Ce travail a été soutenu par l&#39;école doctorale «Inflammation et la régénération» du Centre de recherche en collaboration 841 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), par le Centre de recherche en collaboration 877 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , par la Fondation Werner Otto (Peter Bannas), par la Fondation Wilhelm Sander (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), et par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag et Friedrich Koch-Nolte). Nous remercions l&#39;Université Cancer Center Hamburg (UCCH) dans un établissement de Vivo optique Imaging Core et le personnel de l&#39;UKE de consultation et de leur service de haute qualité. L&#39;installation de base a été financé en partie par des subventions de Deutsche Krebshilfe (Aide allemande contre le cancer).

NOTE: Des expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices internationales sur l&#39;utilisation éthique des animaux et ont été approuvés par la commission de l&#39;University Medical Center, Hambourg bien-être animal local. 1. Préparation des cellules tumorales, les souris et les constructions d&#39;anticorps <ol><li> Préparation des cellules de lymphome et le sous-sol Aliquotage Matrix (Matrigel). <ol><li> Le jour avant l&#39;injection des cellules tumorales mis une boîte stérilisée de pointe (1000 conseils de pi) et la pipette appropriée -20 ° C congélateur. </li><li> Décongeler la bouteille avec la matrice du sous-sol sur la glace dans le réfrigérateur à 4 ° C O / N. </li><li> Le jour de l&#39;injection remplir un seau à glace et placer la matrice de sous-sol avec pipette, les pointes, et seringues de 1 ml avec 30 g d&#39;aiguilles sur la glace. </li><li> des cellules de lymphome de l&#39;aliquote en un volume de 100 ul de milieu RPMI à 1,5 ml des tubes de microcentrifugation et mélanger soigneusement avec 100 pl de la matrice de sous-sol. Aspirer dans une pré-refroidiseringues et mis sur la glace jusqu&#39;à l&#39;injection. REMARQUE: Utilisez la bonne technique stérile et de travailler sur la glace tout le temps pour éviter le colmatage de la matrice de sous-sol. </li></ol></li><li> Souris Préparation <ol><li> Utilisez 8-10 semaines vieille souris nude athymiques (NMRI- Foxn1 n u). </li><li> Pour réduire autofluorescence de l&#39;intestin garder souris sur un régime sans luzerne pour 1 semaine avant l&#39;imagerie in vivo. </li><li> Pour l&#39;injection des cellules de lymphome de souris pour effectuer anesthésier avec 2% d&#39;isoflurane dans une chambre d&#39;induction. Maintenir 1-2% d&#39;isoflurane pendant la durée de la procédure en utilisant un collecteur isofluorane. </li><li> Injecter des cellules de lymphome sous-cutanée dans les flancs de l&#39;épaule. A titre de comparaison intra-individuelle directe injecter des cellules positives à l&#39;antigène et de l&#39;antigène négatif sur le côté droit et gauche respectivement. <ol><li> Utilisez le pouce et l&#39;index pour pincer la peau de la souris et tirez loin du corps de la souris. Injecter lentement et uniformément dansla poche créée par les doigts, la création d&#39;un cluster unique des cellules sous la peau. La matrice de sous-sol aide à garder cellules injectées en place. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation des anticorps Les constructions <ol><li> Étiqueter les anticorps monoclonaux et nanocorps de domaine unique avec un kit de marquage de protéines disponibles dans le commerce pour le colorant fluorescent AlexaFluor-680 (AF680) (onde d&#39;excitation = 679 nm, longueur d&#39;onde d&#39;émission = 702 nm) selon les instructions du fabricant. Calculer le nombre de colorants par nanocorps et anticorps classique en utilisant des coefficients d&#39;extinction molaires de 15 720 mol -1 cm -1 et 203 000 mol -1 cm -1, respectivement. Évaluer la pureté des constructions d&#39;anticorps par SDS-PAGE taille fractionnement et bleu brillant Coomassie. </li><li> Assurer la spécificité des conjugués marqués en procédant à une série d&#39;expériences in vitro avant que les études d&#39;imagerie réels. Test de la spécificité d&#39;un étiquetétibody construit in vitro grâce à des études de blocage et non spécifique isotype contrôle 8,20. NOTE: Dans l&#39;étape 1.2.4 nombre de cellules pour cellules présentatrices