Nous remercions Paul O'Brien, Marizel Mina et Isabella Freedman pour l’expérimentation animale, Jacquie Gonzalez et Danielle Weiner de NIH/NIAID aide avec irradiation gamma de tissus de lapin avant laser microdissection de saisie et de Jansy Sarathy manuscrit idées et conseils. Ce travail a été financé par la Bill et Melinda Gates Foundation (OPP1174780) et l’instrumentation de NIH partagé accordent 1S10OD018072. Nous remercions Eliseo A. eugénine donnant accès au microscope Leica LMD 6500 et le partage des compétences et des conseils. L’achat et soutien continu, les 6500 LMD a été financé par subvention du National Institute of Mental Health, MH096625, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NS105584, IRSP (à E.A.E) et de contributions de GSK (à E.A.E).

Toutes les études animales ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health, avec l’approbation de l’animalier institutionnel et Comité d’urbanisme de NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animales Experiments and prélèvement tissulaire
Cette section du protocole décrit les procédures animales et prélèvement d’échantillons dans des conditions de biosécurité de niveau 3 (BSL3). Des protocoles détaillés de la Mycobacterium tuberculosis aérosol infection procédure and drug administration protocoles chez le lapin ont été décrits précédemment11,12.
<ol><li>Infecter les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (mâles et femelles à 4-5 mois) avec M. tuberculosis HN878 en utilisant un système aérosol nez seulement, comme décrit plus haut11.</li>
	<li>Administrer les médicaments choisis (Ethambutol dans l’exemple présenté ici) via la voie préférée et euthanasier les animaux à 2, 6 et 24 h après l’administration. Tout d’abord, anesthésier le lapin par une injection intramusculaire de la kétamine à 35 mg/kg et de Xylazine à 5 mg/kg. Attendre dix minutes et confirmer le bonne anesthetization en pinçant la queue et toucher doucement les yeux. S’il n’y a aucune réaction, euthanasier par administration intraveineuse de pentobarbital et de la phénytoïne (voir Table des matières) à 1 mL/4,5 kg dans 2 mL de solution saline stérile. NOTE : Ces points sont optimales pour couvrir le profil pharmacocinétique de l’éthambutol et peuvent nécessiter de réglage/optimisation pour l’étude d’autres drogues.</li>
	<li>À l’aide de pinces, ciseaux, et/ou scalpel, enlever les poumons de la cavité thoracique, résection des biopsies pulmonaires contenant des granulomes nécrotiques grands incorporés dans les tissus pulmonaires non impliqués (comme décrit plus haut3) environnants. Granulomes nécrotiques apparaissent beige en couleur et en général dépassent légèrement du poumon environnant de couleur rouge/rose. Pour faciliter la cryosectioning facile, veiller à ce que les biopsies ne sont pas plus grands que 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>À l’aide de pinces, placer la biopsie sur un plateau préalablement étiquetées cryomold avec la surface de coupe souhaitée en contact direct avec la base de la barre d’État. Après la congélation, cela vous donnera une surface plate d'où cryosections sera coupées.</li>
	<li>Geler la biopsie en vapeur d’azote liquide. Remplir un contenant de mousse de styrol jusqu'à une profondeur de 2 pouces à l’azote liquide et placer une grille de tube métallique. Le panier doit dépasser au-dessus de la surface de l’azote liquide fournissant une surface plane sur laquelle sont placés les plateaux de tissu. Replacez le couvercle sur le récipient de styromousse et laisser les tissus pendant 10minutes de geler complètement.</li>
	<li>Enlever les plateaux de tissu, rapidement envelopper dans le film d’aluminium et les placer dans individuellement étiquetés seal et des sacs en plastique refermables. Transférer au congélateur-80 ° C pour le stockage. Remarque : Les étapes 1.1 à 1.6 sont effectuées dans des conditions de BSL3 (y compris tous travaux animale et manipulation des tissus et des organes infectés). Gamma irradient les biopsies pulmonaires à 3 mégarads pour activer le traitement à l’extérieur du confinement BSL3. Microdissection de saisie de laser sur les tissus non stérilisées peut-être être effectuée au sein de la BLS3 établissement s’il est approuvé les protocoles de sécurité sont en place. Cependant, le reste du présent protocole décrit la transformation en aval dans un établissement de BSL-2.</li>
</ol>2. tissu de sectionnement
<ol><li>Définissez le cryostat à la température de coupe souhaitée. Transférer la biopsie pulmonaire irradié gamma de stockage de-80 ° C dans le cryostat et laisser pendant 30 minutes pour équilibrer la température des tissus. Remarque : -20 à-22 ° C est optimale pour les biopsies de lésions de TB.</li>
	<li>À l’aide de pinces à épiler, fixer la biopsie au mandrin cryostat à l’aide d’une petite quantité d’adhésif de température de coupe optimale (OCT) à adhérer à la base du tissu pour le mandrin. Orientez le tissu de sorte que la surface plane (qui était en contact avec la base de la cryomold) est la surface exposée pour la coupe. Assurer que l’OPO ne contamine pas la surface du tissu, car cela peut interférer avec l’analyse de spectrométrie de masse ultérieures.</li>
