Bisulfite de conversion de protocole Un protocole standard pour la conversion de 2 ug d&#39;ADN génomique est décrit ci-dessous. Quantités plus ou moins grande de l&#39;ADN génomique (100 pg-200 pg) peuvent également être traités avec succès au bisulfite. Ces conditions de réaction suite à une conversion complète (de 99,5 à 99,7%) de presque toutes les séquences d&#39;ADN cibles 3. 1. Préparation d&#39;ADN Préparer des échantillons par incubation de l&#39;ADN génomique avec le tampon de lyse ADN au bisulfite (2 ug d&#39;ARN t, 280 ng / ul protéinase K, SDS 1%) dans un volume total de 18 ul pendant 1 heure à 37 ° C. Note: Ceci est important pour atteindre la conversion au bisulfite maximale, en particulier avec l&#39;ADN isolé à partir d&#39;échantillons cliniques où il ya peut-être encore des protéines associées à l&#39;ADN. 2. Dénaturation ADN <ol><li> ADN Dénaturer mg 2 dans un volume de 20 ul en ajoutant 2 ul de NaOH 3M fraîchement préparés à une finale Concentration de 0,3 M. </li><li> Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min dans un bain d&#39;eau, suivie d&#39;une incubation à 90 ° C pendant 2 min dans un bloc thermique. Placez immédiatement les tubes sur la glace pendant 5 min. </li><li> Centrifuger les tubes à 4 ° C pendant 10 s à 10 000 g, pour assurer l&#39;ADN est au fond du tube. </li></ol> 3. Désamination bisulfite Sulfonation &amp; désamination hydrolytique <ol><li> Préparer des solutions fraîches de 10 mM Quinol et saturés 5,0 métabisulfite de sodium pH (7,6 g de Na 2 S 2 O 5 avec 464 ul de 10 M NaOH, composé à 15 ml avec de l&#39;eau). La solution de bisulfite de sodium saturée est obtenue en retournant doucement le réactif / H 2 O mélange, avec un mélange minimum et d&#39;aération. Si nécessaire, ajuster le pH avec NaOH 10 M, pour la dissolution complète de la Note métabisulfite:. Comme il s&#39;agit d&#39;une solution saturée, de petits morceaux peut rester non dissous. </li><li> Ajouter 208ul du métabisulfite saturés et 12 pl d&#39;Quinol 10mm à l&#39;ADN dénaturé (20 pi), dans un volume final de 240 ul à une concentration finale de 2.31m bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5,0. Mélanger délicatement tous les réactifs et centrifuger pendant 10 secondes afin d&#39;assurer toutes les gouttelettes sont au fond du tube. </li><li> Superposition des échantillons avec 200 ul d&#39;huile minérale. Incuber les échantillons à 55 ° C dans un bain d&#39;eau, pour 4-16 heures. La durée du traitement au bisulfite est dépendante de la quantité et la qualité de l&#39;ADN à se convertir. Pour l&#39;ADN de mauvaise qualité ou de l&#39;ADN dégradé, limiter le temps d&#39;incubation de 4 heures. Note: il est important que que la conversion au bisulfite a lieu dans l&#39;obscurité pour éviter l&#39;oxydation, donc si ce n&#39;est pas possible, enveloppez dans du papier les tubes avant l&#39;incubation . </li><li> A la fin de la période d&#39;incubation appropriée, centrifuger les tubes brièvement dans une microcentrifugeuse pour s&#39;assurer que tout le liquide est au fond du tube. </li><li> Récupérer l&#39;ADN au bisulfite traitéssous la couche d&#39;huile en prenant soin de pipetage à la solution d&#39;ADN à partir du bas du tube, sans prendre aucune des huiles minérales. </li></ol> Dessalage <ol start="5"><li> Retirez tous les ions libres bisulfite en passant par une colonne de dessalage et élution dans 50 pi de l&#39;eau milli-Q (MQH 2 O). Selon la quantité et la qualité de l&#39;ADN génomique et comment il est préparé, les différentes colonnes de dessalement peuvent être utilisés. Nous utilisons régulièrement Promega Wizard Nettoyer colonnes, comme ces colonnes sont appropriées pour éliminer le SDS utilisés dans la préparation de l&#39;ADN avant la conversion. </li></ol> Desulphonation Alkali <ol start="6"><li> L&#39;adduit de bisulfite est retiré de l&#39;anneau uracile par desulphonation. Desulphonate en ajoutant 5,5 ul de NaOH 3M fraîchement préparées à une concentration finale de 0,3 M, puis incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Centrifuger brièvement et ajouter 1 l de t ARN (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; Neutraliser la solution par l&#39;ajout de 33 ul d&#39;acétate d&#39;ammonium (NH 4 O Ac), pH 7,0 à une concentration finale de 3M. </li><li> L&#39;éthanol-précipiter l&#39;ADN en ajoutant 330 