d&#39;antigène négative et positives à l&#39;antigène (ou des différentes lignes de cellules) peut être adapté en fonction de différents taux de croissance. Pour ces expériences, les cellules positives 0,5x10 6 DC27.10 ARTC2 négatif et 1,5x10 6 DC27.10 ARTC2 ont été utilisés pour obtenir des tumeurs de taille similaire. Dans l&#39;étape 1.3.1 le processus de l&#39;étiquetage et l&#39;étiquetage efficacité des sondes anticorps avec des fluorophores peut différer par le kit de marquage utilisé. </li></ol></li></ol> 2. In Vivo Imaging <ol><li> Après 7-9 jours, lorsque les tumeurs atteignent environ 8 mm de diamètre, 50 ug d&#39;injecter AlexaFluor680 constructions d&#39;anticorps marqué dans un volume de 200 ul de solution saline par voie intraveineuse dans la veine caudale de la souris (mAb-AF680: 50 ug avec deux colorants / molécule ≈ ~ 4 ^ 14 fluorochromes ≈ ~ 0,8 ug fluorochromes; Nanobody-AF680: 50 μ0,3 g de colorants / molécule ~ 5,6 ≈ 14 ^ ~ fluorochromes ≈ 1,1 ug fluorochromes). </li><li> Initialiser le système d&#39;imagerie et anesthésier les souris pour effectuer avec 3% d&#39;isoflurane utilisant un système d&#39;anesthésie XGI-8 dans la chambre d&#39;induction avant l&#39;imagerie. Maintenir 1-2% d&#39;isoflurane pendant la durée de la procédure de formation d&#39;image à l&#39;aide du collecteur isoflurane logé dans la chambre d&#39;imagerie. <ol><li> souris de position sur la scène de l&#39;imagerie chauffée avec des tumeurs dirigés vers la caméra. Surveiller la bonne anesthésie en pinçant l&#39;orteil ou de la queue de l&#39;animal; aucune réaction de l&#39;animal indique que l&#39;anesthésie est trop léger. </li><li> Surveiller le taux de respiration; l&#39;anesthésie est trop léger si le taux de respiration est augmentée et trop profond si le taux de respiration est diminuée, profonde ou irrégulière. Protéger les cornées de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. </li></ol></li><li> Choisissez jeux de filtres fluorescents de 615 à 665 nm pour l&#39;excitation, de 695 à 770 nm pour EMISSIOn, et de 580 à 610 nm pour l&#39;excitation soustraction de fond 51 avec une taille de 2 x 512 matrice de pixels. Réglez le temps d&#39;exposition à l&#39;auto, pixel binning à moyen et F / STOP pour deux. REMARQUE: Réduction des temps d&#39;exposition permettent plus rapides des taux de trame; plus longues durées d&#39;exposition offrent une plus grande sensibilité. Regroupement contrôle la taille de pixel sur la caméra CCD. L&#39;augmentation de la catégorisation augmente la taille du pixel, la sensibilité, et la cadence, mais réduit la résolution spatiale. F / arrêt définit la taille de l&#39;ouverture de l&#39;objectif de la caméra. La taille de l&#39;ouverture contrôle la quantité de lumière détectée et la profondeur de field.Note que les paramètres peuvent différer par le dispositif et expérimentale mise en place d&#39;imagerie. Consultez le manuel du fabricant pour des résultats optimaux. <ol><li> Dans le logiciel d&#39;imagerie temps d&#39;exposition d&#39;optimiser, F / arrêt et pixel binning basés sur le niveau de la lignée cellulaire d&#39;expression. Modifier ces paramètres à tout moment au cours d&#39;une expérience sans impact sur le résultat quantitatif. Sinon, laissez le logiciel Assistant Imaging déterminer automatiquementles paramètres. </li></ol></li><li> souris de l&#39;image avant l&#39;injection et 6 heures après l&#39;injection de constructions d&#39;anticorps. NOTE: L&#39;efficacité de l&#39;étiquetage peut influer sur la dose nécessaire requis pour des résultats optimaux d&#39;imagerie. Par conséquent, la quantité d&#39;anticorps requise-assemblage pour un résultat optimal d&#39;imagerie doit être déterminée de manière empirique. Elle peut varier en fonction de l&#39;efficacité de marquage et la taille de la construction ainsi que le modèle de tumeur et l&#39;expression de l&#39;antigène cible. </li></ol> 3. La récolte et la préparation des tumeurs <ol><li> Remplir un seau à glace et placer 4% de paraformaldehyde (PFA) une solution saline tamponnée phosphate (PBS) / inhibiteur de protease (AEBSF) et du PBS / 0,2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) sur de la glace. </li><li> Une fois la session de formation d&#39;image est terminée, augmenter la concentration