We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

Toutes les procédures exécutées sont approuvés par l&#39;École de médecine institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité Université de l&#39;Indiana et suivent Institut national de lignes directrices de la santé. 1. Technique chirurgicale <ol><li> Maintenir une technique aseptique lors de cette procédure en utilisant des gants stériles, des instruments et un champ opératoire stérile selon les directives du NIH 25. Stériliser les outils avant de commencer la chirurgie par eux autoclavage (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement pour la liste complète). Utiliser un stérilisateur à billes de verre pour stériliser les outils pendant l&#39;opération. </li></ol> 2. Anesthésie et préparation <ol><li> Anesthésier la souris dans une boîte d&#39;anesthésie avec un mélange de 0,9 L / min d&#39;oxygène et 2,5% d&#39;isoflurane utilisant un système de vaporisateur isoflurane vétérinaire. Assurez-vous que la souris ne répond pas à des changements dans la position du corps avant de le retirer de la boîte. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique à l&#39;mouLes yeux de soi pour les protéger du dessèchement. </li><li> Mettez le débit de gaz dans la zone du cône de nez. Placez la souris carrément sur son côté gauche sur un bloc couverte chauffée avec un tampon chirurgical et papier absorbant banc avec son nez et la bouche à l&#39;intérieur du cône. Surveiller en permanence le rythme respiratoire et le taux de la souris et ajuster les niveaux isoflurane selon les besoins (entre 2,5 à 3% d&#39;isoflurane) pour maintenir un niveau adéquat d&#39;anesthésie, et utiliser le pincement de l&#39;orteil réflexe pour confirmer la sédation totale. </li></ol> 3. Approche chirurgicale <ol><li> Aligner et concentrer le stéréoscope avec le champ opératoire. Ajuster le cône de nez et la bande vers le bas de sorte qu&#39;il est positionné le long du bord du champ visuel. </li><li> Avec la souris couché sur le côté gauche, la bande du bord de l&#39;oreille droite à le cône de nez, exposant la zone située derrière l&#39;oreille où l&#39;incision sera faite. Assurez-vous que la veine auriculaire postérieure se déplace horizontalement à travers l&#39;oreille. Notez que le placement correct de til animale et enregistrement de l&#39;oreille sont cruciales afin de trouver rapidement le nerf facial. </li><li> Mouiller la fourrure sur et derrière l&#39;oreille avec 70% d&#39;éthanol et de se raser le site chirurgical aide d&#39;un rasoir ou un scalpel lame. Prémouillage la fourrure facilite le rasage à cet endroit anatomique. </li><li> Nettoyer la peau avec une solution d&#39;iode, telles que le lavage chirurgical Betadine (7,5% de povidone-iode), suivie de 70% d&#39;éthanol. Répéter ce nettoyage deux fois plus pour désinfecter soigneusement la zone. </li><li> Pour déterminer où faire l&#39;incision, oligo la veine auriculaire postérieure de l&#39;oreille caudale vers la zone postérieure de la protubérance de l&#39;oreille. Avec des ciseaux de printemps, faire une incision de 4 mm 2 - 3 mm en arrière à la protubérance. </li><li> Disséquer par la graisse sous-cutanée et le fascia utilisant dissection. Evitez de couper direct avec les ciseaux, car les vaisseaux sanguins ou les tissus musculaires peuvent être facilement endommagés. </li><li> En cas de saignement, appliquer une pression sur le site chirurgical avec un coton-tige stérilependant au moins 30 sec. Si la perte de liquide importante se produit, injecter la souris par voie intraperitoneale avec 0,5 ml de solution saline stérile à 0,9% en utilisant une aiguille G 25 ou 27. </li><li> Utilisez plusieurs sites clés, le nerf spinal, canal de l&#39;oreille, et antérieure digastrique (décrit ci-dessous), pour localiser le nerf facial. Disséquer autour de ces sites jusqu&#39;à ce que les branches du nerf facial sont visualisés. Le nerf apparaît comme une structure solide blanc importante quand il se est révélé