LMW et RHK sont pris en charge par la Graduate School UMaine des sciences et de génie (GSBSE) biomédical; RHK a également été soutenue par le Maine Agricultural Experiment Station &amp; Forêt. Un financement supplémentaire a été fourni par l&#39;Institut national des sciences médicales générales (NIH P20-GM103423), le Maine et agricole Experiment Station Forest (Nombre Grant ME08004-10, JAG), l&#39;Université du Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF Grant # 1008498) , et un démarreur de subventions de recherche en pharmacologie / toxicologie de la fondation PhRMA (JAG). Nous remercions les Drs. David Holowka et Barbara Baird pour l&#39;antigène et les cellules. Nous sommes reconnaissants envers Hina Hashmi, Alejandro Velez, et Andrew Abovian de l&#39;aide avec l&#39;équipement et les commandes. C&#39;est Maine agricole et forestier Experiment Station numéro de publication 3311.

Nous n&#39;avons rien à révéler.

En 2004, Naal et al. 1 développé un biocapteur des mastocytes de test à haut débit de la dégranulation. Il s&#39;agit d&#39;un test robuste que nous avons adapté à nos études TCS et détaillées dans cette vidéo. Avant la Naal et al. 1 essai, la dégranulation des mastocytes a été évaluée régulièrement par β-hexosaminidase 59-61, mais ces premières méthodes utilisées fluoromètres dont un échantillon a été lue à la fois. Surtout, Naal et al. concordance direc...