	<li>Coupez trois coupes de tissus à 25 µm d’épaisseur et l’installer au PET membrane diapositives. Doucement toucher la membrane à la section de tissu et le retirer. Si trop de pression est appliqué, la fine membrane peut se déchirer.<ol>
<li>Éviter la manipulation excessive des diapositives avant de monter, comme cela se traduira par la membrane de PET devenant chargé et mauvaise adhérence des coupes de tissus. Veiller à ce que la lame de la membrane est conservée à température ambiante pour permettre l’adhérence de dégel-montage et réussie du tissu à la membrane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez la lame du cryostat et laisser pour sécher à l’air pendant 3 minutes. Si LCM-LC/MS/MS ne sera pas effectuée immédiatement, scellez la lame dans un petit sac scellable hermétique et transfert vers stockage de-80 ° C jusqu'à leur utilisation pour la dissection.</li>
	<li>Couper une section adjacente au 10-12 µm et dégel-monter sur une lame de verre standard pour l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration et de référence. Des sections supplémentaires peuvent être coupées en ce moment pour les autres taches histochimie souhaitée (par exemple, Ziehl-Niellsen pour la visualisation de Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Retirer le sachet scellé contenant la diapositive de stockage de-80 ° C et laisser à température ambiante pendant 5 minutes. Remarque : Si la lame froide est immédiatement exposée à l’atmosphère de laboratoire, le tissu va se recouvrir de condensation, et l’intégrité spatiale de la drogue peut être compromise.</li>
	<li>Allumez le microscope et le laser (laser nécessite 5-10 minutes d’échauffement avant découpe peut commencer). Charger des tubes PCR plat-cap 0,20 mL dans le support.</li>
	<li>Retirez la glissière du sac et de prendre une image optique de la section de tissu sur la diapositive de PET à l’aide d’un scanner à plat.</li>
	<li>Placez la lame dans le porte-lame (intrados vers le bas) et assigner des tubes de collecte sélective à des régions spécifiques granulome d’intérêt en utilisant le logiciel de microscope. En général, ceux-ci seront « poumon non impliqué, » « Granulome cellulaire », et « caseum » (Centre nécrotique), mais ils peuvent varier selon la pathologie spécifique de la Granulome/biopsie.</li>
	<li>Mettre l’accent sur le tissu à l’aide de la 5 X objectif de microscope. Ce grossissement devrait fournir une bonne vue d’ensemble du tissu contenant les deux zones de granulome cellulaires et nécrotiques. Dans le logiciel, sélectionnez le tube désigné « caseum » pour le déplacer dans la position sous le tissu.</li>
	<li>Entrez les paramètres souhaités dissection. Paramètres par défaut pour une section de poumon épais 25 µm sont laser puissance 30, vitesse 15 et ouverture 35 (unités arbitraires). Toutefois, ces différera selon le microscope utilisé et le potentiel de baisse de puissance en raison de l’âge du laser.</li>
	<li>Sélectionnez l’outil « dessin » et, à l’aide d’une souris ou un écran tactile stylet, décrire la région souhaitée pour la dissection. La superficie de la région s’affichera dans le logiciel. Garder les régions sélectionnées sous 500 000 µm2 (0. 5 mm2) pour faciliter la dissection plus facile. Répéter la dissection jusqu'à 3 millions µm2 (2de 3 mm) ont été collectés au total dans le capuchon du tube.<ol>
<li>À l’occasion, la région disséquée peut restent accrochée à la membrane environnante (par exemple en raison de l’attraction statique) et ne pas tomber dans le plafond de la collection. Supprimer ces zones de la surface cumulée totale en sélectionnant et en supprimant manuellement dans le logiciel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez le bouchon pour « lésion cellulaire » et de recueillir 3 millions µm2 du tissu suivant le même processus, comme indiqué dans l’étape de 3,7.</li>
	<li>Sélectionnez le bouchon pour « poumon non impliqué » et de recueillir 3 millions µm2 du tissu suivant le même processus, comme indiqué dans l’étape de 3,7. Notez que les tissus pulmonaires non impliqués contient beaucoup des bronchioles et des espaces alvéolaires. Être très attentif à exclure ces provenant des régions de tissus définis pour la dissection.</li>
	<li>Retirez le porte-bouchon et soigneusement dégrafer, sceller et étiqueter chaque tube. Protéger les tissus disséqués de perturbations d’air (par exemple, à partir de perturbation flux aérien d’une ouverture de porte) environnantes. Analyser les tissus disséqués immédiatement, ou stocker à-80 ° C et décongeler avant le traitement et l’analyse LCMS.</li>
</ol>4. extraction et analyse par LCMS