d&#39;isoflurane à 4%. Après animaux cesse la respiration, le retirer de la scène d&#39;imagerie et d&#39;effectuer dislocation cervicale. </li><li> Mont souris sur un bloc de polystyrène et de pulvérisation avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Utilisez ciseauxs et une pince pour couper la peau extérieure et le tirer en arrière soin d&#39;exposer les tumeurs. Enlever des tumeurs au bistouri pour assurer le tissu tumoral reste intacte. </li><li> Tumeurs couper en deux à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Placer une moitié dans un tube de prélèvement avec du PBS / AEBSF pour les analyses FACS, et l&#39;autre moitié dans un tube de 50 ml avec 4% de PFA pour l&#39;immunohistochimie. </li><li> Préparation pour l&#39;immunohistochimie <ol><li> Gardez tumeurs dans 4% PFA dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 24 heures. Transfert des tumeurs à un tube avec du PBS / 30% de saccharose et de garder au réfrigérateur à 4 ° C jusqu&#39;à ce que les puits de la tumeur au fond du tube. </li><li> Couper les tumeurs en morceaux appropriés pour les cryomoules. Mettez les tumeurs dans cryomoules et remplir avec le composé octobre afin que les tumeurs sont couverts. </li><li> Mettez les moules sur glace sèche et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que le composé est complètement gelé. Transfert tumeurs congelés à -80 ° C congélateur et stocker pour l&#39;immunohistochimie. </li><li> Cut gelé tumeurs dans les sections de 8 pm avec un microtome. Utilisez immunohistochimique normeprotocole de chimie pour colorer avec un anticorps contre CD31-AF488 de visualiser les vaisseaux sanguins et diamidino-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux. NOTE: Les sections de tumeurs sont très sensibles à la lumière, car ils contiennent déjà des anticorps marqués par fluorescence. Minimiser l&#39;exposition à la lumière, autant que possible. </li></ol></li><li> Préparation pour l&#39;analyse FACS <ol><li> Placez boîte de Pétri sur de la glace et enlever le piston d&#39;une seringue 2,0 ml. Mettez la tumeur dans le tamis cellulaire et coupez-le délicatement dans 3-4 morceaux à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Verser la première PBS dans la boîte de Pétri et utiliser le bout plat du piston pour écraser la tumeur dans le tamis cellulaire. </li><li> Rincer la crépine de la cellule avec l&#39;initiale PBS pour laver toutes les cellules avec une pipette de 10 ml. Transfert suspension de cellules dans un nouveau tube et de spin à 500 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS / BSA à 0,2%. Compter les cellules. </li><li> Aliquotes 1-5 x 10 6 cellules de lymphome dans un FACS tube 5 ml. cellules Spin nouveau (500XG), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul de PBS / BSA à 0,2%. </li><li> Eventuellement, le bloc FcR utilisant un anticorps anti-CD16 / CD32 mAb-(FcgR3 / 2) qui se lie à FcyR sur de la glace pendant 10 min. Laver les cellules une fois avec du PBS / 0,2% de BSA. </li><li> Ajouter anti-CD45-mAb de discriminer leucocytes d&#39;autres cellules. Incuber pendant 20 min sur de la glace dans l&#39;obscurité, suivie par deux lavages avec du PBS / 0,2% de BSA. </li><li> Juste avant l&#39;analyse FACS tache avec l&#39;iodure de propidium pendant 15 min sur la glace de discerner les cellules mortes, suivi par deux lavages avec PBS plaine. Remettre en suspension dans 150 ul pour analyse FACS. NOTE: Dans l&#39;étape 3.7.4 et 3.7.5 étape autres anticorps peut être utilisé en fonction de l&#39;entité de la tumeur. </li></ol></li></ol> 4. Analyse FACS <ol><li> Utilisez une série d&#39;outils de déclenchement à la porte la population d&#39;intérêt sous forme de grande dispersion, la discrimination de doublet, l&#39;exclusion des cellules mortes, gating pour les cellules positives CD45 et gating pour les cellules positives à l&#39;antigène. <ol><li> Dans un premier temps, porte sur cellulaireles débris dans une diffusion vers l&#39;avant (FSC-A) par rapport à la diffusion latérale (SSC-A) en utilisant un terrain à deux paramètres. Doublets de cellules de rejet suivante. Enfin, sur la porte non CD45-positives à l&#39;antigène (CD45) et morts / cellules mourantes (LD - / morts-tache en direct). </li></ol></li><li> échantillons de disques utilisant le même