Nous remercions le Dr U. Ashery pour le don de NPY-mRFP ADNc. Nous remercions les Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, et Y. Zilberstein pour son aide précieuse à la microscopie et analyse d&#39;images. Nous remercions également le Dr Joseph Orly pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation israélienne des sciences, fondée par l&#39;Académie israélienne des sciences (1139-1112 RS-E.).

1. Préparation de RBL Culture Cellulaire médias <ol><li> Mélanger 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco faible taux de glucose (DMEM) avec 56 ml de sérum de veau fœtal (cela fait 10% de FBS), puis ajoutez 5,5 ml de pénicilline streptomycine (ce qui rend ~ 1% PEST). </li><li> Filtrez les médias en utilisant 500-1000 ml Bottle-Top filtres à vide avec 0,22 um taille des pores et conserver à 4 ° C. </li></ol> 2. Culture de cellules RBL <ol><li> Cultiver les cellules RBL dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C, dans des plaques ou flacons. Cellules RBL qui gagnent en plaques de 10 cm doivent être complétés par 10 ml de milieu et forment monocouche confluent de ~ 10 7 cellules / plaque. </li><li> Lorsque la couche cellulaire se approche de la confluence, Réensemencement la culture à une densité inférieure. <ol><li> Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur stérile raccordée à vide. </li><li> Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37° C) 0,25% de trypsine / EDTA qui couvre l&#39;ensemble monocouche (le volume dépend de la taille de la plaque de culture / flacon; 2 ml pour 10 cm de plaque). Cela détacher les cellules. </li><li> Sinon, laver la monocouche cellulaire avec tampon phosphate salin (PBS), retirez le PBS et ajouter préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA. Cette étape détache les cellules plus rapidement. </li><li> Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min). </li><li> Inspectez les cellules sous le microscope optique pour vérifier se ils ont détaché. Si les cellules ne se détachent au bout de 10 min, appuyez doucement sur la plaque / flacon. </li><li> Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du milieu doit être au moins 2 fois supérieur au volume de la solution de trypsine). </li><li> Pellet les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 g à 25 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans un milieu. Diluer les cellules en 1h10 et épépiner dans une nouvelle boîte de culture. Incuber les cellules pendant 48 à 72 h, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils REACh environ 90% de confluence. </li><li> Répétez la même procédure (section 2.2.1-2.2.8) pour un maximum de trois mois (30 passages). </li></ol></li></ol> 3. Préparation de transfection médias. <ol><li> Préparer une solution de 100 mM pH 7, solution 1 mM de Ca2 + et de la solution de l&#39;acétate 100 mM d&#39;acétate de Mg 2+ K Pipes. </li><li> Diluer la solution 100 mM de K Pipes à pH 7 en utilisant 20 mM de milieu DMEM, ajouter la solution de 1 mM de Ca 2+ de l&#39;acétate à une concentration finale de 10 uM et une solution 100 mM de Mg 2+ acétate à une concentration finale de 2 mM. </li><li> Peser potassium glutamate et l&#39;ajouter à la solution à une concentration finale de 128 mM, bien mélanger et maintenir à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Gardez les solutions restantes (ie., K-Pipes, Ca 2+ acétate, Mg 2+ acétate) à -20 ° C. </li></ol> 4. Transfection de cellules RBL <ol><li> Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole au moyen d&#39;unpipette pasteur stérile connecté à vide. </li><li> Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA qui devrait couvrir l&#39;ensemble monocouche. Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min). Vérifiez si les cellules ont détaché en utilisant le microscope optique. </li><li> Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du support doit être au moins de 2 plus grande et plus que le volume de la solution de trypsine). </li><li> Comptez le nombre de cellules en utilisant hémocytomètre. </li><li> Pellet 1,5 × 10 7 cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g à 25 ° C. Jeter le surnageant et ajouter 280 ul de milieu de transfection. Transférer le mélange de réaction dans 4 mm cuvette. </li><li> Ajouter 20 pg de NPY-mRFP plasmide et soit 30 ug du contrôle plasmide vide ou un plasmide testé. Le volume final du mélange de réaction doit être de 300 ul. </li><li> Placer immédiatement sur de la glace pendant 10 min. Essuyer la cuvette de l&#39;eau résiduelle et procéder à une électroporation à 300 V pendant 9 ms. </li><li> Pour les