et une couche de fascia adhère à des structures sous-jacentes. <ol><li> Trouver le nerf spinal, qui se déplace de la partie caudale du crâne pour innerver le muscle trapèze, une fois que la graisse sous-cutanée et le fascia ont été disséqués. Le nerf facial est profonde du nerf spinal. </li><li> Trouvez le conduit auditif cartilagineux qui ressemble blanc nacré et peut être vu rostrale du nerf facial. </li><li> Trouver le ventre musculaire du muscle digastrique antérieure qui se trouve sur le dessus et caudal du nerf facial. </li></ol></li><li> Lorsque les principales branches du nerf facial sont visualisées, les tracer le dos pour trouver leur origine du foramen stylomastoïdien. En utilisant une pince fine pointe de Dumont # 5/45 pour maintenir le site chirurgical ouvert, avancer les conseils printemps ciseaux suivants le chemin de nerf, puis déplacez la pince le dos pour garder la zone nouvellement ouverte avancée. </li><li> Visualisez le tronc du nerf facial avec le zygomatique, buccale et branches mandibulaires marginaux à ce point. REMARQUE: La branche temporelle sera trouvé plus près des foramen. Les branches nerveuses mandibulaires marginaux dans ses parties supérieure et inférieure de plus près à la mâchoire, ainsi ces branches nerveuses ne seront pas visibles à ce niveau. <ol><li> Si l&#39;exécution d&#39;une transection du nerf, de stabiliser le nerf doucement avec les pinces fines de pointe et de couper le nerf avec les ciseaux à ressort. Éviter d&#39;appliquer trop de traction du nerf avec la pince pour empêcher avulsing le nerf partir du tronc cérébral. Pousserles souches de distance les uns des autres, ou couper et enlever une partie du nerf distale pour se assurer qu&#39;aucun reconnexion peut se produire. </li><li> Si l&#39;exécution d&#39;une lésion par écrasement, utiliser Dumont # 5/45 pince pour comprimer le nerf pendant 30 secondes en utilisant une pression constante pour rompre tous les axones, puis répétez cette cohue à un second angle perpendiculaire à la première place à l&#39;écrasement. Eviter d&#39;appliquer des quantités variables de pression pendant la cohue de 30 secondes, sinon la blessure ne sera pas uniforme entre les animaux. </li></ol></li></ol> 4. clôture et récupération <ol><li> Repositionner la graisse et les muscles sur les structures sous-jacentes. </li><li> Rapprocher les bords de l&#39;incision et de fermer la plaie en utilisant un clip de la plaie de 7,5 mm. Sutures ou de la colle est aussi acceptable pour la fermeture des plaies. Analgésiques post-opératoires peuvent être fournis à ce moment. </li><li> Retirer le ruban de l&#39;oreille de la souris. Éteignez le flux de l&#39;isoflurane et laissez la souris pour respirer l&#39;oxygène pur pendant 30 sec à 1 min. Place la souris dans une cage vide sans litière pour remettre de l&#39;anesthésie. </li><li> Lorsque la souris est récupéré, examiner son comportement pour des signes de confirmation de la paralysie faciale. Les moustaches seront paralysés et inclinés vers la joue, le nez sera dévié, et l&#39;œil ne clignote pas en réponse à une bouffée d&#39;air. </li><li> Animaux Maison conjointement après la chirurgie si elles sont des femmes. Évitez héberge des souris conjointement parce qu&#39;ils sont plus agressifs et ont tendance à retirer de force les clips de la plaie de leur compagnon de cage, ce qui conduit à l&#39;infection. Fournir analgésiques post-opératoires en ce moment, si nécessaire. </li><li> Surveiller les souris une fois par jour pendant plusieurs jours après l&#39;opération afin de se assurer qu&#39;aucune infection ou d&#39;autres complications se produisent après l&#39;opération. Retirer des agrafes 7-10 jours après la chirurgie se ils ne sont pas tombés sur leur propre. </li><li> Appliquer pommade ophtalmique lubrifiante à l&#39;œil touchée par jour pour prévenir les complications de la cornée, soit jusqu&#39;à ce que le réflexe de clignement des yeux est rerecouverts ou jusqu&#39;à l&#39;euthanasie. </li></ol>