pl d&#39;éthanol à 100% de la glace froide, bien mélanger par inversion. Laisser au-20μC pendant 1 heure pour une nuit. Centrifuger à 14000 g pendant 15 min à 4 ° C. Enlever toute trace de surnageant et sécher à l&#39;air l&#39;ADN précipité pour ~ 20 min. </li><li> Re-suspendre le culot d&#39;ADN dans 50 ul / pg de 0,1 TE O. (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ou H 2 Laisser à température ambiante pendant environ 2 heures. Parfois les tubes vortex pour s&#39;assurer que l&#39;ADN est dissous, suivie par une centrifugeuse rapide. </li><li> Utiliser immédiatement pour l&#39;amplification PCR, ou conserver à -20 ° C pour les 1-10 ans en fonction de la quantité et la qualité de l&#39;ADN. </li></ol> 4. Amplification PCR Conception d&#39;amorce <ol><li> La conception efficace de conversion au bisulfite PCR des amorces spécifiques sont Crucial pour s&#39;assurer que l&#39;efficacité, l&#39;amplification de l&#39;ADN impartiale complètement converti survient. Les directives suivantes sont utilisées pour faciliter la conception d&#39;amorces. </li></ol> Directives de conception d&#39;amorce <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Pour tester l&#39;amplification par PCR de l&#39;ADN méthylé proportionnelle et non méthylé, utilisez un méthylées 50:50 / non méthylé échantillon pleinement bisulfite de contrôle et d&#39;amplifier convertis avec le bisulfite de conversion des amorces spécifiques dans les conditions optimisées de réaction PCR (figure 3). Pour l&#39;50:50 méthylées: non méthylé de contrôle, l&#39;utilisation in vitro de l&#39;ADN méthylé et SISP, soit du génome entier amplifié (WGA) ADN ou ADN du sang total. S&#39;il vous plaît être conscient que certains gènes seront naturellement méthylé dans le sang et donc dans ces cas il est préférable de n&#39;utiliser que WGA ADN en tant que &quot;non méthylé« contrôle. </li><li> Préparer des mélanges réaction d&#39;amplification par PCR dans 100 &amp; mu; aliquotes l contenant 2 ul de bisulfite de l&#39;ADN génomique convertis, 200 uM de dNTP, 1 uM amorces, 1,5 mM MgCl2, KCl 50 mM, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 et 0,15 polymérase Taq ul. </li><li> Dans un thermocycleur gradient de température, réglez la réaction s&#39;exécuter dans un gradient de + / - 3 ° C de la Tm prédit de l&#39;amorce à travers 10 tubes </li></ol><img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Pour vérifier que les amplicons méthylé et non méthylé ont été amplifiés en proportion, l&#39;amplicon peut être digéré par une enzyme de restriction informatif, telles que la Taq 1 (TCGA), qui va digérer l&#39;ADN méthylé, mais ne sera pas digérer l&#39;ADN non méthylé où le site d&#39;enzyme de restriction est modifié après la conversion au bisulfite à TTGA. L&#39;étendue de la digestion peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel (figure 3A). Alternativement, SybrGreen (0,2 l de dilution de 1:1000) peuvent être ajoutés à la réaction de PCR et del&#39;ampleur de la méthylation peut être évaluée en effectuant la chaleur de dissociation des parcelles dans un thermocycleur PCR en temps réel (figure 3B). </li><li> Mélange de PCR dont MgCl2 conditions de concentration et de thermocyclage peut-être besoin d&#39;être ajustée pour augmenter l&#39;efficacité de PCR ou d&#39;assurer proportionnelle amplification par PCR de méthylées et non méthylées fragments PCR. </li><li> Une fois les conditions de PCR sont optimisées, l&#39;amplification par PCR peut être effectuée sur des échantillons de bisulfite de convertis. Remarque: Une fois que le Tm est optimisé un gradient de température PCR ne doivent pas être utilisés. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un exemple d&#39;optimisation de bisulfite de l&#39;amplification par PCR est indiquée dans la Figure 3. Les conditions optimales de l&#39;amplification par PCR devrait amplifier amplicons méthylé et non méthylé dans la proportion et sans préjugé. La figure 3A montre un gel d&#39;agarose avec un profil de gradient de température amplification par PCR à partir d&#39;un mélange d&#39;ADN méthylé et 50% non méthylés. Th.e amplicons de PCR ont été traités avec une enzyme de restriction, la Taq 1 (TCGA), qui digèrent méthylé (M) d&#39;ADN, mais ne sera pas digérer non méthylé (U) l&#39;ADN comme le site d&#39;enzyme de restriction est altérée