<ol><li>Préparer la solution d’extraction de 1:1 dans l’acétonitrile/méthanol contenant l’étalon interne d-10 éthambutol. Lorsque vous sélectionnez une norme interne, utiliser une forme stable marquée de la drogue de l’analyte (tels que EMB marqués au deutérium utilisé dans cette démonstration) avec suffisant Maj masse afin d’éviter des isotopes cross talk entre le médicament de l’analyte et la norme (généralement un minimum de 4 daltons) . Remarque : La création de normes dans l’homogénat de chaque type de tissu respectif est difficile parce qu’il y a un contrôle très limité des tissus permettant de créer des normes de l’homogénat. Comme alternative à rendre les normes auprès d’un échantillon d’homogénat enrichis, une norme peut être créée en ajoutant le tissu blanc et composé d’essai ensemble et extraction. Un volume de tissu témoin dans un homogénat qui correspond au volume cible de l’étude des sections de tissu échantillon est associé directement à une quantité de la substance d’essai qui serait présent à une concentration donnée.</li>
	<li>Calculer le volume de tissu ciblé basé sur la surface et l’épaisseur de la section de tissus et de déterminer le facteur de dilution nécessaire pour l’homogénat en utilisant le volume d’homogénat qui sera ajouté à la norme et les échantillons de CQ. Les calculs sont illustrées ci-dessous pour une zone cible disséqué de µm 3 millions2 (3 mm2) avec un 25 µm d’épaisseur et volume 2 µL d’homogénat. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>En supposant une densité de tissu de 1 g/mL, préparer le stock de l’homogénat pesant 50 mg de tissu témoin et ajout de tampon PBS pour diluer (en utilisant le facteur de dilution de le 26,67 homogénat calculé à l’étape 4.2, le diluant est 1,283 mL). Homogénéiser au talon battant des tissus pulmonaires et tampon PBS pendant 5 minutes à 1750 tr/min sur un homogénéisateur de perle. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Diluer la concentration en acétonitrile/eau de 1:1 pour créer la courbe d’étalonnage de fortification des solutions stocks du médicament de 1 mg/mL. Déterminer la concentration standard basée sur le volume de la pointe et le volume de tissu cible de fortification. L’exemple illustré est d’un standard à l’aide d’un volume de pointe 10 µL 100 ng/mL. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Retirer les tubes contenant des tissus microdisséqués de stockage de-80 ° C et laisser à température ambiante pendant 5 minutes.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de solution d’acétonitrile/eau de 1:1 et 2 µL de tampon PBS aux tubes contenant du tissu microdissected.</li>
	<li>Pour la courbe d’étalonnage et les tubes de contrôle de la qualité, ajouter 10 µL de solution de 2 µL de l’homogénat de poumon de contrôle de dopage.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de solution d’extraction dans chaque tube.</li>
	<li>Vortex chaque tube pendant 5 minutes, laisser agir pendant 5 minutes et centrifuger à 5000 tr/min pendant 5 minutes pour former une boulette de film et de tissus dans chaque tube.</li>
	<li>Transférer 50 µL de liquide surnageant d’une plaque 96 puits puits profonds et diluer avec un supplémentaire 50 µL d’eau déionisée dans chaque puits.</li>
	<li>Effectuer une analyse de LC/MS/MS à l’aide de paramètres optimisés pour l’éthambutol et éthambutol-d10 étalon interne (comme décrit dans le détail12).</li>
	<li>Utiliser un facteur de dilution pour corriger le montant exact du tissu découpé pour chaque échantillon. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. Validation de la méthode
<ol><li>Créer un homogénat de tissu pulmonaire de contrôle en combinant 1 partie du poumon, 2 pièces PBS et 3-4 billes en acier. Battre les tissus pulmonaires et tampon PBS pendant 5 minutes à 1750 tr/min en utilisant un homogénéisateur de perle.</li>
	<li>Doper l’homogénat en ajoutant 10 µL de 1 mg/mL stock DMSO Ethambutol dans 990 µL homogénat de créer une concentration finale de 10 000 ng/mL (10 mg/mL) et vortex pendant 1 minute.</li>
	<li>Créez un bloc congelé homogénat en versant l’homogénat dans un cryomold et congélation rapide sur la glace sèche pendant 5 minutes.</li>
	<li>Préparer 25 µm des coupes d’épaisseur du bloc de l’homogénat comme indiqué aux paragraphes 2.1 à 2.5.</li>
	<li>Disséquer la zone cible de tissu tel que spécifié dans les étapes 3.2-3.10.</li>
	<li>Ajouter 10 µL 1:1 dans l’acétonitrile/eau et 2 µL de tampon PBS aux tubes contenant du tissu microdissected.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de solution d’extraction dans chaque tube. Suivez les étapes 4,9-4.12 pour créer une courbe d’étalonnage et déterminer la concentration du médicament dans le bloc de l’homogénat tissulaire.</li>
	<li>Calculer le rendement d’extraction à l’aide de la formule ci-dessous : <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Résolue spatialement quantification des médicaments au sein des lésions pulmonaires de TB est nécessaire pour déterminer si l’exposition au médicament atteint stérilisant les concentrations de populations bactériennes qui résident dans les compartiments de différentes lésions. La méthode de LCM-LC/MS décrite ici permet une quantification absolue de médicaments antituberculeux dans tous les compartiments de la lésion, y compris le caseum riche en bactéries, en utilisant uniquement des sections de tissu 1...