modèle pour toutes les expériences. NOTE: Consultez le protocole du fabricant pour obtenir des conseils techniques sur l&#39;utilisation du matériel et des logiciels d&#39;analyse. </li></ol> 5. Analyse microscopique <ol><li> Analyser cryosections tumorales colorées en utilisant un microscope confocal avec une lentille à immersion d&#39;huile (objectif 40X). Utilisez un Il-Neon 633 nm excitation laser de AF680, un laser Argon pour AF488, et un 405-Diode pour DAPI. </li><li> Traiter les données d&#39;image RAW à l&#39;aide d&#39;un logiciel compatible avec le microscope. Effectuer fond de correction et de filtrage du bruit si nécessaire. Effectuez les réglages d&#39;image supplémentaires telles que la coupe, recadrage ainsi que les réglages de luminosité et de contraste. <ol><li> Enfin generate une image composite unique de superposition de tous les canaux de détection. Régler la luminosité et le contraste des couches individuelles. Les images composites montreront localisation de cellules (DAPI-tache, bleu), la distribution de constructions anticorps marqué (AF680-taches, rouge) et les vaisseaux sanguins (AF488-taches, vert). </li></ol></li></ol> 6. Analyse Vivo Imaging <ol><li> Ouvrir des fichiers image dans un logiciel d&#39;imagerie et de créer une image de superposition en combinant les données d&#39;image de photographie avec des données d&#39;image de fluorescence. Optimiser l&#39;affichage de l&#39;image en éliminant autofluorescence des tissus signal de fond du signal fluorescent spécifique. Cela peut être fait en soustrayant l&#39;image acquise avec un filtre de fond définir à partir de l&#39;image acquise avec le filtre spécifique pour mettre le traceur. </li><li> Dessinez régions de mesure circulaires identiques d&#39;intérêt (ROI) autour de la tumeur antigène-positive et la tumeur de l&#39;antigène négatif. Pour déterminer fond intensité du signal, placez un ROI circulairedans une zone de l&#39;animal où il est prévu signal de fluorescence est faible (par exemple, la jambe de derrière). <ol><li> Utilisez les mêmes ROI pour tous les animaux à tous les points de temps. Pour le positionnement, utilisez les images en noir et blanc photographiques pour identifier les marges tumorales. </li></ol></li><li> Affichage des données ROI dans une table de mesure. Utiliser les données d&#39;efficacité moyenne radiante, qui permet une comparaison plus quantitative des signaux fluorescents pour d&#39;autres analyses statistiques. <ol><li> Comparer les données d&#39;affichage et que les intensités de signaux absolus ou calculer le rapport signal sur bruit de fond en utilisant les données de mesure issues de ROI tissu cible et le tissu de fond. Calculer le rapport tumeur à fond en divisant la valeur d&#39;absorption de la tumeur par la valeur d&#39;arrière-plan déterminée à partir de la patte postérieure. </li><li> Comme témoins, analyser également des tumeurs antigène-négatives et positives à l&#39;antigène dans les mêmes animaux ainsi que des animaux injectés avec contrôles isotypiques marqués d&#39;évaluer la spécificité des signaux in vivo. </li></ol></li&gt; </ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies+as+novel+agents+for+disease+diagnosis+and+therapy.">Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy.</a> International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).</li><li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+trends+in+antibody-based+oncologic+imaging.">Recent trends in antibody-based oncologic imaging.</a> Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).</li><li>Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+targeting+to+tumors:+principles,+pitfalls+and+(pre-)+clinical+progress.">Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress.</a> Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).</li><li>Jain, R. K., Stylianopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivering+nanomedicine+to+solid+tumors.">Delivering nanomedicine to solid tumors.</a> Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).</li><li>Lisy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice.">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li><li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography.">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li></ol>