Les auteurs ne ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Les données de résolution rendements paires de bases protocole présenté de méthylation de la cytosine à des régions génomiques biologiquement pertinents. Le protocole comme écrit est optimisé pour 50 ng de produit de départ, cependant, il peut être adapté pour traiter une gamme de matériel d&#39;entrée (5 ng ou plus) 26. Cela nécessitera des ajustements de certaines des étapes de protocole comme on le voit dans le tableau 6. Les bibliothèques de ERRBS se prêtent à un séquençage d&#39;extrémité et couplé en outre une couverture génomique peut également être réalisé par séquençage lectures plus de 51 cycles. Séquençage multiplexé offrira un protocole à moindre coût par échantillon, cependant, cela se traduira par une couverture réduite par site CpG représenté dans les données (Figure 5 et le Tableau 8), et ne cédera pas une profondeur suffisante de la couverture d&#39;effectuer des analyses qui nécessitent une couverture élevée par CpG place (par exemple comme décrit par Landan et al. 33). Enfin, ce protocole (ou tout Protoco base bisulfite-l) ne peut pas distinguer entre méthyl-cytosine et hydroxyméthyle-cytosine 46,47. Toutefois, les données générées peuvent être intégrés à d&#39;autres résultats protocole 48,49 pour délimiter les différentes modifications, et d&#39;autres modifications de cytosine récemment rapporté 50, devraient-ils être d&#39;intérêt. Bibliothèques de haute qualité apparaîtra comme le montre la figure 3A-C, et une fois mis en commun pour le séquençage donne une trace comme le montre la figure 3G (trace rouge) représentant contributions molaires égales des deux fractions de la bibliothèque. Bibliothèque échec de préparation peut résulter de ne importe quelle étape pendant la procédure. Si l&#39;ADN dégradé est traitée elle se traduira dans les bibliothèques qui ne sont pas enrichis en fragments Mspl et donc de la faible couverture CpG en utilisant les paramètres de séquençage décrites dans ce protocole. Si une enzyme est non fonctionnelle ou exclu par inadvertance de l&#39;une des réactions, le protocole donné la bibliothèque attendu. Si le rea de ligaturection est inefficace, les adaptateurs sont à une concentration plus élevée que prévu, et / ou la concentration des amorces utilisé est un réactif limitant pour les étapes finales d&#39;amplification, l&#39;échec de la bibliothèque peut se produire. Adaptateurs excès (considéré comme un des pics à ~ 150 pb dans les résultats de bioanalyse; Figure 3D-F) à la bibliothèque sera également interférer avec le séquençage due au regroupement aveugle de la bibliothèque et adaptateurs excès. Si une telle bibliothèque peut séquencer apparemment normalement, une partie importante du lit sera séquences simplement l&#39;adaptateur. Si des adaptateurs en excès sont observées dans une bibliothèque, il est préférable de répéter la préparation bibliothèque si le matériel est disponible en utilisant du matériel d&#39;entrée optimal à l&#39;adaptateur rapports quantitatifs. Enfin, pour assurer une amplification par PCR efficace des bibliothèques, les fractions bibliothèque inférieurs et supérieurs sont maintenus comme des échantillons distincts dans l&#39;ensemble de la conversion au bisulfite et PCR étapes d&#39;enrichissement. Ne pas le faire donne l&#39;efficacité différentielle de l&#39;amplification au cours de la PCR réaction de fractions supérieures et inférieures (comme on le voit sur ​​la figure 3G trace bleue) et le potentiel de la représentation inégale des loci génomiques respectif couverte dans chaque fraction bibliothèque au cours du séquençage. L&#39;utilisateur peut choisir d&#39;inclure une étape de PCR quantitative immédiatement après la conversion au bisulfite de titrage en outre des cycles de PCR optimales nécessaires pour amplifier les bibliothèques générées. ERRBS protocole de préparation de la bibliothèque comporte plusieurs étapes clés dans lesquels les réactifs spécifiques sont recommandées. Lors de l&#39;étape de fin de réparation, l&#39;utilisation d&#39;un mélange de dNTP à quatre nucleotides permet fin de réparation de tous produits qui ne contiennent pas le surplomb CG, tels que ceux résultant de MspI activité enzymatique en étoile et des fragments d&#39;ADN cisaillé présents dans l&#39;échantillon d&#39;ADN d&#39;origine. Il en résulte une meilleure représentation CpG dans les résultats. A l&#39;étape de ligature, il est essentiel d&#39;utiliser une ligase forte concentration (2.000.000 unités / ml) et méthylés adaptateurs pour se assurer que la Reacti de ligationOn est efficace et que la conversion au bisulfite ne influence pas les séquences d&#39;adaptation essentielles pour l&#39;alignement de données précises. A l&#39;étape PCR, en utilisant une polymérase capable d&#39;amplifier des fragments d&#39;ADN riches en GC traité au bisulfite est nécessaire pour une grande spécificité. Enfin, pour