La capacité de résoudre dans l’espace et de quantifier les concentrations du médicament est une condition essentielle pour déterminer si des médicaments antituberculeux atteint sous-populations bactériennes au sein des lésions pulmonaires à des concentrations1de stérilisation. Une importance particulière consiste à déterminer la pénétration de drogue dans le noyau nécrotique de la lésion (appelée caseum), qui généralement contient le plus grand nombre de bacilles et qui peut être difficilement accessibles aux médicaments en raison de l’absence de vascularisation.
Les méthodes traditionnelles pour évaluer la pénétration de la lésion, qui impliquent l’homogénéisation des lésions pulmonaires excisées suivie d’extraction par solvant et l’analyse de spectrométrie de masse (LC/MS) de chromatographie en phase liquide, sont hautement sensible et sélectif pour les médicaments de intérêt. Cependant, ces méthodes offrent l’information spatiale pauvre, limitée à la taille du tissu original homogénéisé. Basé sur la spectrométrie de masse des approches d’imagerie, telles que matrix-assisted laser desorption ionisation (MALDI)2,3, désorption electrospray ionisation (DESI)4 ou extraction surface liquide-enhanced5, 6 offrent des capacités d’imagerie très résolue spatialement, mais quantification directe peut être extrêmement difficile, voire impossible en raison d’effets de suppression ion hétérogènes et différentes efficacité d’extraction de l’analyte de la cellule de divers types de tissu7ou. En outre, des approches d’imagerie tissulaire MS plus directes sont intrinsèquement moins sensibles que LC/MS en raison du manque de séparation chromatographique des espèces endogènes en compétition pour l’ionisation et l’efficacité d’extraction par solvant plus faible de la drogue du tissu.
Microdissection de saisie de laser (LCM) combinée à une analyse LC/MS a été systématiquement appliquée pour isoler et caractériser des regions tissulaires distinctes pour la protéomique étudie8,9 et récemment utilisée pour la quantification de la drogue en ayant reçu une dose 10de tissus d’origine animale. Nous présentons ici un protocole optimisé appliquant LCM couplée à une analyse de LC/MS (LCM-LC/MS) afin de quantifier les antituberculeux dans les compartiments distincts de granulome. Dans le processus de microdissection laser capture, un laser UV vise à travers l’objectif de microscope sur la section de tissu, ce qui coupe et d’isole la zone de tissu désiré en suivant un tracé défini par l’utilisateur. Pour l’assistance gravitationnelle LCM (la technique utilisée pour cette étude), la section de tissu est montée sur une lame de membrane mince polymère (PET ou stylo) et le tissu est capturé dans un bouchon de tube de collection situé en bas de la diapositive. Les médicaments sont extraits des tissus excisés et quantifiées à l’aide des procédures types de LC/MS. La quantité de tissu nécessaire à recueillir est finalement déterminée de la concentration attendue du médicament présent dans le tissu et la sensibilité de la méthode LC/MS. Aire de la surface est suffisante pour la plupart des analyses de drogues dosé à des niveaux thérapeutiques et analysées à l’aide d’un spectromètre de masse quadripolaire triple systématique, 3 millions µm2 (2de 3 mm) de tissu.
Ce protocole décrit la combinaison puissante de profilage spatiale et quantification complet offert par LCM-LC/MS, fournissant des concentrations du médicament absolue dans tous les compartiments des granulomes de TB. La technique peut également être appliquée à la détermination des concentrations du médicament dans de nombreux tissus malades différents fournissant des informations de découverte et le développement de médicaments vitaux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