Friedrich Koch-Nolte and Friedrich Haag receive a share of antibody and protein sales via MediGate GmbH, a wholly owned subsidiary of the University Medical Center Hamburg-Eppendorf.

Nous avons utilisé le proche infrarouge fluorophores nanocorps marqués et d&#39;anticorps monoclonaux conventionnels dirigés contre la même cible sur les cellules de lymphome pour une comparaison multimodale in vivo et ex vivo analyses. Nous avons montré que nanocorps sont bien adaptés comme outils de diagnostic pour la détection rapide et spécifique in vivo des lymphomes. In vivo, s + 16a 680 permis une détection rapide et plus spécifique de xénogreffes de ARTC2 positif. Outre les différentes cinétiques pour un affichage optimal de la tumeur in vivo, l&#39;inconvénient majeur de Nika102 680 était le signal non spécifique élevée de tumeurs et de signaux de fond non spécifiques ARTC2 négatif. Analyse ex vivo cytométrie de flux de cellules dispersées provenant de tumeurs disséquées ont montré aucune liaison non spécifique à des cellules de lymphome ARTC2 négatif de AF680-conjugués injectés. Ex vivo ont révélé une forte fluorescence et presque homogèneous coloration des cellules tumorales dans les sections ART2C-positive en cas de + 16a de la nanocorps, confirmant que le nanocorps était en mesure d&#39;atteindre les zones reculées, même au sein de la tumeur après 6 h. En revanche, l&#39;anticorps monoclonal a présenté une coloration plus faible et homogène de cellules dans les tumeurs ARTC2 positif après 6 heures. Résultats de l&#39;imagerie mieux avec les anticorps classique peuvent être atteints après 24 h ou 48 h (données non présentées). Pour effectuer une comparaison approfondie des deux constructions différentes tailles, imagerie à des moments différents (série-imagerie) doit être effectuée pour identifier le point de temps d&#39;imagerie optimale pour chaque construction. Comme d&#39;autres études antérieures, les résultats présentés ici soulignent que in vivo l&#39;imagerie moléculaire avec nanocorps marqués permet l&#39;imagerie de la tumeur même jour rapide et spécifique avec une grande tumeur à-fond ratios 12-15,17-19. Au contraire, les anticorps conventionnels aboutissent à de faibles ratios tumeur à-fond et les signaux non spécifiques de lutte contretumeurs gen-négatives début après l&#39;injection en raison de leur lente clairance du corps. Afin d&#39;obtenir des résultats d&#39;imagerie optimales avec des anticorps conventionnels, le temps d&#39;imagerie fait 24 heures ou même 48 heures après l&#39;injection sont généralement nécessaires. Ces résultats sont en accord avec les études antérieures qui ont suggéré que les anticorps classiques avec un bénéfice thérapeutique avéré ont une utilité limitée en imagerie moléculaire 17,19,26. Par conséquent anticorps conventionnels pourraient être plutôt adapté à des fins thérapeutiques en raison de leur longue demi-vie plasmatique tout nanocorps sont plutôt adaptés à des fins d&#39;imagerie en raison de leur élimination rapide de la circulation. Ces différences sont dues au fait que l&#39;excédent des petits nanocorps (15-17 kDa) est rapidement éliminé par l&#39;élimination rénale tout excès d&#39;anticorps conventionnels plus grands (150 kDa) est retenu dans la circulation. Donc, l&#39;avantage majeur de nanocorps pour l&#39;imagerie moléculaire est le signal de fond bas à des moments d&#39;imagerie début regardless de la dose injectée. Cela permet même imagerie par jour et pourrait être traduisible au réglage. Au contraire cliniques, les anticorps conventionnels doivent être exactement titré à minimiser les signaux de fond non spécifiques, tout en conservant suffisamment de signal spécifique du tissu ciblé (données non publiées). L&#39;une des limitations de la technique in vivo d&#39;imagerie NIRF est la faible profondeur de pénétration qui permet généralement de l&#39;imagerie sous-cutanée uniquement mais non de modèles de tumeur orthotopique. Toutefois, cette limitation pourrait être surmonté dans un cadre expérimental par les techniques de photo-acoustique tomographiques récemment développées qui permettent imagerie du corps entier de la vie des souris 27. Une autre limite de la technique d&#39;imagerie NIRF est l&#39;évaluation de la dose de tissu par rapport à l&#39;imagerie par radionucléide médiée. Cependant, les Nanobodies peuvent être radiomarqués pour la tomographie par émission de positons (TEP) de modèles de xénogreffes et évaluation quantitative exacte detraceur biodistribution. En effet, nos résultats NIRF-imagerie sont conformes à une récente étude qui a comparé nanocorps et des anticorps conventionnels pour l&#39;imagerie PET. Les auteurs sont également venus à la conclusion que nanocorps permettent imagerie même jour avec une grande tumeur à-fond rapports 15. Cependant, seul le marquage de produits d&#39;assemblage d&#39;anticorps avec le proche infrarouge de colorant fluorescent AF680 nous a permis la complète in vitro, in vivo et ex vivo comparaison proche infrarouge imagerie par fluorescence en utilisant la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, et NIRF-imagerie. Pour cette raison, et parce qu&#39;il est non radioactif, très sensible, peu coûteux, et utilise relativement facile à produire des sondes ciblées, nous préconisons l&#39;utilisation de la technique NIRF-imagerie pour l&#39;évaluation de nouvelles constructions d&#39;anticorps dans l&#39;imagerie moléculaire préclinique.