assurer l&#39;élimination des adaptateurs et les amorces en excès, SPRI cordon purification (par exemple: Agencourt AMPure XP) est recommandé plutôt que de tests basés sur des colonnes pour ligature et isolements de produits PCR. Afin de générer des données de haute qualité, il est important pour assurer une conversion au bisulfite efficace. Le contrôle présenté offre à l&#39;utilisateur la possibilité de déterminer l&#39;efficacité de conversion avant le séquençage. En variante, un ADN non humain tel que lambda ADN peut être utilisé en tant que contrôle interne (spike-in). En raison des différences entre les espèces, ce type de commande peut être directement inclus dans le séquençage en aval (par exemple, tel qu&#39;il est utilisé par Yu, et al. 34). Cependant, si le pic i-ins utilisé, il ne peut être utilisé pour déterminer l&#39;efficacité de conversion avant le séquençage bibliothèque amplifiée à moins unique et séquence avant le séquençage bibliothèque de façon indépendante. Les taux de conversion déterminés sont basés sur l&#39;état de méthylation des sites CpG non. Cela peut ne pas être approprié pour une utilisation dans le contexte de forte méthylation de la cytosine dans le contexte non CpG (par exemple des cellules souches embryonnaires) et des échantillons parallèles ou d&#39;autres moyens d&#39;évaluation de l&#39;efficacité de conversion peuvent être utilisés à cette fin. Il ya quelques mises en garde à l&#39;adresse qui sont uniques à l&#39;enchaînement des bibliothèques ERRBS. Les trois premières bases des fractions de la bibliothèque séquencés sont presque uniformément non aléatoire en raison du site de coupe de reconnaissance MspI (C ^ CGG; voir la figure 4B, C). Il en résulte le risque de perte de données importantes en raison de la faible qualité lectures résultant d&#39;une mauvaise localisation de cluster en dépit de la densité de cluster haute apparente au cours du séquençage. Pour surmonter cet obstacle,inclure une bibliothèque de grande complexité dans une voie indépendante (contrôle PhiX ou un autre type de bibliothèque) comme une voie de contrôle dédié. Bibliothèques de haute complexité ont des extrémités contenant une représentation équilibrée des A, C, T et G dans les quatre premières bases séquencées. Voies de contrôle appropriés comprennent les bibliothèques telles que l&#39;ARN-Seq, ChIP-seq, le séquençage du génome entier, ou un contrôle offert par le fabricant de la machine de séquençage (par exemple v3 contrôle PhiX). Lorsque désignée comme une voie de commande pour la course respective de séquençage, il peut servir de base pour la génération de la matrice qui est utilisée au cours des quatre premières bases de séquençage pour détecter des positions de la grappe. La qualité supérieure lectures capturé augmentera la couverture moyenne par site CpG de 5,2 (n = 4). Alternativement, cette difficulté technique peut également être surmonté en utilisant une approche de séquençage sombre comme décrit précédemment 23. Autres critères de séquençage suivent des procédures normalisées d&#39;exploitation par les protocoles du fabricant. Enfin, la couverture par CpG chosen pour l&#39;analyse des données sera guidé par l&#39;utilisateur et en partie par les questions biologiques d&#39;intérêt. 10x seuil de couverture offre une approche d&#39;analyse de couverture élevé, mais ce seuil peut être abaissé devrait-il être d&#39;intérêt. Une discussion complète de l&#39;analyse de données ERRBS est au-delà du champ d&#39;application de cet article, cependant, différemment cytosines méthylés et régions peuvent être déterminées en utilisant des outils open source 31,51-53. Considérations et des approches d&#39;analyse supplémentaires ont été bien décrit 54,55, et le lecteur est encouragé à rechercher la littérature pour les outils les plus appropriés pour l&#39;analyse prévue. Comparé à d&#39;autres méthodes publiées, ERRBS propose un protocole de quatre jours qui, lorsqu&#39;il est effectué alors que les rendements décrits taux élevés de reproductibilité. Il a été validé par rapport à l&#39;étalon-or MassARRAY EpiTYPER 26, est rentable pour des données de haute couverture, et est adaptable pour différents matériaux d&#39;entrée(montants favorables pour le traitement de l&#39;échantillon clinique et d&#39;autres types cellulaires de basse fréquence) et des approches de séquençage. Il offre une résolution paires de bases à des loci biologiquement pertinente et peut être utilisé dans les analyses d&#39;intégration avec d&#39;autres techniques de profilage du génome entier facteur de transcription contraignant, remodelage de la chromatine, marques épigénétiques et d&#39;autres modifications cytosine d&#39;intérêt. L&#39;utilisation des données ERRBS dans de telles études peut contribuer à une approche moléculaire complète et permettre grande dimension analyses dans l&#39;étude de modèles biologiques et la maladie humaine.