La tuberculose est toujours des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Améliorations à des régimes médicamenteux existants et le développement de nouveaux traitements sont requis de toute urgence. La capacité des antituberculeux dosé d’atteindre et de stériliser des bactéries au sein des régions nécrotiques mal vascularisé (caseum) des granulomes pulmonaires est cruciale pour une intervention thérapeutique réussie. Régimes thérapeutiques efficaces doivent donc contenir médicaments ayant des propriétés de pénétration caseum favorable. Les méthodes actuelles de LC/MS pour quantifier les concentrations du médicament dans les tissus biologiques ont limité les capacités de résolution spatiale, rend difficile de déterminer avec précision les concentrations du médicament absolue dans les milieux de petits tissus tels que ceux trouvés dans les granulomes nécrotiques. Nous présentons ici un protocole associant microdissection de saisie de laser (LCM) des régions de tissus pathologiquement distinctes avec quantification de LC/MS. Cette technique fournit quantification absolue de la drogue au sein du Granulome caseum, entourant la lésion cellulaire et tissu pulmonaire non impliqués et, donc, avec précision détermine si des concentrations bactéricides sont réalisées. Outre la recherche de la tuberculose, la technique a de nombreuses applications potentielles pour résolue spatialement quantification des drogues dans les tissus malades.

