillons QC de chaque jour. </li><li> Calculer la précision intra-jour que le% de la concentration nominale (six échantillons par niveau de concentration, s&#39;il vous plaît voir 5.2.2). Calculer précision que le coefficient de variance (CV%). </li><li> Envisager la précision intra-day acceptable si elle tombe dans l&#39;acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérez précision intra-day acceptable si elle est égale ou supérieure à un CV (coefficient de variation) de 15%. </li><li> Calculer la précision inter-jour et de précision que la moyenne pour chaque niveau de concentration QC analysé au cours des 20 jours de validation. </li><li> Envisager la précision moyenne inter-jour acceptable si elle tombe dans l&#39;acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérons précision inter-jour acceptable si elle est égale ou supérieure à une CV (coefficient de variation) de 15%. </li></ol></li><li> Exclusion des interférences de la matrice. <ol><li> Pour l&#39;exclusion des interférences qui peuvent être causés par des signaux de la matrice, d&#39;analyser taches blanches séchées de sang (8 individus différents, de préférence 4 hommes et 4 femmes). </li><li> Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si pics dans le temps de rétentionfenêtre de tacrolimus sont détectés, d&#39;intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ. </li></ol></li><li> Ion suppression / amélioration d&#39;ions. <ol><li> Utiliser un protocole de perfusion post-colonne telle que décrite 45 pour évaluer l&#39;interférence potentielle de renforcement ion suppression / d&#39;ions provoquée par des composants de matrice de co-élution. </li><li> Infuser le tacrolimus à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l&#39;acide formique à 0,1%: methanol (30:70, v / v) post-colonne à un débit de 10 ul / min. <ol><li> Raccorder une pompe à seringue par l&#39;intermédiaire de la pièce en T entre la colonne analytique et de la source d&#39;électronébulisation le spectromètre de masse. </li><li> Surveiller l&#39;intensité du signal MS / MS des transitions MRM tacrolimus et son étalon interne (m / z = 826,6 → 616,2 et m / z = 829,6 → 619,2) après injection de extracTED échantillons blancs (n = 8 échantillons provenant d&#39;individus différents). Remarque: En l&#39;absence d&#39;amélioration ions suppression / ion du signal continu causé par perfusion des analytes ne devrait pas être affectée par l&#39;injection de la matrice de blanc, tandis que la suppression d&#39;ions provoque un plongeon du signal et de l&#39;ion amélioration un pic. </li></ol></li></ol></li><li> Reporter. <ol><li> Évaluer le potentiel de report en analysant extrait des échantillons blancs après les plus hauts calibrateurs (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si des pics dans la fenêtre de temps de rétention de tacrolimus sont détectés, d&#39;intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ. </li></ol></li><li> Recouvrements d&#39;extraction. <ol><li> Déterminer les recouvrements en comparant les signaux des analytes après extraction de QC samples à tous les quatre niveaux de concentration (n = 6) par concentration avec ceux des vierges taches de sang séché dopés avec des quantités correspondantes de tacrolimus après l&#39;extraction. </li><li> Préparer quatre ensembles de cercles de qualité (taux de concentration: 2, 4, 20, 40 ng / ml). </li><li> Préparer 4 autres ensembles de «échantillons de test de récupération&quot; correspondant en repérant 50 pi de sang total EDTA vierge sur les cartes de papier filtre et le séchage pendant 2 heures. </li><li> Ci-après, à la fois pour le QC et «échantillons de test de récupération&quot; vierges, découper la tache de sang entier sur la carte du filtre avec des ciseaux et placez les disques résultant dans un tube en polypropylène à fond conique et le couvercle snap-on. </li><li> Extraire tous les échantillons. </li><li> Transférer les surnageants (400 pi) dans des flacons de HPLC de verre. </li><li> Ajouter la solution tacrolimus boursier pour les «échantillons de test de récupération extrait&quot; vierges pour atteindre des concentrations de 2, 4, 20 et 40 ng / ml (4 pi de 200, 400, 2000, 4000 ng ml tacrolimus Stock sol /utions à 400 ul de surnageant). </li><li> Après analyse LC-MS / MS, comparer les signaux dans les deux échantillons QC et échantillons d&#39;essai &quot;de récupération&quot; de la concentration correspondante (récupération =% des échantillons de signaux avant que les échantillons dopés extraction / signaux dopés après extraction x 100). </li></ol></li><li> L&#39;intégrité de dilution. <ol><li> Établir l&#39;intégrité de la dilution en utilisant des échantillons enrichis avec des analytes à 500, 250 et 100 ng / ml. </li><li> Après extraction, diluer les échantillons en utilisant une solution de protéine de précipitation (1:10, n = 3 par niveau de concentration). </li><li> Calculer écarts par rapport aux concentrations nominales. Examiner les résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable. </li></ol></li><li> Stabilités. <ol><li> Enquêter stabilités en utilisant les échantillons QC à tous les quatre niveaux de concentration (n = 4 par concentration) ont analysé à différents points dans le temps et dans les différentes conditions d&#39;entreposage. </li><li> Comparer les résultats après stockage avec les valeurs nominales. Considérez résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable. </li><li> Établir la stabilité de l&#39;échantillon pendant 1 semaine à la température ambiante, 1 semaine à 4 ° C, 1 mois à -20 ° C et 1 mois à -80 ° C. </li><li> Test de stabilité gel-dégel sur trois cycles (-20 ° C). Essai échantillon extrait et la stabilité de l&#39;échantillonneur automatique en plaçant des échantillons dans l&#39;échantillonneur automatique thermostaté réglé à 4 ° C. Injecter échantillons après 72 h. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bien que, comme mentionné ci-dessus, la notion de médicament thérapeutique et le suivi de l&#39;observance du tacrolimus sur la base de taches de sang séché est attrayant, il ya des défis analytiques qui vont au-delà de ceux qui sont habituellement associés à l&#39;analyse LC-MS / MS du tacrolimus dans EDTA veineuse échantillons de sang total. Ceux-ci comprennent, mais sans y être limités, le fait que la matrice est du sang total capillaire trempé dans la matière des linters de coton de la matière de cart...