Dans le présent rapport, nous décrivons la mise en œuvre du proche infrarouge fluorophores sondes marquées pour la validation des expériences in vivo dans d&#39;imagerie de xénogreffe en utilisant ex vivo cytométrie en flux et microscopie de fluorescence des tumeurs de xénogreffe disséqués. Nous comparons une seule Nanobodies de domaine (s + 16a, 17 kDa) 1 et un anticorps monoclonal (Nika102, 150 kDa) 2,3 dirigés vers le même antigène cible pour spécifique in vivo dans le proche infrarouge imagerie de fluorescence dans un modèle de lymphome de xénogreffe. L&#39;antigène cible ADP-ribosyltransférase ARTC2.2 est exprimée en surface cellulaire ecto-enzyme GPI ancrée par des cellules de lymphome 4-9. Nanobodies dérivés de chaîne lourde de camélidé seule anticorps sont les plus petits disponibles fragments de liaison d&#39;antigène 10,11. Avec seulement ~ 15 kDa, ces petits fragments d&#39;anticorps sont solubles, très stable et sont effacés de la circulation rénale 8,10. Tes propriétés les rendent particulièrement appropriés pour le ciblage spécifique et efficace des antigènes tumoraux in vivo 12-20. Les cibles antigéniques communs de Nanobodies disponibles sont le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR1 ou HER-1), humaine croissance épidermique de type facteur 2 (HER-2 ou CD340), l&#39;antigène carcino-embryonnaire (CEA) et l&#39;adhésion cellulaire vasculaire molécule-1 (VCAM-1 ) 21. conjugués Nanobodies sont des outils prometteurs pour l&#39;immunothérapie du cancer et le traitement des maladies inflammatoires 22. Des études récentes ont montré que plus la tumeur nanocorps permettent à fond (T / B) -ratios que les anticorps classiques dans les applications d&#39;imagerie moléculaire in vivo 8,17,19. Ceci se explique principalement par la pénétration de tissu relativement pauvre et lente des anticorps conventionnels, lente clairance de la circulation, et de longue rétention dans les tissus non ciblés 23. En outre, l&#39;excès d&#39;anticorps conventionnels conduit à l&#39;accumulation non spécifique itumeurs antigène négative n cibles causées par la perméabilité et une meilleure rétention (EPR) Effet 24,25. Cela signifie que des doses plus élevées d&#39;anticorps classiques peuvent augmenter non seulement les signaux spécifiques, mais également des signaux non spécifiques, ce qui réduit le rapport maximal réalisable tumeur à fond. En revanche, l&#39;augmentation de la dose de Nanobodies augmente les signaux de tumeurs positives à l&#39;antigène mais non de tissu normal ou des tumeurs de l&#39;antigène négatif (données non publiées). Au-delà de la comparaison des Nanobodies et anticorps classiques, nous présentons une évaluation intra-individuelle de xénogreffes antigène-positives que négatives dans la même souris pour une comparaison directe de signaux spécifiques et non spécifiques en raison de l&#39;effet EPR. Les sondes conjugués fluorophores proche infrarouge nous a permis d&#39;exploiter une seule sonde in vivo et ex vivo utilisant l&#39;imagerie de fluorescence dans le proche infrarouge, cytométrie de flux, et la microscopie de fluorescence. L&#39;application de nos protocoles permet nonoptimisation radioactive, très sensible, et peu coûteuse des expériences in vivo moléculaires d&#39;imagerie telles que l&#39;évaluation de nouvelles constructions d&#39;anticorps spécifique de la tumeur pour le ciblage. L&#39;objectif de cette étude de tutoriel est de mettre en évidence l&#39;utilisation de NIRF-imagerie pour l&#39;évaluation de nouvelles constructions d&#39;anticorps dans l&#39;imagerie moléculaire préclinique. Dans ce protocole, toutes les expériences ont été réalisées avec un système NIRF-imagerie des petits animaux, un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS) cytomètre en flux, et un microscope confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">AF680 protein labelling kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:176px;">A20172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD16/CD32-antibody</td>
			<td style="width:147px;">BioXCell</td>
			<td style="width:176px;">BE0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Anti-CD31-antibody</td>
			<td style="width:147px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-1506</td>
			<td style="width:183px;">labeled with secondary antibody with AF488</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-CD45-antibody V450</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">AxioVision LE software</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:176px;">www.zeiss.com</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Basement membrane matrix</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">354234</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell strainer 70&#181;m</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:176px;">431751</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:176px;">www.leica-microsystems.com</td>
			<td style="width:183px;">Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Molcular Probes</td>
			<td style="width:176px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">DC27.10 cells&#160;</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;">n/a</td>
			<td style="width:183px;">Other cells with different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FACS Canto II</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">www.bdbiosciences.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Flourescence mircoscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:176px;">www.zeiss.com</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">NIH</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:176px;">www.perkinelmer.com</td>
			<td style="width:183px;">Alternative in vivo imaging system can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Leica LAS software</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:176px;">www.leica-microsystems.com</td>
			<td style="width:183px;">Software specific to microscope used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Living Image software</td>
			<td style="width:147px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:176px;">www.perkinelmer.com</td>