mesures de l&#39;exocytose, Réensemencement les cellules immédiatement dans 24 des boîtes de culture tissulaire puits contenant 300 ul de milieu. Ajouter 8 ul du mélange de réaction (4 × 10 5 cellules) dans chaque puits. Ajouter cellules 4 × 10 5 non transfectées à des puits supplémentaires pour le contrôle. Préparer suffisamment de puits pour avoir au moins des puits en double pour chaque traitement pour chaque transfection. </li><li> Par microscopie laps de temps, immédiatement Réensemencement les cellules dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits contenant 80 ul de milieu. Ajouter 1,5 pi de mélange réactionnel (7,5 × 10 4 cellules) pour chaque chambre. (Essayez d&#39;éviter d&#39;utiliser les chambres au bord de la lamelle, les chambres au centre de la lamelle sont plus faciles à l&#39;image). NOTE: Il est important, toutes les cellules de réponse de pas à un déclencheur et parfois la microscopie time-lapse est abrogée en raison de perte de concentration et de la dérive de la borosi de chambre 8 puitssystème de lamelle licate. Par conséquent, préparer au moins 8 chambres pour chaque traitement pour chaque transfection. </li><li> Pour sensibiliser les cellules pendant l&#39;activation médiée par FceRI, ajouter 1 ug / ml de DNP monoclonal de souris spécifique des IgE à la presse (incuber les cellules avec des IgE pendant au moins 2 h). </li><li> Après 18 à 24 h utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer que les cellules expriment les plasmides. Les excitation et d&#39;émission des longueurs d&#39;onde de la fluorescence mRFP sont: Xex 584, Xem 607 nm. NPY-mRFP devrait apparaître dans des structures vésiculaires qui correspondent aux SG. Si le second gène d&#39;intérêt est fusionnée à un marqueur fluorescent utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer la co-expression des deux plasmides dans les mêmes cellules. Par exemple, si le gène testé est fusionné à la GFP, Les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission de fluorescence de la GFP sont: Xex 488, Xem 507 nm. La protéine GFP étiqueté devrait apparaître dans les mêmes cellules qui expriment NPY-mRFP. </li><li> Pour les mesures d&#39;exocytose procéder to étape 5 et pour la microscopie laps de temps, passez à l&#39;étape 6. </li></ol> 5. Mesure de NPY-mRFP exocytose <ol><li> Préparation du tampon Tyrode: <ol><li> Préparer une solution de 54 mM de KCl, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl et 8 mM de NaH 2 PO 4 dans DDW. Bien mélanger et stocker à 4 ° C. Cette étape est la préparation de tampon 20x Tyrode. </li><li> Préparer une solution de Hepes 20 mM pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose et de 1 à 20 dilution de Tyrode 20x dans DDW et bien mélanger. Cette étape est la préparation de tampon 1x Tyrode. </li><li> Aliquoter le tampon 1x Tyrode et conserver à -20 ° C. Évitez congélation et décongélation répétée. </li></ol></li><li> Retirez le milieu de culture de la plaque à 24 puits et laver trois fois avec un tampon Tyrode. Préparer des cellules non stimulées en ajoutant un tampon Tyrode 200 pi aux puits témoins. </li><li> Préparez 10 ul / puits de réactif d&#39;activation concentré 20X [(par exemple, 1000 ng / ml DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de Ca 2+ ionophore (A23187 par exemple), et une combinaison de 20 uM ionophore Ca2 + et 1 000 nM 12-O- tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA)]. Si les réactifs sont conservés dans du DMSO, diluer les réactifs en concentration 20x dans le tampon de Tyrode contenant 1% de DMSO. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirez les surnageants de chaque puits avec soin pour une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière. (Les surnageants contiennent le peptide chimérique NPY-mRFP qui a été libéré par les cellules). </li><li> Ajouter tampon Tyrode 200 pi contenant 0,5% de Triton X-100 à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. (Cette étape est importante pour la préparation de lysats de cellules qui contiennent le restant de NPY-mRFP qui n&#39;a pas été libéré par les cellules). Recueillir les lysats cellulaires et les transférer sur une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière. </li><li> Mesurer la fluorescence des surnageants cellulaires et des lysats cellulaires en utilisant un Déessrence lecteur de plaque, en utilisant un 590-, 20 nm de bande passante excitation filtre et 635-, 35 nm filtre bande passante d&#39;émission. </li><li> Calculer le pourcentage de NPY-mRFP publié: NOTE: La mesure de lecteur de fluorescence unités de fluorescence arbitraires (AFU). AFU