Les mastocytes sont très granulé cellules immunitaires effectrices qui servent de médiateurs clés dans l&#39;asthme, les allergies, parasite de la défense et la carcinogenèse 13-16. Ils résident dans presque tous les tissus vascularisés 15, où ils stockent en toute sécurité médiateurs inflammatoires et allergiques dans les granules cytoplasmiques avant d&#39;être activée à dégranuler. Dégranulation est l&#39;exocytose des granules liés à la membrane, ce qui entraîne la libération de médiateurs pharmacologiquement actives telles que l&#39;histamine, la tryptase, et leucotriènes 15. Ce procédé conduit à l&#39;initiation de type I des réactions d&#39;hypersensibilité qui sont essentiels à la défense de montage contre les parasites ainsi que le lancement des réactions allergiques, asthmatiques, et cancérigène 15. Les mastocytes et les basophiles expriment des récepteurs FceRI, les récepteurs de haute affinité pour les immunoglobulines E (IgE) 17. L&#39;exposition à un allergène ou antigène provoque l&#39;agrégation de multiples récepteurs FceRI IgE liés 17, et c&#39;est ce so-disant «réticulation» de récepteurs Fc des IgE liés qui déclenche le processus de dégranulation: une cascade d&#39;événements tyrosine phosphorylation, l&#39;activation de la phospholipase C, flux de calcium dans les magasins internes, et l&#39;afflux de calcium dans la cellule 18. Cet afflux de calcium est nécessaire à la dégranulation, et, en outre, les signaux de fusion des granules avec la membrane avant de provoquer l&#39;exocytose des granules 15. Expérimentalement, un ionophore du calcium peuvent être utilisés pour faire la navette calcium directement à travers la membrane de la cellule 19, ce qui évite pratiquement tout transduction du signal étapes avant l&#39;étape de l&#39;influx de calcium 20, permettant l&#39;identification d&#39;une cible de la voie par un produit toxique comme étant en amont ou en aval de signalisation de calcium 20. Dégranulation peut être mesuré rapidement et efficacement en surveillant la libération de β-hexosaminidase dans un surnageant de cellules, qui est libéré à partir des granulés linéairement le long d&#39;histamine 6, mais is beaucoup plus facile à détecter à l&#39;aide d&#39;une simple réaction enzyme-substrat, et un lecteur de microplaque pour doser le produit fluorescent. Ce dosage en microplaque, tel que décrit dans la section du protocole, est basée sur une méthode robuste développé à l&#39;origine par Naal et al. 1, qui quantifie le clivage du substrat fluorogénique 4-méthylumbelliféryl-N-acétyl-β-D-glucosaminide par β- hexosaminidase. Nous avons modifié l&#39;analyse des effets des essais de médicaments et de substances toxiques, avec triclosan a mis en évidence ici. Cette méthode quantifie de manière fiable la dégranulation, est une alternative peu coûteuse pour, par exemple, les méthodes de détection par cytométrie en flux offre 21, et a le potentiel pour se prêter gentiment de criblage à haut débit d&#39;une grande variété de médicaments anti-allergiques, ainsi que immunotoxiques ou de produits chimiques allergènes. Ce dernier point est particulièrement important à la lumière du rapport de 2007 du Conseil national de recherches &quot;Tests de toxicité au 21ème siècle: une vision et une Stratgie &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), qui milite pour le développement de tests de toxicologie à haut débit qui utilisent la culture cellulaire pour réduire l&#39;utilisation coûteuse des animaux de laboratoire traditionnels tels que la souris. Le protocole mis au point par la dégranulation Naal et al. 1 et modifié par nous 2, utilise la lignée de cellules RBL-2H3 qui est un modèle bien accepté homologue à mastocytes des muqueuses de l&#39;homme ou des basophiles 5.3. (Méthodes de culture de cellules RBL-2H3 sont détaillés dans Hutchinson et al. 22). Ce test pourrait probablement être adapté à tout type de mastocytes ci-joint. Triclosan (TCS) est un antimicrobien à large spectre qui a été utilisé pendant plus de 30 ans dans les hôpitaux, les produits de soins personnels et des biens de consommation 23,24. Le mode d&#39;action pour caractéristique antimicrobienne de TCS est l&#39;inhibition de la biosynthèse des acides gras, probablement en inhibant énoyl-acylréductase protéine porteuse 25,26. Il se trouve dans le monde entier dans une vaste gamme de produits de consommation tels que gel douche, lotion pour les mains, dentifrice, rince-bouche, et savons pour les mains à des concentrations allant jusqu&#39;à 0,3% ou de 10 mm 24. L&#39;utilisation généralisée du TCS a donné lieu à des niveaux détectables chez l&#39;homme et 27-29 dans les rivières et les ruisseaux 30. Une étude réalisée par Allmyr et al. 27 a démontré que TCS et ses métabolites sont présents à la fois dans le plasma et le lait des mères qui allaitent. Surtout, TCS est facilement absorbé par la peau 31-37. Queckenberg et al. 37 ont trouvé ~ absorption de 10% d&#39;une ~ 70 mM crème TCS dans la peau de l&#39;homme dans les 12 heures, aboutissant à une concentration significative dans la peau, où les mastocytes résident. TCS a été cliniquement prouvé pour gérer la maladie allergique de la peau humaine 7-11, mais le mécanisme par lequel TCS soulage les maladies allergiques de la peau a été inconnue 38. Utilisation de la detaile de dosage en microplaque fluorescentd Dans cette vidéo, nous avons récemment démontré que TCS, à des concentrations aussi faibles que 2 pm, atténue considérablement la fonction des mastocytes et la dégranulation, fournissant une explication possible de ces données cliniques 2. En plus de fournir une explication à ces données cliniques, nos résultats à Palmer et al. 2 suggèrent que TCS vise molécules de signalisation en aval de l&#39;afflux de calcium. En raison de l&#39;importance de la signalisation dans de nombreux immunologique et d&#39;autres processus biologiques calcium, TCS pourrait avoir des effets négatifs sur une grande variété de processus biologiques nécessaires. En fait, Udoji et al. 39 a montré que TCS supprime l&#39;activité des cellules tueuses naturelles humain lytique, une autre fonction immunitaire innée importante. Au-delà de son potentiel comme une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau (ou, au contraire, comme un immunotoxique), TCS peut aussi être un perturbateur endocrinien 40-49. Ainsi, une procédure claire sur la façon de préparer ce produit chimique en solution is d&#39;intérêt pour les toxicologues. Parce que TCS est une petite molécule hydrophobe, les véhicules organiques sont souvent utilisés pour le rendre plus soluble dans l&#39;eau. Dans la plupart des études de toxicité où TCS a été testé, la préparation a impliqué dissolution dans l&#39;eau à l&#39;aide d&#39;un solvant organique tel que l&#39;éthanol, l&#39;acétone, ou de l&#39;huile 2,50,51. Toutefois, il arrive souvent ces solvants sont biologiquement actifs eux-mêmes, ce qui complique l&#39;interprétation de la substance d&#39;essai données 51. En fait, selon Rufli et al. 52 et 53 autres, il est recommandé que des solutions de test pour les expériences de toxicité aquatique sont préparés en utilisant des méthodes physiques par rapport aux méthodes chimiques, en raison du potentiel de solvants chimiques pour créer des artefacts de toxicité. Nous avons précédemment montré que TCS dissous dans 0,24% éthanol / eau (vol / vol) et traitée aux ultrasons pendant 30 min amortit RBL dégranulation des mastocytes 2. L&#39;éthanol à des concentrations supérieures à 0,24% a été montré pour freiner la dégradation des mastocytesnulation 54,55-exemples des effets potentiellement confondants de solvants organiques sur les études de toxicité. Non seulement il est important de considérer l&#39;effet de solvants sur l&#39;organisme ou de cellules utilisées pour l&#39;étude, mais il est aussi important de surveiller l&#39;effet d&#39;un solvant sur le produit chimique d&#39;essai lui-même. Par exemple, Skaare et al. 51 ont constaté que la dissolution de TCS en polyéthylène glycol (on trouve couramment dans les dentifrices et les rince-bouche) affaibli effets anti-bactériennes et anti-plaque chez les femmes femelles en bonne santé tout en dissolution dans les huiles causé une perte complète de la fonction. Par conséquent, la capacité des différents solvants pour moduler toxiques et de drogues, y compris TCS, les effets doivent être pris en compte dans la conception des essais. L&#39;utilisation des huiles ou des additifs de saveur peut interférer avec les effets de TCS dans divers produits 50,51. Dans un effort pour éliminer la nécessité d&#39;utiliser des solvants organiques, nous avons amélioré notre méthode pour dissoudre TCS 2 en éliminant l&#39;utilisation d&#39;un sol organiquedéfouler. Dans le présent protocole, on dissout granules TCS directement dans le tampon aqueux à chaleur (≤ 50 ° C), puis vérifiez la concentration de ce stock TCS par spectrophotométrie UV-Vis. Ces améliorations sont possibles parce que TCS est soluble dans l&#39;eau jusqu&#39;à 40 pm ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) et a été montré pour résister à la dégradation lorsqu&#39;il est chauffé à 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Nous avons également l&#39;avantage supplémentaire de la spectrophotométrie UV-Vis, comme TCS est également connu pour absorber fortement à 280 nm 58 avec un coefficient d&#39;extinction molaire de 4,200 L / mol / cm 12. Ce protocole fournit un moyen simple, mais efficace pour dissoudre granules TCS dans un tampon sans l&#39;aide d&#39;un solvant organique, notamment le faible coût et la vérification rapidede la concentration, et décrit un dosage de la microplaque fluorescente puissant pour surveiller les effets chimiques sur la dégranulation des mastocytes.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Les mastocytes jouent un rôle important dans la maladie allergique et de défense immunitaire contre les parasites. Une fois activé (par exemple, par un allergène), ils dégranulent, un processus qui aboutit à l&#39;exocytose des médiateurs de l&#39;allergie. Modulation de la dégranulation des mastocytes par les drogues et les substances toxiques peuvent avoir des effets positifs ou négatifs sur la santé humaine. Fonction des mastocytes a été disséqué en détail l&#39;utilisation des mastocytes de leucémie basophiles de rat (RBL-2H3), un modèle largement accepté de mastocytes des muqueuses de l&#39;homme 3-5. Mât composant de cellules granulaires et le médiateur allergique β-hexosaminidase, qui est libéré linéairement parallèlement à l&#39;histamine à partir de mastocytes 6, peuvent facilement et de façon fiable être mesurées par réaction avec un substrat fluorogène, ce qui donne l&#39;intensité de fluorescence mesurable dans un essai de micro-plaque qui se prête à études à haut débit 1. Initialement publié par Naal et al. 1, nous avons adapté ce test de dégranulation pour le dépistage oles médicaments et les substances toxiques F et démontrer son utilité ici. Le triclosan est un agent antibactérien à large spectre qui est présent dans de nombreux produits de consommation et a été trouvé pour être une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau humaine 7-11, bien que le mécanisme de cet effet est inconnue. Ici, nous démontrons une analyse de l&#39;effet du triclosan sur la dégranulation des mastocytes. Nous avons récemment montré que le triclosan affecte fortement la fonction des cellules de mât 2. Dans un effort pour éviter l&#39;utilisation d&#39;un solvant organique, le triclosan est dissous directement dans un tampon aqueux avec la chaleur et l&#39;agitation, et la concentration résultante est confirmée par spectrophotométrie UV-Vis (avec ε = 4,200 280 L / M / cm) 12. Ce protocole a le potentiel pour être utilisé avec une variété de produits chimiques afin de déterminer leurs effets sur la dégranulation des mastocytes, et plus largement, leur potentiel allergique.