Un aperçu de l’approche de LCM-LC/MS est illustré à la Figure 1. Après le tissu de la stérilisation par irradiation gamma, toutes les étapes subséquentes (à partir de tissus à partir de sectionnement) ont lieu en dehors des conditions BSL3. La figure 2 montre la lésion sections biopsie avant et après l’isolement des tissus par LCM. Zones nécrotiques et cellulaires des lésions de la TB peuvent être facilement ide...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Nous décrivons ici un protocole à l’aide de microdissection de saisie de laser couplée à l’analyse de LC/MS dans l’espace-quantifier des distributions de médicaments au sein des granulomes de tuberculose pulmonaire. L’approche a largement applicables à la quantification des concentrations du médicament dans les tissus à haute détails spatiaux.

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K vues.  Rutgers, The State University of New Jersey. Nous décrivons ici un protocole à l’aide de microdissection de saisie de laser couplée à l’analyse de LC/MS dans l’espace-quantifier des distributions de médicaments au sein des granulomes de tuberculose pulmonaire. L’approche a largement applicables à la quantification des concentrations du médicament dans les tissus à haute détails spatiaux.

Vidéo: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

Quantification magnétique Imagerie par Résonance de la perfusion pulmonaire en utilisant Calibré marquage de spins artériels

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

Recherche

Médecine

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Spectrométrie de masse MALDI Imaging des neuropeptides dans la maladie de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Laser-microdissection de la prostate humaine épithélium pour l&#39;analyse de l&#39;ARN

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

Métaux d&#39;imagerie dans le tissu cérébral par Laser Ablation - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Une méthode In Vivo pour l’évaluation de la barrière intestinale-sang et le métabolisme hépatique du microbiote produits

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.

Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is enhanced after processing with vinegar, CR processed with vinegar (CRV) is generally used clinically. However, the mechanism by which the analgesic effect is enhanced by vinegar processing is unclear. In this study, the ultra-high pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) technique was used to examine changes in the blood levels of the exogenous constituents and metabolites between CR-treated and CRV-treated rats with dysmenorrhea. The results revealed differing levels of 15 constituents and two metabolites in the blood of these rats. Among them, the levels of (-)-myrtenol and [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid in the CRV group were considerably higher than in the CR group. CRV reduced the level of 2-series prostanoids and 4-series leukotrienes with proinflammatory, platelet aggregation, and vasoconstriction activities and provided analgesic effects by modulating arachidonic acid and linoleic acid metabolism and the biosynthesis of unsaturated fatty acids. This study revealed that vinegar processing enhances the analgesic effect of CR and contributes to our understanding of the mechanism of action of CRV.

Here, a comparative analysis of raw and processed Cyperi rhizoma (CR) samples is presented using ultra-high performance liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) in rats with primary dysmenorrhea. The changes in blood levels of the metabolites and the sample constituents were examined between rats treated with CR and CR processed with vinegar (CRV).

Analyse d’échantillons bruts et traités de Cyperi rhizoma par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem chez des rats atteints de dysménorrhée primaire

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

Capture d’échantillons de tissus de fibrose sous-muqueuse buccale pour l’analyse spatio-omique

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Pleins feux sur l’auteur : Percer les mystères des tumeurs malignes potentielles buccales 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolement de cellules avec des informations morphologiques et spatiales à partir d’échantillons de fibrose sous-muqueuse buccale par microdissection par capture laser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...