Le tacrolimus est un puissant immonosuppressant 1-7 qui a une structure de macrolide 8 (figure 1). En raison de cis - isomérie trans des liaisons CN il forme deux rotamères en solution 9 qui peuvent être séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) Tacrolimus est lipophile et soluble dans les alcools (methanol: 653 g / L, de l&#39;éthanol: 355 g / L), des hydrocarbures halogènes (chloroforme: 573 g / L) et de l&#39;éther. Il est peu soluble dans les hydrocarbures aliphatiques (hexane: 0,1 g / L et de l&#39;eau (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molécule ne contient pas de chromophore et son maximum d&#39;absorption UV est de 192 nm tacrolimus agit par l&#39;intermédiaire inhibition de la calcineurine. . Son mécanisme d&#39;action a été examiné dans les références 10,11. Il est actuellement utilisé dans plus de 80% des patients transplantés organes solides aux Etats-Unis 12. L&#39;indice thérapeutique du tacrolimus est considered soit 13 étroite. En outre, la corrélation entre les doses de tacrolimus et les concentrations sanguines est pauvre et la pharmacocinétique est variable 14,15. Suivi des concentrations thérapeutiques pour guider tacrolimus dosage chez les patients transplantés est donc pratique clinique générale 16-20. L&#39;objectif est de maintenir les concentrations sanguines de tacrolimus dans une plage thérapeutique pré-défini. Les concentrations sanguines de tacrolimus en dessous de la gamme thérapeutique peut entraîner une augmentation de l&#39;activité des réactions d&#39;allo-immunes chroniques ou aiguës, tandis que des concentrations supérieures à la fenêtre thérapeutique augmentent le risque de sur-immunosuppression, le cancer et la toxicité, tels que la néphrotoxicité, la neurotoxicité, l&#39;hypertension et le diabète. Haute pharmacocinétique variabilité intra-individuelle de tacrolimus peut être préjudiciable à la fois organe de greffe et de la survie des patients 21,22. Bien variabilité inter-individuelle de la pharmacocinétique du tacrolimus est principalement causée par des polymorphismes de CYP3A5, pour des raisons intra-individuellela variabilité comprennent, mais ne sont pas limités à des interactions médicament-médicament, la maladie-médicaments et de la nourriture-médicaments 14,15. Aussi le manque d&#39;adhésion à la thérapeutique régime de médicament immunosuppresseur est un facteur et une raison majeure de perte du greffon 23,24. Ces considérations suggèrent que la maison fréquente médicament thérapeutique et le suivi de l&#39;observance des concentrations de tacrolimus sur sang total peut être bénéfique pour assurer que les patients ont une exposition de tacrolimus dans la fenêtre thérapeutique souhaité en tout temps. Cependant, la logistique et le coût de la surveillance plus fréquente de drogue thérapeutique comme il est de pratique clinique actuelle 15 est prohibitif. Une des raisons est que le patient doit voir un préleveur d&#39;avoir l&#39;échantillon de sang veineux nécessaire dessinée. Taches de sang séché ont récemment émergé comme un concept attrayant 25-28. Après un doigt simple coller le patient recueille une goutte de sang sur une carte de papier filtre spécial et la tache de sang a DRied, il peut être envoyé à un laboratoire central pour l&#39;analyse de tacrolimus et de tout autre immunosuppresseur que le patient peut actuellement être pris. Ceci est devenu possible grâce à la mise au point de dosages LC-MS / MS hautement sensibles et spécifiques pour la quantification de tacrolimus et d&#39;autres immunosuppresseurs dans de très petits volumes de sang tels que des taches de sang séché (typiquement 20 ul de sang) 25,29-43. Un autre avantage est que, les stratégies de collecte minimalement invasives faibles volumes d&#39;échantillon tels que des taches de sang séché facilitent grandement suivi thérapeutique et des études pharmacocinétiques chez les petits enfants 28. Tacrolimus est généralement mesurée en toute EDTA sang veineux 15. Les raisons sont que le tacrolimus distribue principalement dans les cellules de sang et que des études cliniques ont signalé des meilleure corrélation entre les concentrations résiduelles de tacrolimus dans le sang que dans le plasma à des événements cliniques 15,18. En comparaison, l&#39;analyse de tacrolimus en taches de sang séché est basée sur sang capillaire qui est mélangée avec la matrice de papier-filtre. Cela pose des défis en termes de solubilisation de tacrolimus et les interférences potentielles avec l&#39;analyse LC-MS / MS. Ici, nous présentons un test établi et validé sur la base de l&#39;homogénéisation de la tache de sang séché en utilisant un mélangeur de balle en combinaison avec un débit élevé échantillon de colonne ligne nettoyer procédure et l&#39;analyse LC-MS / MS. En date d&#39;aujourd&#39;hui, ce test a été utilisé avec succès pour la quantification de plus de cinq mille tacrolimus séchée échantillons de taches de sang pour le suivi de l&#39;observance dans les essais cliniques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