valeurs dépendent de la machine et de sa sensibilité et de l&#39;efficacité de transfection. <ol><li> Réglez le autofluorescence des cellules RBL non transfectées comme vierges. Divisez la AFU de chaque surnageant à la fluorescence totale (AFU des surnageants + AFU du lysat correspondant) et multiplier par 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse microscopie d&#39;exocytose <ol><li> Graine 7,5 × 10 4 cellules de la / chambre transfectée dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits. Après 18 à 24 h, éliminer le milieu de culture des chambres et laver trois fois avec un tampon Tyrode </li><li> Ajouter 72 pi de tampon Tyrode à chaque chambre. Diluer les réactifs d&#39;activation dans un tampon Tyrode à la concentration 10x. </li> &lt;li&gt; utiliser un microscope à fluorescence confocal équipé d&#39;une chambre chauffée (37 ° C) et CO 2 de commande (4,8%) et un objectif 40X ou 63X. Activer les systèmes de microscope: lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Assurez-vous que la chambre est chauffée à la bonne température avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Placez la chambre dans la chambre chauffée et assurez-vous que la chambre est correctement installé et stable. </li><li> Allumez la lumière de fluorescence selon le fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Éteignez fluorescence fois une cellule d&#39;intérêt est dans le domaine afin de minimiser le blanchiment et la cytotoxicité. Il est important que ce champ contiendra environ 3.2 cellules transfectées. Les cellules transfectées doivent être bien répartis mais ne se touchant pas les uns les autres. </li><li> Réglez la puissance du laser (selon le microscope) pour minimiser le bruit et sursaturation ainsi que la toxicité, et régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit. Balayage rapide ouder à minimiser la durée d&#39;exposition au laser (moyenne de 2). </li><li> Ajuster la taille sténopé à un maximum, cela permet de diminuer la puissance du laser et de maintenir images porté pendant une longue période de temps. Si vous le souhaitez, définir les paramètres de la pile de Z à reconstruire l&#39;image en trois dimensions, ajuster la taille sténopé à 1 unité aérée (UA) qui donne le meilleur rapport signal sur bruit et acquérir balayage successives de tranches optique confocal à deux dimensions dans le z -axes avec des tranches optiques ≤0.7 um. </li><li> Réglez l&#39;intervalle de temps entre chaque acquisition de 15 à 30 secondes et la durée d&#39;acquisition totale de 15 min et commencer à acquérir des images. Après 5 minutes de pause acquisition de la série chronologique. Ajouter 8 pi de la gâchette 10x et continuer immédiatement l&#39;acquisition. </li><li> Enregistrer les images, effectuez déconvolution en utilisant un logiciel de déconvolution et de reconstruire les piles à images en trois dimensions et d&#39;un film en utilisant un logiciel Imaris. </li></ol><ol><li> Importer les données à partir des images de séries chronologiques déconvolués qui ont été obtenues par le microscope à fluorescence confocale à Imaris logiciel. Ce logiciel lit plus de 40 fichiers microscopie. Si le logiciel ne peut pas lire les fichiers; convertir les fichiers au format TIF et l&#39;importation. </li><li> Pour ajouter des points de temps à la fin d&#39;un ensemble de données ouverte appuyez sur Modifier -&gt; Ajouter des points de temps et d&#39;importer les nouveaux ensembles de données. </li><li> Créer surface du canal mRFP utilisant l&#39;option de l&#39;assistant de surface. Choisissez l&#39;algorithme par défaut. Choisissez le canal de NPY-mRFP. Marquez l&#39;option de lissage pour réduire le bruit. Pour éviter la perte de petits détails de réduire le niveau de détail de la zone à 0,05 um. </li><li> Réglez le seuil d&#39;intensité. Nouvelle surface grise se affiche. Allez dans &quot;Paramètres&quot; et changer le style de &quot;point central&quot; à &quot;Surface&quot;. </li><li> Allez à l&#39;onglet statistique dans les propriétés de l&#39;objet sélectionné, sélectionnez l&#39;onglet détaillée et la CUS de valeur spécifiqueh que l&#39;intensité de fluorescence, volume, etc. </li><li> Examiner les données et de confirmer que les valeurs sont compatibles avec les images. Par exemple, deux ou plus de granules adjacents peuvent être mesurés comme une plus grande granule. Pour quantifier la taille moyenne des granules diviser la taille des granules ont fusionné pour le nombre réel de granules. </li><li> Exporter les ensembles de données désirées vers des fichiers Excel et analyser les données. </li></ol> fa