			<td style="width:183px;">Software specific to imaging system used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Needles 30 G</td>
			<td style="width:147px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:176px;">305128</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Nika102-antibody AF680</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:183px;">Other antibodies against different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:103px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">P6148</td>
			<td style="width:183px;">Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">s+16a-nanobody AF680</td>
			<td style="width:147px;">laboratory specific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:183px;">Other antibodies against different surface targets can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes 1ml</td>
			<td style="width:147px;">Braun</td>
			<td style="width:176px;">916 1406 V</td>
			<td style="width:183px;">Alternative product can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft nirf-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Des sondes marquées par fluorescence permettent la combinaison de différentes techniques d&#39;imagerie NIRF (figure 1A). Nous avons cherché à effectuer vivo NIRF-imagerie, la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence de manière séquentielle afin de comparer nanocorps marqués par fluorescence et des anticorps monoclonaux spécifiques pour l&#39;imagerie in vivo (figure 1B). Les souris ont été injectées avec 50 ug d&#39;anticorps monoclonal Nanobodies et d&#39;évaluer la spécificité des produits d&#39;assemblage marqués par fluorescence pour l&#39;imagerie in vivo. Les résultats ont montré un étiquetage spécifique des tumeurs positives à l&#39;antigène à la fois et nanocorps anticorps monoclonal à 6 heures après l&#39;injection (Figure 2). ROI analyse des tumeurs positives à l&#39;antigène a montré un rapport beaucoup plus élevé T / B d&#39;environ 12 pour le rapport de Nanobodies ~ 6 pour l&#39;anticorps monoclonal. En outre, le nanocorps montré aucun signal non spécifique dans les tumeurs de l&#39;antigène négatif, alors que leanticorps monoclonal a montré des signaux de confusion non spécifiques dans les tumeurs de l&#39;antigène négatif. Outre le signal non spécifique des tumeurs négatives, l&#39;anticorps monoclonal a également induit des signaux de fond non spécifique dans l&#39;animal entier. Cela est probablement dû à des anticorps circulants gratuitement excessives, qui sont trop gros pour être excrété par les reins. Au contraire, les animaux injectés avec nanobodies signaux non spécifiques ont montré que dans les reins en raison de l&#39;élimination rénale des petites Nanobodies. La cytométrie en flux analyses de suspensions de cellules tumorales ont montré un marquage spécifique des cellules tumorales positives à l&#39;antigène à la fois conjugués AF680 6 h après l&#39;injection. Le signal de fluorescence plus forte des cellules nanobody marqué par rapport aux cellules productrices d&#39;anticorps monoclonaux marqués reflète les résultats in vivo NIRF-imagerie. Fait important, les analyses de cytométrie en flux révèle qu&#39;il n&#39;y a pas marquage non spécifique des cellules présentatrices d&#39;antigène négatif avec l&#39;un des deuxassemblage (figure 3). La microscopie à fluorescence des coupes cryogéniques de tumeur a montré une forte étiquetage et presque homogène de cellules positives à l&#39;antigène avec la Nanobodies 6 h après l&#39;injection. Au contraire, l&#39;anticorps monoclonal a montré une coloration beaucoup plus faible et plutôt homogène (figure 4A). tumeurs antigène négatif montrent aucune coloration 6 heures après l&#39;injection de la nanocorps, alors que les tumeurs de l&#39;antigène négative injectés avec l&#39;anticorps non spécifique spectacle coloration classique dispersés dans l&#39;espace interstitiel (figure 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> Figure 1: imagerie Flourescence et constructions d&#39;anticorps. (A) l&#39;installation d&#39;imagerie pour l&#39;évaluation de AF680-conjugués: In vivo NIRF-imagerie suivie par cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence. (B </strong&gt;) Schéma de AlexaFluor680 étiqueté + 16a de la nanocorps (rouge) et anticorps monoclonal Nika102 (bleu). Orange étoiles indiquent les fluorochromes AlexaFluor680. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> Figure 2: In vivo NIRF-imagerie d&#39;images du signal de fluorescence de l&#39;antigène-positive (+) et l&#39;antigène-négatives (-) des tumeurs chez les souris qui ont été injectés avec + l&#39;16a de Nanobodies (A) et l&#39;anticorps monoclonal Nika102 (B). . imagerie in vivo a été réalisée avant (0 h) et 6 h après l&#39;injection. Les intensités de signaux sont affichés sous forme efficacité radiante (p / sec / cm 2 / sr) / (uW / cm 2). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> Figure 3:Ex vivo analyses FACS de cellules lié constructions d&#39;anticorps à partir de suspensions de cellules tumorales. (A) stratégie déclenchement pour analyses FACS des cellules tumorales. (B) Les histogrammes afficher la quantité de + 16a et anticorps Nika102 du nanocorps AF680 conjugué injecté par voie intraveineuse lié spécifiquement aux cellules tumorales in vivo. tumeurs antigène négatif sont affichés sous forme d&#39;histogrammes en carnet et les tumeurs positives à l&#39;antigène sont affichés sous forme d&#39;histogrammes remplis. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> Figure 4:. Ex microscopie fluorescence in vivo (A) Vue d&#39;ensemble de la microscopie à fluorescence cryosections tumorales positives à l&#39;antigène entières 6 h après l&#39;injection de s + 16a 680 ou 680 Nika102. Intensités signal du in vivo par voie intraveineuse enjected AF680 conjugués sans aucun agent secondaire étiquetage sont affichées en rouge. Ex vivo noyaux contrecolorées sont affichés en bleu et les navires en vert. Les lignes pointillées indiquent les marges extérieures des tumeurs entières. (B) Gros plan microscopie à fluorescence des tumeurs positives à l&#39;antigène et de l&#39;antigène négatif.

