Ce protocole pour la localisation in vivo d’immunofluorescence, ou IVIL, évalue la biodistribution in vivo des anticorps diagnostiques et thérapeutiques ou des agents anticorps-basés pour la recherche, la détection, et le traitement de cancer. Contrairement à la coloration immunofluorescente conventionnelle où l’expression cellulaire des antigènes est révélée ex vivo, la méthode IVIL élucide la façon dont les anticorps et les agents à base d’anticorps se répartir chez l’animal vivant. Cette vidéo aidera à comprendre le flux de travail global de la méthode IVIL.
Il montre des détails importants pour la reproduction réussie du protocole pour d’autres applications et anticorps. Observez les souris du modèle de cancer désiré pour la croissance appropriée de tumeur par l’intermédiaire de la palpation ou de la mesure d’étrier avant de procéder. Purifiez les anticorps anti-souris B7-H3 et lapin IgG sur une colonne de désaltage afin d’éliminer les agents de conservation et les tampons de stockage selon les instructions du fabricant.
Aliquot dosages de 33 microgrammes de chaque anticorps conjuguer dans les tubes de microcentrifugeuse individuels. Après l’anesthésie décrite dans le protocole de texte, préparez-vous à l’inoculation de veine de queue des solutions d’anticorps. Désinfecter la queue de l’animal en essuyant trois fois avec un lingette d’alcool.
Dilater les veines de la queue en chauffant avec un coussin chauffant pendant environ 30 secondes. Évitez de chauffer tout l’animal. À l’aide d’un cathéter de veine de queue de calibre 27, insérez l’aiguille du papillon dans l’une des deux veines latérales de la queue.
Visualisez le flux sanguin dans le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est bien placée afin que les solutions entrent pleinement dans l’animal plutôt que d’être capturées dans la queue. Utilisez un morceau de ruban chirurgical pour fixer soigneusement la queue avec l’aiguille insérée à la scène. Rincer le cathéter avec 25 microlitres de solution saline stérile tamponnée de phosphate.
Ensuite, injectez la solution d’anticorps dans le cathéter à l’aide de seringues à insuline. Rincer le cathéter une fois de plus avec 25 microlitres de PBS stérile. Retirez l’aiguille de la queue et appliquez de la pression pour arrêter tout saignement.
Effectuez l’euthanasie humaine de la souris comme décrit dans le protocole de texte, et mentez la souris dans la position de supination. Utilisez des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour exciser les tissus tumoraux. Utilisez des forceps pour saisir seulement la couche externe de la peau entre l’ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue, et faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.
Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe, et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane abdominale sous-jacente de la paroi abdominale, la gardant intacte. Faire une incision verticale jusqu’à l’abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre la troisième et la quatrième glande mammaire, faire une coupe horizontale à travers l’abdomen pour permettre la rétractation de la peau et la visualisation des glandes mammaires.
Saisir chaque tumeur ou glande normale avec des forceps, couper soigneusement la peau attachée à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Placez les tissus excisés dans des moules de base jetables en tissu qui sont préétiquetés et remplis d’un milieu d’intégration optimal de la température de coupe. Congeler rapidement les moules par placement sur la glace sèche.
Afin d’étudier la livraison hors cible, exciser d’autres tissus ou organes d’intérêt. À l’aide d’un cryostat, sectionne les blocs de tissu congelés à 10 microns d’épaisseur et placez les sections adjacentes sur des toboggans en verre d’adhérence préétiquetés. Rincer les diapositives de tissu congelées avec pbs température ambiante pendant cinq minutes pour enlever le milieu d’intégration.
Délimiter les sections tissulaires à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe pour réduire le volume de solutions nécessaires lors de la coloration. Fixer les sections tissulaires avec 4% de solution de paraformaldéhyde pendant cinq minutes. Après avoir rinçant les diapositives dans PBS pendant cinq minutes, perméabiliser les sections tissulaires avec 0,5%Triton X-100 en PBS pendant 15 minutes.