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The authors have no financial conflicts of interest.

Nous décrivons une stratégie innovante qui combine la quantification des MCs exocytose et quatre (x, y, z, t) quantifications de dimension par imagerie de temps écoulé en trois dimensions des SG dans les cellules vivantes en utilisant un gène rapporteur pour l&#39;exocytose. Cette technique permet le dépistage des familles de protéines pour leur impact sur la fonction MC tels que SGS de surveillance à partir dès leur sortie de l&#39;appareil de Golgi travers leur maturation, l&#39;acquisition de la compétence ...

Mastocytes (MC) sont des cellules immunitaires qui sont les mieux connus pour leur implication dans des réactions allergiques et inflammatoires telles que l&#39;arthrite, l&#39;asthme, l&#39;oesophagite à éosinophiles, la dermatite chronique et choc anaphylactique 1,2 ainsi que d&#39;autres pathologies dont la maladie coronarienne et 3,5 le cancer 3,4. En outre, MCs jouent un rôle important dans l&#39;immunité innée et adaptative, tant en défense de l&#39;hôte contre les bactéries et les parasites et par la suppression de la réponse immunitaire, par exemple induire la tolérance 5,6 allogreffe. MC proviennent de la moelle osseuse, le développement du CD34 + / CD117 + cellules progénitrices pluripotentes 7. Engagé moelle osseuse MC progéniteurs sont libérés dans la circulation sanguine et migrent dans les tissus périphériques de localisation principalement dans les tissus conjonctifs et les surfaces épithéliales 8. Maturation et différenciation terminale sont finalement atteints sous l&#39;influence of cytokines au sein du milieu environnant de 8,9. MCs peuvent être activés par un allergène (antigène, Ag), dont la rencontre entraîné la production d&#39;immunoglobuline E (IgE) de type anticorps. La liaison d&#39;une telle IgE aux récepteurs FceRI de la MC, suivie par une reticulation de cellule IgE liée à une nouvelle exposition à la même Ag, conduit à l&#39;agrégation FceRI et l&#39;initiation d&#39;une cascade de signalisation qui aboutit à la dégranulation cellulaire [commentaire à 10,11] . MCs sont également activés, indépendamment des IgE, par neuropeptides 5,12, les toxines 13, bactérienne et antigènes viraux 14,15, un certain nombre de peptides chargés positivement collectivement dénommées sécrétagogues de base, cellules immunitaires et de cytokines 5,13,12,16 , 17. MCs sont également activés par beaucoup de leurs propres médiateurs libérés, qui amplifient encore la réponse inflammatoire. MCs sont emballés avec des granules sécrétoires (SGS) qui contiennent immunomédiateurs réglementaires, y compris des amines vasoactives telles que l&#39;histamine et de la sérotonine (chez les rongeurs), des protéoglycanes, des proteases telles que la tryptase et la chymase, facteur de croissance vasculaire endothéliale et de plusieurs cytokines et de chimiokines 8,9. Ces médiateurs sont &quot;prêt à aller&quot; et une fois MCs sont activées par un stimulus approprié, ces médiateurs sont libérés des cellules par exocytose régulée (de dégranulation) dans une affaire de secondes à quelques minutes 18,19. Cet événement initial est suivi de la synthèse de novo et la libération d&#39;un large éventail de substances biologiquement puissants, y compris les metabolites de l&#39;acide arachidonique, de multiples cytokines et de chimiokines 20,21,22. Libération de produits nouvellement synthétisés se produit indépendamment de presse SG. Collectivement, ces médiateurs initient précoce et la phase tardive réponses inflammatoires et allergiques. Par conséquent, la compréhension des mécanismes responsables de l&#39;activation et de la dégranulation MC sont deux imp théorique et cliniqueOrtance. La difficulté de manipuler génétiquement MCs primaires et de culture a entravé les tentatives pour élucider les mécanismes sous-jacents MC dégranulation qui sont encore mal résolus. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un dosage à base rapporteur par co-transfection de la lignée cellulaire de la muqueuse de mât, rat leucémie basophiles (RBL) -2H3 (ci-après dénommé RBL) ou de moelle osseuse dérivés MCs (BMMCs) 30 avec un gène d&#39;intérêt et neuropeptide Y (NPY) fusionné à DP monomère (mRFP), en tant que journaliste de SG. NPY a déjà été démontré de récapituler le comportement des marqueurs de SG endogènes dans d&#39;autres systèmes. En outre, parce que mRFP fluorescence est insensible au pH, l&#39;expression de NPY-mRFP permet la visualisation des acides SG ainsi que l&#39;évaluation quantitative de l&#39;exocytose en utilisant des plaques à 96 puits et un lecteur de plaque à fluorescence. Nous avons montré que NPY-mRFP est livré à SGS acides de cellules RBL et BMMCs et est libérée par les cellulesd&#39;une manière réglementée aux côtés de la cargaison de SG endogène (ce est à dire, β-hexosaminidase et la sérotonine) 30, 32. Ce protocole fournit une méthodologie basée imagerie à haute résolution qui permet de criblage de gènes d&#39;intérêt pour leur phénotypique et fonctionnel incidence sur les caractéristiques de SG et la dégranulation dans des cellules RBL 32. Plus précisément, ce protocole permet un suivi en temps réel de MC SG et la quantification de leur zone de volume ou la taille, le nombre, la cinétique de l&#39;assemblage, leur mouvement le long du cytosquelette de la cellule et leur fusion ultime avec la membrane plasmatique dans des conditions différentes. Par exemple, la sensibilisation des cellules avec DNP-IgE spécifique et déclencher les cellules avec un Ag multivalent (DNP de l&#39;albumine de sérum conjugué) sous différentes perturbations (c.-à-knockdown de gènes d&#39;intérêt, sur l&#39;expression de gènes wt ou mutants, ou des manipulations pharmacologiques) et la comparaison aux cellules témoins.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