par la conversion au bisulfite à TTGA. Une quantité égale de coupés et non coupés produit de PCR est prévu si l&#39;ADN méthylé et non méthylé est amplifié en proportion. On peut voir sur ce gel que les conditions optimales pour thermocyling non biais d&#39;amplification est à 56,1 ° C (T). La conversion complète de l&#39;ADN au bisulfite peuvent également être analysés par digestion avec la cytosine place enzyme spécifique tels que HPA III (CCBG). Hpa III ne digèrent si la conversion a échoué, comme le site de restriction seront maintenues. Si la conversion est terminée, le site de restriction seront convertis en TCGG ou TTGG fonction de l&#39;état de méthylation de l&#39;ADN. Remplissez la conversion au bisulfite d&#39;ADN peut être vu dans la figure 3A (H). La figure 3B montre un tracé en temps réel de dissociation que lespeut également être utilisé comme un outil pour déterminer s&#39;il existe un biais d&#39;amplification basée sur la température à laquelle les différentes molécules se dissocient. Dans cette figure, on peut voir que le PCR a amplifié méthylé (M) et non méthylé (U) de l&#39;ADN dans la proportion d&#39;un mélange de l&#39;ADN méthylé et de 50% par rapport à non méthylé de l&#39;amplification de l&#39;ADN de contrôle totalement dénaturé et non méthylé qui se dissocient au 82.1μC et 78.9μC respectivement. Après l&#39;optimisation des conditions de réaction et de thermocyling Bisulfite échantillons traités peuvent être amplifiées avec volet spécifique et le bisulfite amorces spécifiques soit dans une seule réaction de PCR nichée ou semi. Les fragments PCR résultants peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel et séquencées, soit directement (figure 4A) ou par clonage et séquençage. Après clonage et séquençage de l&#39;état de méthylation des molécules individuelles peuvent être totalisées, dans une carte de bisulfite (figure 4B), de visualiser l&#39;hétérogénéité desméthylation. Haute analyse de la méthylation débit quantitatives peuvent être préformées en utilisant une telle technologie que celle utilisée par la méthode EpiTYPER Sequenom. En utilisant cette méthode, le bisulfite de l&#39;ADN converti est amplifié avec des amorces spécifiques de bisulfite PCR et suivie par un processus de clivage exclusive d&#39;. Les fragments résultants sont quantifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF avec le spectre spécifique dépendant de la présence de cytosines méthylées (figure 5A). Un résumé des rapports de la méthylation de l&#39;échantillon peut ensuite être extrapolées sous la forme d&#39;une épigramme (figure 5B) ou de la parcelle méthylation (figure 5C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Figure 1. Méthylés CpG schématique. Dans la cellule normale, promoteur-associé îlots CpG non méthylés sont majoritairement (gris), alors que les sites CpG au sein des instances du gène sont rares et généralement méthylé (rouge). Le panneau sur la droite étend la structure moléculaireUre de l&#39;ADN à un site individuel CpG et montre la méthylation avec une molécule CH3 au carbone 5 de la cytosine. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Figure 2. . Conversion chimique schéma d&#39;analyse de la méthylation de l&#39;ADN comprend quatre étapes principales, comme indiqué; dénaturation, la conversion au bisulfite, l&#39;amplification par PCR et d&#39;analyse. Dans le panneau de droite, des modifications à la molécule de cytosine qui se produisent lors de la conversion au bisulfite sont représentés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Figure 3. Optimisation de l&#39;amplification par PCR. A. Électrophorèse sur gel avec un profil de gradient de température amplification par PCR à partir d&#39;un mélange d&#39;ADN méthylé et 50% non méthylés. Des fragments ont été digérés avec soit Taq1 (T) ou HpaIII (H) qui digèrent l&#39;ADN méthylé et non l&#39;ADN au bisulfite convertis respectivement. B. Chauffer l&#39;analyse montre une courbe de dissociation équationla proportion de l &#39;ADN méthylé et non méthylé (ligne rouge mélange 50/50) par rapport à l&#39;amplification totalement le contrôle de méthylé (ligne rose, M) et de l&#39;ADN non méthylé (ligne verte, U) qui se dissocient à 82,1 ° C et 78,9 ° C respectivement. <img alt="La figure 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Figure 