Le tacrolimus inhibiteur de la calcineurine est la pierre angulaire de la plupart des protocoles de traitement immunosuppresseur après une transplantation d&#39;organe solide aux États-Unis. Tacrolimus est un médicament étroite indice thérapeutique et en tant que telle exige suivi thérapeutique et ajustement de la dose en fonction de l&#39;ensemble de son concentrations résiduelles dans le sang. Pour faciliter la maison médicament thérapeutique et le suivi de l&#39;adhésion, la collecte des taches de sang séché est un concept attrayant. Après un bâton de doigt, le patient perçoit une goutte de sang sur un papier filtre à la maison. Après que le sang est séché, il est envoyé au laboratoire d&#39;analyse où le tacrolimus est quantifiée par liquide à haute performance chromatographie-spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS / MS) en combinaison avec une étape protéines de précipitation manuel simple et l&#39;extraction de la colonne en ligne. Pour l&#39;analyse de tacrolimus, un disque de 6 mm est poinçonnée du centre saturée de la tache de sang. La tache de sang est homogénéisé à l&#39;aide d&#39;une balle d&#39;un mélangeure puis protéines sont précipitées avec du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus. Après agitation au vortex et centrifugation, 100 ul de surnageant sont injectés dans une colonne d&#39;extraction en ligne et on les lave avec 5 ml / min de 0,1 acide formique / acétonitrile (7: 3, v: v) pendant 1 min. Ci-après, la soupape de commutation est activé et les analytes sont contre-rinçage sur la colonne analytique (et séparé en utilisant un gradient d&#39;acide formique / acétonitrile 0,1%). Le tacrolimus est quantifiée en mode positif de réaction multiples (MRM) en utilisant un spectromètre de masse en tandem. Le dosage est linéaire de 1 à 50 ng / ml. La variabilité inter-essai (3,6% -6,1%) et la précision (91,7% -101,6%) selon l&#39;évaluation de plus de 20 jours répondent aux critères d&#39;acceptation. Récupération d&#39;extraction moyenne est de 95,5%. Il n&#39;y a pas de report, les interférences de matrice et les effets de matrice pertinente. Tacrolimus est stable dans des taches de sang séchées à température ambiante et à 4 ° C pendant 1 semaine. Les échantillons extraits dans leéchantillonneur automatique sont stables à 4 ° C pendant au moins 72 heures.