Lorsqu&#39;il est chauffé à 50 ° C pendant 90 min, le spectre d&#39;absorption UV-Vis pour TCS produit une forte courbe lisse entre ~ 260 et 300 nm, avec un pic à 280 nm, comme le montre la figure 1. Spectrophotométrie UV-Vis est donc un outil important qui peut être utilisé pour calculer la concentration, puisque le coefficient d&#39;absorption molaire publié à 280 nm est 4,200 L / mol / cm 12. Nous avons constaté que TCS ne tombe pas de solution au cours de la période de toute l&#39;expérience de d?...

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A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Dégranulation des mastocytes, la libération de médiateurs de l&#39;allergie, est important dans les allergies, l&#39;asthme et la défense parasite. Ici, nous démontrons techniques 1 pour évaluer les effets des médicaments et des substances toxiques sur la dégranulation, la méthodologie utilisée récemment pour exposer l&#39;effet inhibiteur puissant agent antibactérien triclosan de 2.

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K vues.  University of Maine, Orono.  Dégranulation des mastocytes, la libération de médiateurs de l'allergie, est important dans les allergies, l'asthme et la défense parasite. Ici, nous démontrons techniques 1 pour évaluer les effets des médicaments et des substances toxiques sur la dégranulation, la méthodologie utilisée récemment pour exposer l'effet inhibiteur puissant agent antibactérien triclosan de 2. 

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

Mesure des effets sur la fonction cellulaire anticorps de cardiomyocytes isolés

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Recherche

Immunologie et infection

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

La mise en œuvre d&#39;un système d&#39;infection à base Insertion Perméable Membrane pour étudier les effets de sécrétées bactériennes Toxines sur des cellules hôtes mammaliennes

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Cytométrie en flux Analyse de la particule liée Bet v 1 Allergène en PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Effets de l’exposition de formaldéhyde à un modèle de Rat de la dermatite atopique induite par le traitement néonatale capsaïcine

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...