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Figure 4. Exemple de séquençage direct et d&#39;une carte de bisulfite. A. Traces de séquence de trois lignées cellulaires différentes avec des sites CpG surlignés en jaune. Cellule ligne X affiche méthylation de 100% sur les trois sites CpG alors des lignées de cellules Y et Z montrent des degrés variables de méthylation tel que vu par chevauchement G / A des signaux. B. Représentant bisulfite carte montrant la densité de la méthylation (points rouges) à chacun des sites CpG, tel que déterminé par séquençage direct des clones individuels. <img alt="Figure 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Figure 5. Haute analyse de la méthylation d&#39;ADN à l&#39;aide de Sequenom. A. Vue du spectre à l&#39;aide de Sequenom EpiTYPER technologie. Des fragments d&#39;ADN d&#39;affichage des spectres spécifiques, en fonction de la quantité de méthylation de l&#39;ADN présents. B. Epigram résumé du pourcentage de méthylation de l&#39;ADN de chaque site CpG pour quatre différentes lignées cellulaires. C. Résumé complot méthylation issus de l&#39;épigramme de Sequenom.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Analyse de la méthylation de l&#39;ADN par séquençage génomique de l&#39;ADN transformé bisulfite est une méthode bien établie et polyvalent qui facilite l&#39;identification et la quantification de la méthylation de l&#39;ADN à la résolution seul nucléotide. Toutefois, la conversion au bisulfite et l&#39;analyse ultérieure repose sur la prémisse que l&#39;ADN a été entièrement transformé avec chaque cytosine non méthylée en uracile étant désaminée et seulement cytosines méthylées restent non-réactive. Si la conversion est incomplète, des problèmes peuvent survenir avec l&#39;analyse depuis inconvertis cytosines non méthylées peut être interprétée à tort comme cytosines méthylées. La conversion au bisulfite peut être optimisée à différents stades de maximiser le pourcentage de conversion. Pour l&#39;ADN pour être entièrement transformée elle doit d&#39;abord être simple brin de sorte que les résidus cytosine sont exposés à des ions bisulfite. La première étape, la dénaturation de l&#39;ADN, est critique et peut être la source de la conversion incomplète si l&#39;ADN n&#39;est pas complètement dénaturé. Pour assurerque l&#39;ADN est complètement dénaturé, il est important que les paramètres de la réaction, y compris l&#39;enlèvement de toutes les protéines associées, la concentration en sel échéant, la température d&#39;incubation et le temps sont adaptés pour maintenir l&#39;ADN de conformation simple brin. Il est important d&#39;utiliser des frais NaOH 3M et de permettre un temps d&#39;incubation adéquate. Si l&#39;ADN est résistant à la dénaturation, quelques modifications au protocole, y compris l&#39;extension du temps d&#39;incubation à 30 minutes ou de fragmenter l&#39;ADN avant la dénaturation peut faciliter dénaturation de l&#39;ADN. En outre, l&#39;ADN simple brin (ADNsb) peut re-recuit d&#39;ADN double brin (ADNdb) lors de la réaction de conversion au bisulfite. Réaliser la réaction à une température plus élevée (90-95 ° C) soit périodiquement, soit en continu pendant la réaction au bisulfite peut aider au maintien de ADNsb. Cependant, il est important d&#39;être conscient que la dégradation de l&#39;ADN est fortement accélérée à ces températures plus élevées. Différents réactifs peuvent également être ajoutés à perturber re-recuit de ebrins d&#39;ADN e, tels que l&#39;urée. La concentration de l&#39;ADN et sa qualité peut également affecter l&#39;efficacité de la réaction au bisulfite et ultime de rendement PCR. Dégradation de l&#39;ADN est une limitation du protocole de conversion au bisulfite. Le traitement chimique de l&#39;ADN introduit dans les différentes cassures simple brin et une partie des dures conditions nécessaires pour la conversion au bisulfite complète y compris la concentration de bisulfite de haut, les temps d&#39;incubation est longue peuvent accélérer la dégradation de l&#39;ADN. Dans les conditions réactionnelles standard décrit, la dégradation de l&#39;ADN n&#39;est pas un problème commun cependant, si des modifications du protocole sont introduits, tels que des séquences qui sont réfractaires à la conversion, pour les matrices d&#39;ADN qui sont dégradés ou de mauvaise qualité tels que des