Chromatogrammes d&#39;ions représentatifs d&#39;un échantillon témoin, un échantillon enrichi à la limite inférieure de quantification et un échantillon de patient sont présentés dans la figure 3. Courbes d&#39;étalonnage La limite inférieure de détection était de 0,5 ng / ml et la limite inférieure de quantification était de 1,0 ng / ml. Cinquante ng / ml a été choisi comme étalon le plus élevé que des concentrations plus él...

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K vues.  University of Colorado, Anschutz Medical Campus. Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

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A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Un modèle de contusion unilatérale des blessures moelle épinière cervicale aide de l&#39;impacteur Infinite Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Recherche

Médecine

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formation de l&#39;épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Séché Blood Spot Collection de biomarqueurs de santé pour maximiser la participation à des études de la population

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Absolute Quantification of A&amp;#946;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt; in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

La quantification absolue de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; Dans le LCR aide d&#39;une référence Procédure de mesure de spectrométrie de masse

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but regardless of the approach, an in vivo model is needed to test each treatment. The pig is one of the most used large animal models for cardiovascular disease. Its heart is very similar in anatomy and function to that of a human. The ameroid placement technique creates an ischemic area of the heart, which has many useful applications in studying myocardial infarction. This model has been used for surgical research, pharmaceutical studies, imaging techniques, and cell therapies.
There are several ways of inducing an ischemic area in the heart. Each has its advantages and disadvantages, but the placement of an ameroid constrictor remains the most widely used technique. The main advantages to using the ameroid are its prevalence in existing research, its availability in various sizes to accommodate the anatomy and size of the vessel to be constricted, the surgery is a relatively simple procedure, and the post-operative monitoring is minimal, since there are no external devices to maintain. This paper provides a detailed overview of the proper technique for the placement of the ameroid constrictor.

The purpose of this protocol is to demonstrate the placement of a delayed constricting device (an ameroid constrictor) around a coronary artery in a swine model. This device creates an ischemic area of the heart that is useful for studying new diagnostic imaging techniques and new methods of treatment.

Un modèle d’ischémie cardiaque chronique chez les porcs à l’aide d’un Constrictor Améroïde

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained using laser Doppler flowmetry (LDF). This paper demonstrates a closed skull preparation that allows cerebral blood flow to be assessed without penetrating the skull or installing a chamber or cerebral window. To evaluate autoregulatory mechanisms, a model of controlled blood pressure reduction via graded hemorrhage can be utilized while simultaneously employing LDF. This enables the real time tracking of the relative changes in the blood flow in response to reductions in arterial blood pressure produced by the withdrawal of circulating blood volume. This paradigm is a valuable approach to study cerebral blood flow autoregulation during reductions in arterial blood pressure and, with minor modifications in the protocol, is also valuable as an experimental model of hemorrhagic shock. In addition to evaluating autoregulatory responses, LDF can be used to monitor the cortical blood flow when investigating metabolic, myogenic, endothelial, humoral, or neural mechanisms that regulate cerebral blood flow and the impact of various experimental interventions and pathological conditions on cerebral blood flow.

This article demonstrates the use of laser Doppler flowmetry to evaluate the ability of the cerebral circulation to autoregulate its blood flow during reductions in arterial blood pressure.

Évaluation de l'autorégulation du flux sanguin cérébral dans le Rat à l'aide de laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Comité de LC-MS/MS validé pour quantifier 11 médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans de petits échantillons de cheveux

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation

Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the clinical assessment of cardiovascular morphology and heart function. It is also the recognized standard-of-care for blood flow quantification based on phase contrast MRI. While such measurement of blood flow has been possible in adults for decades, methods to extend this capability to fetal blood flow have only recently been developed.
Fetal blood flow quantification in major vessels is important for monitoring fetal pathologies such as congenital heart disease (CHD) and fetal growth restriction (FGR). CHD causes alterations in the cardiac structure and vasculature that change the course of blood in the fetus. In FGR, the path of blood flow is altered through the dilation of shunts such that the oxygenated blood supply to the brain is increased. Blood flow quantification enables assessment of the severity of the fetal pathology, which in turn allows for suitable&#160;in utero&#160;patient management and planning for postnatal care.
The primary challenges of applying phase contrast MRI to the human fetus include small blood vessel size, high fetal heart rate, potential MRI data corruption due to maternal respiration, unpredictable fetal movements, and lack of conventional cardiac gating methods to synchronize data acquisition. Here, we describe recent technical developments from our lab that have enabled the quantification of fetal blood flow using phase contrast MRI, including advances in accelerated imaging, motion compensation, and cardiac gating.

Here we present a protocol for measuring fetal blood flow rapidly with MRI and retrospectively performing motion correction and cardiac gating.