Mastocytes (MC) sont des cellules sécrétoires du système immunitaire qui accomplissent leurs fonctions physiologiques et pathologiques en libérant des médiateurs allergiques, inflammatoires et immunorégulateurs préformés et nouvellement synthétisés. Les médiateurs de MCs affectent plusieurs tissus et organes aboutissant à des réactions allergiques et immunitaires. La synthèse, le stockage et la libération des médiateurs MC sont très réglementés. Les médiateurs préformés sont emballés dans des granules sécrétoires cytoplasmiques (SG) qui fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu par exocytose régulée. Nous présentons un protocole basé sur la co-expression d&#39;un gène d&#39;intérêt avec un gène rapporteur qui est ciblée pour la GV et est libéré de manière régulée à côté des médiateurs endogènes SG. Le protocole permet haute résolution confocale quatre dimensions analyses de la MC SG et le suivi de leur calendrier de biogenèse d&#39;exocytose déclenché. Ainsi, en utilisant ce protocole pour le dépistage de gènes entreEST pour leur impact phénotypique et fonctionnelle permet de déchiffrer les mécanismes moléculaires qui régissent la biogenèse et l&#39;exocytose de la MC SG et l&#39;identification des organismes de réglementation concernés. Ainsi, de nouvelles informations sur les mécanismes cellulaires qui représentent fonction MCs en matière de santé et de la maladie devraient être fournis.

En raison de la faible efficacité de transfection des MCs, les manipulations génétiques sont peu susceptibles de laisser un impact sur les lectures de la sécrétion moyenne mesurée par SGS médiateurs endogènes. Néanmoins, en établissant la co-expression complète du gène rapporteur NPY-mRFP et le plasmide co-transfecté dans les mêmes cellules, suivi des résultats NPY-RGRF exclusivement dans le suivi de la population de cellules qui exprime le gène d&#39;intérêt. Par conséquent, l&#39;avantage de ce dosa...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

L&#39;objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l&#39;évaluation quantitative de la libération d&#39;un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d&#39;intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K vues.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire. 

Vidéo: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisation non-lytique exocytose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; À partir de macrophages au moyen de Digital microscopie optique

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

La surexpression et la purification de l&#39;être humain<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransférase dans<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Étude de la calcification de la valve aortique par isolement et culture de lymphocytes T à l’aide de cellules nourricières de Buffy Coat irradié

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

Immunofluorescence à double marquage à l’aide d’anticorps de la même espèce pour étudier les interactions hôte-pathogène

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.