Rincez les diapositives à nouveau dans PBS pendant cinq minutes. Bloquer les tissus avec PBS contenant 3% de poids par volume albumine de sérum bovin et 5% de volume par volume sérum de chèvre pendant une heure à température ambiante. Après avoir rinçant les glissières dans PBS pendant cinq minutes, incuber les sections avec des anticorps primaires de tenue de dossiers tels qu’un marqueur nucléaire, vasculaire ou cytoplasmique commun.
Ici, rat anti-souris CD31 est utilisé à une dilution d’un à 100 dans la solution de blocage. Les toboggans avec anticorps primaires sont laissés pendant la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la déshydratation sur un plateau de diapositives. Après l’incubation, rincer les glissières dans PBS pendant cinq minutes trois fois.
Changez le PBS à chaque fois. Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires pour étiqueter les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l’anticorps anti-B7-H3 à l’aide d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 546, et visualisez le CD31 avec l’anticorps secondaire anti-rat Alexa Fluor 488 dans la solution de blocage.
Protégez les glissières de la lumière et de la déshydratation sur un bac à glissière pendant une heure à température ambiante. Après le rinçage des diapositives dans PBS comme avant, appliquer une goutte du milieu de montage dans le centre de la tranche de tissu. Placez soigneusement un coverslip, en évitant le piégeage des bulles d’air.
Sceller les bords du coverslip avec du vernis à ongles clair, et laisser sécher. Procéder à l’imagerie par microscopie confocale et à l’analyse quantitative de l’image telle que décrite dans le protocole de texte. Les micrographes confocal représentatifs montrent la comparaison de la localisation conjuguée d’anticorps-ICG de B7-H3 spécifique et de la localisation conjuguée d’anticorps-ICG de contrôle non spécifique d’isotype dans les glandes mammaires murines contenant les tissus normaux ou carcinomes.
Glandes mammaires murines normales d’un animal injecté par voie intraveineuse avec Iso-ICG ou B7-H3-ICG et contre-tachées de CD31 ne montrent aucune coloration des conjugués anticorps. Les tissus normaux se sont montrés pour n’avoir aucune expression de B7-H3 par la coloration standard d’immunofluorescence d’ex vivo. Dans les tumeurs mammaires invasives, B7-H3-ICG se lie fortement à la vascularisation, le premier point de contact in vivo, puis est capable d’extravaser de la vascularisation pour tacher hétérogènement l’épithélium tumoral.
Iso-ICG montre l’accumulation non spécifique dans les tissus de tumeur. La coloration immunofluorescente ex vivo standard montre l’expression uniforme du marqueur B7-H3 sur les cellules épithéliales et endothéliales. Les micrographes confocal représentatifs montrent la méthode in vivo de localisation d’immunofluorescence pour détecter l’expression netrin-1 ou l’expression de contrôle d’isotype dans le carcinome murin et les glandes mammaires normales.
La localisation in vivo d’immunofluorescence confirme le signal épithélial pour netrin-1 dans les tumeurs de MMTV-PyMT mais pas dans les glandes mammaires normales. En outre, il y a un signal netrin-1 fort sur des cellules endothéliales dans des tumeurs de sein, comme indiqué par le signal jaune colocalisé. Le signal est significativement plus faible dans les glandes mammaires normales.
La méthode IVIL devra être optimisée en termes de dosage des anticorps, de synchronisation de la collecte des tissus et de dilution secondaire des anticorps pour une mise en œuvre réussie. L’IVIL permet de cibler les épitopes conformationnels qui ne peuvent pas être détectés à l’aide de taches d’immunofluorescence standard, ce qui nécessite un traitement tissulaire. En outre, des organes sains des souris tumeur-roulements peuvent être rassemblés pour évaluer la livraison hors cible des anticorps thérapeutiques.
Avec l’utilisation accrue de thérapeutiques à base d’anticorps et d’agents de contraste dans la recherche et la gestion du cancer, la méthode IVIL est très applicable à la recherche et au développement pharmaceutiques. Les chercheurs dans les thérapies de cancer, l’imagerie moléculaire, l’inflammation, et d’autres secteurs peuvent constater que la méthode d’IVIL fournit l’information utile.