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Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

validation-nanobody-antibody-based-vivo-tumor-xenograft-nirf-imaging

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JoVE Journal

Medicine

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

11.5K vues.  University Medical Center, Hamburg. This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Vidéo: Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Dans l&#39;imagerie in vivo de angiogenèse tumorale en utilisant la fluorescence confocale vidéomicroscopie

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

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Médecine

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound and aortic blood pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is raised then lowered incrementally by intravenous infusion of vasoactive drugs phenylephrine and sodium nitroprusside. Aortic diameter is measured for each pressure step to characterize the pressure-diameter relationship of the ascending aorta. Stiffness indices derived from the pressure-diameter relationship can be calculated from the data collected. Calculation of arterial compliance is described in this protocol.
This technique can be used to investigate mechanisms underlying increased aortic stiffness associated with cardiovascular disease and aging. The technique produces a physiologically relevant measure of stiffness compared to ex vivo approaches because physiological influences on aortic stiffness are incorporated in the measurement. The primary limitation of this technique is the measurement error introduced from the movement of the aorta during the cardiac cycle. This motion can be compensated by adjusting the location of the probe with the aortic movement as well as making multiple measurements of the aortic pressure-diameter relationship and expanding the experimental group size.

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.

Mesure aortique ascendant Rigidité<em&gt; In Vivo</em&gt; Chez la souris en utilisant des ultrasons

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Télémétrie intra-utérine mesurer souris contractile pression<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...