Ce protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques économique rend le séquençage à haut débit accessible aux laboratoires et aux études aux ressources limitées. Ce protocole ne nécessite pas d’équipement coûteux pour l’extraction de l’ADN de haute qualité et il peut être utile dans certaines situations de diagnostic ou de recherche où l’obtention d’une quantité suffisante d’ADN avec une qualité pour le séquençage à haut débit est difficile. Ce protocole est facile à répliquer avec une démonstration unique.
Il doit d’abord être essayé avec un petit nombre d’échantillons pour se familiariser avec le flux de travail. Pour commencer, hydratez les échantillons de tissus de moustiques stockés dans plus de 70% d’alcool en ajoutant 100 microlitres d’eau de qualité PCR et en incubant pendant une heure à quatre degrés Celsius pour adoucir le tissu. Après l’incubation, jetez l’eau et ajoutez 100 microlitres de mélange d’enzymes tampon protéinase K.
Ensuite, utilisez un pilon à tube microcentrifuge pour homogénéiser le tissu. Après homogénéisation, centrifuger le tissu lysat et incuber pendant deux à trois heures à 56 degrés Celsius. Pour extraire l’ADN, pipettez 100 microlitres du tissu lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation propre.
Ajoutez ensuite 215 microlitres du mélange maître de perles magnétiques. À l’aide d’une pipette, mélanger le lysat et le mélange de billes magnétiques pendant 10 à 20 secondes, puis le laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, secouez doucement le tube de temps en temps pour maximiser la liaison de l’ADN aux perles magnétiques.
Ensuite, placez le tube sur le séparateur de perles magnétiques jusqu’à ce que la solution devienne claire. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez doucement le liquide du tube sans perturber les perles magnétiques qui retiennent l’ADN. Éloignez le tube du séparateur de perles magnétiques et lavez les perles en ajoutant 325 microlitres de tampon de lavage.
Bien mélanger par pipetage et incuber pendant une minute à température ambiante. Après l’incubation, placez le tube sur le séparateur de perles magnétiques et retirez le surnageant comme démontré précédemment, puis éloignez le tube du séparateur de perles magnétiques et lavez les perles une fois avec un tampon de lavage. Après le deuxième lavage avec tampon un, lavez les perles deux fois avec 250 microlitres de tampon de lavage deux de la même manière.
Après le dernier lavage, éloignez le tube du séparateur de perles magnétiques et ajoutez 100 microlitres de tampon d’élution. Bien mélanger par pipetage puis incuber le tube pendant deux minutes à température ambiante avant de le remettre sur le séparateur magnétique. Lorsque la solution devient claire, transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge propre de 0,5 millilitre et le conserver de manière appropriée.
Montré ici comme une lecture typique de fluoromètre de microvolume de l’ADN du moustique dans un tampon d’élution contenant 0,5 millimolaire EDTA. Le rapport d’absorbance moyen de 260 à 280 nanomètres est de 2,3. Ce tableau indique les coûts et le nombre d’échantillons traités en une journée ouvrable pour différentes méthodes d’extraction.
Le coût typique du réactif et des consommables pour une extraction par ce protocole est d’environ 9,50 par échantillon. Ce coût est équivalent à n’importe quelle méthode d’extraction à base de billes magnétiques typique. Le principal avantage de ce protocole vient du fait qu’il n’est pas besoin de l’instrument automatisé d’extraction de l’ADN.
Assurez-vous de changer les pointes de pipette entre les échantillons pour éviter la contamination croisée de l’ADN lorsque vous travaillez avec plusieurs échantillons. Nous utilisons l’ADN de haute qualité extrait à l’aide de cette méthode pour le séquençage du génome entier. Nous utilisons actuellement les données de séquençage pour identifier de nouvelles mutations dans la résistance aux insecticides ou les gènes immunitaires préoccupants en santé publique et en lutte contre les maladies.
Disposer de solutions abordables pour le séquençage à haut débit ouvre des portes passionnantes pour la génomique des populations et la génomique du paysage visant à comprendre la dispersion des moustiques et le flux génétique, ce qui influence le succès de nombreuses nouvelles stratégies de contrôle génétique.