Méthylation de l&#39;ADN à la cytosine (5-méthylcytosine) est une marque épigénétique critique dans les cellules de mammifères pour une variété de processus biologiques, y compris mais non limité à l&#39;empreinte, l&#39;inactivation du chromosome X, le développement, et la régulation de l&#39;expression génique 1-8. L&#39;étude des modèles de méthylation d&#39;ADN dans les troubles malignes et d&#39;autres a déterminé les habitudes spécifiques de maladies et contribué à la compréhension de la pathogenèse de la maladie et de découvertes de biomarqueurs potentiels 9-17. Il existe de nombreux protocoles qui interrogent l&#39;épigénome de statut de méthylation d&#39;ADN. Ceux-ci peuvent être divisées en base d&#39;affinité, sur la base-enzyme de restriction, et des essais à base de conversion-bisulfite qui utilisent des puces à ADN ou les plates-formes en aval séquençage. En outre, il ya quelques protocoles qui comblent ces catégories générales, y compris, mais sans s&#39;y limiter, l&#39;analyse combinée de restriction bisulfite 18 et réduit Représentation bisulfite séquençage (ORR 19). </p&gt; RRBS a été initialement décrit par Meissner et al. 19,20. Le protocole introduit une étape d&#39;enrichir régions génomiques riches en GC suivie par séquençage bisulfite, qui a abouti à des données quantitatives de la résolution paires de bases qui est rentable 21,22. Les régions riches en GC sont ciblés par le MspI (C ^ CGG) enzyme de restriction, et la cytosine méthylation est résolu par conversion au bisulfite de cytosines (désamination des cytosines non modifiés à l&#39;uracile), suivie de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). RRBS couvert la majorité des promoteurs de gènes et îlots CpG dans une fraction du séquençage requis pour un génome entier; cependant RRBS avaient une couverture limitée des rives de CpG et d&#39;autres régions intergéniques de pertinence biologique. Plusieurs groupes ont publié des mises à jour des protocoles ORR depuis le rapport original améliorer la méthodologie et la couverture résultante de ces régions génomiques 23-25. Représentation accrue réduit bisulfite Sequdes diffi- (ERRBS) comprend des modifications de préparation bibliothèque et un alignement des données alternatif approche 26 par rapport à RRBS. ERRBS a entraîné une augmentation du nombre de CpG représentées dans les données générées et augmentation de la couverture de toutes les régions génomiques interrogé 26. Cette méthode a été utilisée pour résoudre des modèles de méthylation d&#39;ADN dans patient humain et d&#39;autres spécimens d&#39;animaux de 26 à 30. Le protocole de ERRBS décrit offre des détails sur toutes les mesures nécessaires pour l&#39;achèvement et des données a été généré en utilisant l&#39;ADN humain représentant (échantillons ont été obtenus à partir signalés précédemment, dépersonnalisées échantillons de patients 31 et CD34 + os échantillon de moelle d&#39;un donneur humain normal). Le protocole comprend un processus de sélection du format automatisé, ce qui réduit le temps de traitement par l&#39;échantillon et permet une précision accrue dans la sélection de la taille de bibliothèque. Le protocole combine une série de techniques de biologie moléculaire établies. ADN de haut poids moléculaire est digéré avecvec une enzyme de restriction de méthylation insensible (MspI) suivi d&#39;ici la fin de réparation, A-tailing, et la ligature d&#39;adaptateurs méthylés. Choix de la taille des fragments riches en GC est suivie par conversion au bisulfite et d&#39;amplification par PCR avant le séquençage. Conversion au bisulfite a été décrit précédemment 32 et un examen détaillé de l&#39;analyse des données et des applications est au-delà de la portée de ce document, cependant recommandations et des références sont inclus pour l&#39;utilisation des lecteurs. Le protocole peut être effectuée sur quatre jours et se prête à la petite entrée (50 ng ou moins) des montants significatifs. Le protocole fournit des données décrits à forte couverture par site CpG non seulement suffisante pour site de méthylation et la région déterminations différentielles mais également pour la détection du polymorphisme épigénétique comme décrit par Landan, et al. 33.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:497px;">URL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">MspI</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">R0106M</td>
			<td style="width:193px;">100,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/r0106-mspi</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">NEBuffer 2</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B7002S</td>
			<td style="width:193px;">Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:269px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P4557</td>
			<td style="width:193px;">Equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C2432</td>
			<td style="width:193px;">See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycogen</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G1767</td>
			<td style="width:193px;">19-22 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">NaOAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td style="width:193px;">3M pH 5.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td style="width:193px;">200 proof, for molecular biology</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Buffer EB</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">19086</td>
			<td style="width:193px;">10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T1503</td>
			<td style="width:193px;">prepare a 1M pH 8.5 solution</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T9285</td>
			<td style="width:193px;">Dilute to 1X buffer solution per manufacturer&#39;s recommendations</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B0202S</td>
			<td style="width:193px;">10X concentration</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">N0447L</td>
			<td style="width:193px;">10 mM each nucleotide</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0203L</td>
			<td style="width:193px;">3,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0210L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0201L</td>
			<td style="width:193px;">10,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28104</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;-deoxyadenosine 5&#39;-triphosphate (dATP)</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">U1201</td>
			<td style="width:193px;">100 mM</td>
			<td style="width:497px;">http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0212L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28004</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202M</td>
			<td style="width:193px;">2,000,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Methylation Adapter Oligo Kit</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td style="width:104px;">ME-100-0010</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:269px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:153px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63881</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use</td>
			<td style="width:497px;">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td style="width:104px;">CDF2010</td>
			<td style="width:193px;">with internal standards</td>
			<td style="width:497px;">http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Certified Low Range Ultra Agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-3106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:193px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpel&#160;Blade&#160;No.&#160;11</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&#38;tab=Items&#38;productId=11876776</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5001</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5030</td>
			<td style="width:193px;">Alternative for step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Universal Methylated Human DNA Standard</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td>D5011</td>
			<td style="width:193px;">Used as bisulfite conversion control</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">FastStart High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">03553426001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:193px;">A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:104px;">5067-4626</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&#38;tabId=AG-PR-1069</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&#38;tabId=AG-PR-1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pippin Prep</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>GD-401-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq SBS Kit v3-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-401-3002</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">TruSeq RNA Sample prep</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td style="width:193px;">Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol</td>
			<td style="width:497px;">http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Block Heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel doc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">UV or blue light transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