échantillons FFPE, puis la dégradation de l&#39;ADN peut devenir une limitation importante. Le formol fixes, inclus en paraffine (FFPE) et des échantillons d&#39;ADN dégradé peut être efficacement converti au bisulfite et amplifiée en utilisant ce protocoleCependant des modifications pour s&#39;assurer que l&#39;ADN n&#39;est pas encore dégradé sont conseillés. L&#39;utilisation d&#39;un ARN porteur tel que le t ARN est recommandée. Aussi glycogène peut être ajouté en tant que transporteur lorsque la concentration en ADN est faible (&lt;200 ng). Parce que l&#39;ADN isolé à partir des tissus FFPE est déjà fragmenté et fragmentation a lieu pendant la désamination, des précautions doivent être prises pour minimiser la dégradation de l&#39;autre. Ne pas le fragment d&#39;ADN plus loin avant dénaturation et de limiter le temps d&#39;incubation pour la réaction au bisulfite à 4 heures. Conception amplicons pas dépasser 300 pb en raison de l&#39;ADN fragmenté. Un autre facteur qui peut affecter l&#39;amplification par PCR que la conversion au bisulfite de cytosines non méthylées réduit la complexité de la matrice d&#39;ADN. Le protocole d&#39;amorces suivantes de conception présentés dans la section 4.1, longueur de l&#39;amorce accrue et PCR nichée pouvons tous contribuer à accroître la spécificité et le rendement de PCR. Enfin, puisque la matrice d&#39;ADN est altéré au cours bisulphite de conversion, le biais d&#39;amplification peut être un sujet de préoccupation. Assurez-vous que l&#39;amplification par PCR des modèles proportionnels méthylé et non méthylé est vérifié avec un contrôle 50/50 M / U mélange d&#39;ADN, tel que décrit dans le protocole, voir la figure 3. Assurez-vous également que l&#39;amplification de modèles seulement converti qui se passe à l&#39;aide d&#39;enzymes de restriction et électrophorèse sur gel HpaIII (figure 3). Les conditions de PCR peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé en faisant varier la concentration de température et / ou de magnésium ou l&#39;allongement du temps de prolongation. Certains modèles semblent être particulièrement problématique et de la position primaire peut être nécessaire d&#39;ajuster ou d&#39;amorces dégénérées peut-être besoin d&#39;être utilisé. Suivant les techniques de séquençage de nouvelle génération sont en évolution rapide pour parvenir à une résolution semblable à bisulfite séquençage génomique, et la troisième séquençage molécule seule génération a le potentiel pour permettre l&#39;analyse de l&#39;ADN à la fois primaire et la méthylation sans la nécessité pour le séquençage au bisulfite. Cependant, une grande disponibilité et spécificationsificity de ces techniques restent un certain temps loin. Séquençage génomique au bisulfite est le gold standard en matière d&#39;analyse de méthylation et est un protocole robuste. La méthode a progressé au point où les problèmes communs et les limites ont été résolus et les applications se sont développées à partir d&#39;analyses des gènes individuels à haut débit et d&#39;analyse du génome entier décrit par Clark et al. 2006 4. Dépannage des directives et des recommandations additionnelles, sont décrits dans le tableau 1. Il est suggéré que l&#39;approche optimale consiste à d&#39;abord suivre le protocole standard et seulement introduire de modification si et quand un problème survient. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tableau 2" /> Tableau 1. Instructions de dépannage

<ol><li> Métabisulfite de sodium (Ajax Finechem) </li><li> L&#39;hydroquinone (Merck) </li><li> Assistant ADN système de nettoyage (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

L&#39;épigénétique décrit les changements héréditaires dans la fonction des gènes qui se produisent indépendamment de la séquence d&#39;ADN. Les bases moléculaires de la régulation des gènes épigénétique est complexe, mais implique essentiellement des modifications de l&#39;ADN lui-même ou les protéines avec lesquelles les associés d&#39;ADN. La modification principale épigénétiques de l&#39;ADN dans les génomes de mammifères est la méthylation des nucléotides cytosine (5-MeC). Méthylation de l&#39;ADN donne des instructions aux machines d&#39;expression génique de savoir où et quand le gène doit être exprimé. La séquence cible primaire pour méthylation de l&#39;ADN chez les mammifères est 5&#39;-CpG-3 &#39;dinucléotides (figure 1). Dinucléotides CpG sont pas uniformément réparties dans tout le génome, mais sont concentrées dans les régions de séquences génomiques répétitives et de CpG «îlots» communément associés avec les promoteurs des gènes (figure 1). Méthylation de l&#39;ADN sont établis au début du développement, modulée au cours différenciation des tissus spécifiques et perturbée dans de nombreux états pathologiques, y compris le cancer. Pour uomprendre le rôle biologique de méthylation de l&#39;ADN et son rôle dans la maladie humaine, précise, efficace et reproductible méthodes sont nécessaires pour détecter et quantifier individuels 5-mecs. Ce protocole pour la conversion au bisulfite est le «gold standard» pour l&#39;analyse de méthylation de l&#39;ADN et facilite l&#39;identification et la quantification de la méthylation de l&#39;ADN à la résolution seul nucléotide. La chimie de la désamination cytosine par le bisulfite de sodium comporte trois étapes (figure 2). (1) Sulfonation: L&#39;addition de bisulfite au lien 5-6 double de la cytosine (2) La désamination Hydrolic: désamination hydrolytique de la cytosine-bisulfite résultant dérivés pour donner un dérivé de l&#39;uracile-bisulfite (3) Desulphonation Alcali: Retrait du sulfonate groupe par un traitement alcalin, pour donner l&#39;uracile. Bisulfite désamine préférentiellement cytosine en uracile dans l&#39;ADN simple brin, alors que 5-MEC, est réfractaire à bisulfite médiée par désamination. Après amplification par PCR, l&#39;uracile est amplifiéque la thymine, alors que 5-MeC résidus restent en cytosines, permettant CpG méthylés d&#39;être distingué de CpG méthylés par la présence d&#39;une cytosine &quot;C&quot; contre la thymine &quot;T&quot; de résidus au cours de séquençage. Modification de l&#39;ADN par la conversion au bisulfite est un protocole bien établi qui peut être exploité pour de nombreuses méthodes d&#39;analyse de la méthylation d&#39;ADN. Depuis la détection de la 5-MeC par la conversion au bisulfite a d&#39;abord été démontré par Frommer et al. 1 et Clark et al. 2, les méthodes de conversion basé autour de bisulfite de compte ADN génomique pour la majorité des nouvelles données sur la méthylation de l&#39;ADN. Différentes méthodes de post analyse PCR peut être utilisée, selon le degré de spécificité et de la résolution de la méthylation nécessaire. Le clonage et le séquençage est encore la méthode la plus facilement disponible qui peut donner seule résolution pour la méthylation de nucléotides dans la molécule d&#39;ADN.

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DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

L&#39;étalon-or pour l&#39;analyse de la méthylation de l&#39;ADN est le séquençage génomique de l&#39;ADN au bisulfite convertis. Cette méthode tire parti de la sensibilité accrue de la cytosine par rapport à 5-méthylcytosine (5-MeC) au bisulfite désamination dans des conditions acides. Cytosines non méthylées peuvent être distingués des cytosines méthylées après amplification par PCR de l&#39;ADN génomique cible.

Méthylation de l&#39;ADN: bisulfite de modification et d&#39;analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

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104.1K vues.  Garvan Institute of Medical Research. L'étalon-or pour l'analyse de la méthylation de l'ADN est le séquençage génomique de l'ADN au bisulfite convertis. Cette méthode tire parti de la sensibilité accrue de la cytosine par rapport à 5-méthylcytosine (5-MeC) au bisulfite désamination dans des conditions acides. Cytosines non méthylées peuvent être distingués des cytosines méthylées après amplification par PCR de l'ADN génomique cible.

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Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Détermination de méthylation de l&#39;ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Modification génétique et la recombinaison des cultures d&#39;organes salivaires Gland

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Gravité réduite manifestations Environnement matérielles d&#39;un cytomètre de flux et Compagnon microfluidique technologie de mélange prototype miniaturisé

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;ADN à la résolution de paires de base

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)