cartographie du réseau de méthylation de l&#39;ADN est fortement étudié dans les tissus normaux et malades. Une variété de procédés ont été mis en place pour interroger les schémas de méthylation de cytosine dans des cellules. Représentation réduite du séquençage du génome de bisulfite ensemble a été conçu pour détecter des modèles de résolution de méthylation de cytosine quantitatives de paires de bases à des loci génomiques riche en GC. Ceci est réalisé en combinant l&#39;utilisation d&#39;une enzyme de restriction suivie de la conversion au bisulfite. Représentation accrue réduit Bisulfite Sequencing (ERRBS) augmente le locus génomique d&#39;intérêt biologique couvert et a été utilisé pour profiler méthylation de cytosine dans l&#39;ADN d&#39;humain, de souris et d&#39;autres organismes. ERRBS amorce avec une enzyme de restriction digestion de l&#39;ADN pour générer des fragments de bas poids moléculaire pour une utilisation dans la préparation bibliothèque. Ces fragments sont soumis à la construction de la bibliothèque standard pour le séquençage de prochaine génération. Conversion au bisulfite de cytosines non méthylés avant la finale amplificatià l&#39;étape permet la résolution de base quantitative des niveaux de méthylation cytosine dans des loci génomiques couverte. Le protocole peut être effectuée dans les quatre jours. Malgré une faible complexité dans les trois premières bases séquencées, bibliothèques ERRBS fournissent des données de haute qualité en utilisant une voie de commande de séquencement désigné. analyse de la cartographie et de la bio-informatique est alors effectuée et fournit des données qui peut être facilement intégré avec une variété de plates-formes de l&#39;ensemble du génome. ERRBS peut utiliser de petites quantités de matières entrantes qui rend possible de traiter des échantillons cliniques humains et applicable dans une gamme d&#39;applications de recherche. La vidéo produite démontre étapes critiques du protocole de ERRBS.

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Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;ADN à la résolution de paires de base

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K vues.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

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In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

L&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Recherche

Biologie

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

Méthylation de l&#39;ADN: bisulfite de modification et d&#39;analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Gravité réduite manifestations Environnement matérielles d&#39;un cytomètre de flux et Compagnon microfluidique technologie de mélange prototype miniaturisé

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...