We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).

NOTE: Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont été approuvés par le comité de bioéthique de l&#39;École de médecine Lariboisière, Paris, France (CEEALV / 2011-08-01). 1. Instrument Préparation <ol><li> Préparer et nettoyer les instruments suivants pour l&#39;insertion du cathéter: micro-pinces, des ciseaux, des micro-micro-vasculaire, pince grands ciseaux, fils chirurgicaux (noir tressé de soie 4-0) et un cathéter 14 G. Hépariner le cathéter avec une solution d&#39;héparine (5000 U / ml). </li><li> Préparer et nettoyer les instruments suivants pour la laminectomie: grands ciseaux, scalpel et d&#39;un coupe-os. Effectuer laminectomie avec un coupe-os-mesure visant à réduire le risque de nuire à la moelle épinière au cours de la laminectomie (Figure 1). </li><li> Mise en place du cadre 3D utilisé pour le positionnement et la stabilisation de l&#39;animal. Le cadre fait sur mesure est construit avec les éléments d&#39;un fixateur externe Hoffman 3 en association avec forceps, which ont été courbé afin d&#39;adapter la colonne lombaire de l&#39;animal. </li><li> Préparez l&#39;appareil à chute de poids (impacteur) utilisé pour la moelle épinière des blessures biomécanique. REMARQUE: Le dispositif d&#39;impaction sur mesure a été conçu avec un logiciel 3D et imprimé en 3D. </li><li> Mettez la machine à ultrasons. </li><li> Préparation du kit pour la reconstitution de l&#39;agent de contraste. NOTE: Le kit comprend 1 flacon contenant 25 mg de poudre lyophilisée, la seringue pré-remplie 1 contenant 5 ml de chlorure de sodium et un système de transfert mini-pic (Figure 2). Les étapes pour la reconstitution de l&#39;agent de contraste sont détaillées ci-dessous (dans la section 5). </li></ol> 2. Veine jugulaire cathétérisme (Figure 3) <ol><li> Anesthésier l&#39;animal avec 4% d&#39;isoflurane. Placez l&#39;animal en position couchée. Confirmez anesthésie appropriée en veillant à ce que l&#39;animal ne répond pas lorsque les pattes sont pincées avec une pince. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis under anesthésie. </li><li> Rasez le cou et nettoyer la peau. Faire une incision sur la ligne médiane du cou. Rétracter le muscle sternocleidomastoidian afin de trouver la veine jugulaire interne. Serrer une ligature à la partie rostrale de la veine. </li><li> Appliquer une pince microvasculaire sur la veine, 1 cm en dessous de la ligature. Passez un autre thread autour de la veine, juste en dessous de la pince avec le noeud prêt à être serrés lorsque la pince est libéré. </li><li> Ouvrez la paroi de la veine (veinotomie) entre la pince et la ligature rostrale. Introduire un cathéter 14 G dans la lumière de la veine et le pousser vers le cœur. </li><li> Quand il se heurte à la pince, libérer ce dernier et pousser le cathéter plus loin. Fixez le cathéter dans la veine, en serrant fermement le noeud sur la veine avec le cathéter à l&#39;intérieur. </li><li> Évaluer la perméabilité du cathéter en retirant une petite quantité de sang veineux dans le cathéter et par la suite puis rinçage avec une solution saline héparinée. Cela empêche l&#39;obstruction de la catheter par un caillot de sang potentiel. </li><li> Connectez tube flexible au cathéter pour injection supplémentaire d&#39;agent de contraste (microbulles). Garder fermée (scellée) avant d&#39;être prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Accès à la colonne vertébrale, laminectomie et Rat de positionnement (dans le cadre de la 3D) <ol><li> Placez l&#39;animal dans une position horizontale sujettes plat. Rasage et nettoyer le dos (région thoracique) de l&#39;animal. </li><li> Identifier la dernière côte (XIIIe chez le rat) par palpation (Figure 4). Ceci permet d&#39;estimer la position de la vertèbre thoracique XIII (ThXIII). </li><li> Faire un 4 cm incision de la peau sur la ligne médiane, centrée sur ThXIII. Ouvrez l&#39;incision de la peau ainsi que la bourse sous-jacent. Observez l&#39;aponévrose des muscles du dos ainsi que les conseils des processus de colonne vertébrale. </li><li> Localiser attentivement le processus de la colonne vertébrale de ThXIII en palpant les nervures de XIIIe. NOTE: La nervure XIIIe est connecté à ThXIII et représente donc un outil facile à locarepère anatomique te pour l&#39;identification des ThXIII. Cette étape permet la localisation de l&#39;ThXII à THIX apophyse épineuse ainsi que L1 et L2 (première et deuxième vertèbres lombaires). </li><li> Couper l&#39;aponévrose musculaire et détacher les muscles de chaque côté pour exposer les apophyses épineuses, les lames et les joints de facette de THIX à L2. Exposer les aspects latéraux de L1 et L2 en détachant les muscles des apophyses transverses. </li><li> Accrocher les incisives de l&#39;animal sur le 3D-cadre pour fixer la position (Figure 5). Fixer les vertèbres L1 et L2 avec la pince modifiés. Branchez la pince modifiées au-cadre 3D afin de stabiliser l&#39;animal. </li><li> Tirez doucement caudale la pince de fixation du rachis lombaire afin de resserrer l&#39;ensemble colonne vertébrale et d&#39;élever le thorax du banc. NOTE: Avec l&#39;agencement décrit l&#39;animal doit être capable de respirer. En outre, malgré les mouvements respiratoires de la cage thoracique, la colonne vertébrale et de la moellecordon devrait également rester immobile. </li><li> Retirez le processess épineuse de THIX à ThXII. Insérez délicatement la lame inférieure de la coupe de l&#39;os sous la lame gauche de ThXII puis fermez la coupe osseuse afin de couper la lame (Figure 6). </li><li> Répéter la même manœuvre pour la lame droite et retirer successivement l&#39;arc postérieur. Répétez les étapes précédentes pour la vertèbres ThXI à THIX afin de parvenir à une laminectomie à quatre niveaux. Retirez les deux joints de facette pour chaque vertèbre. REMARQUE: Tout au long de la procédure, nettoyer le champ opératoire d&#39;une hémorragie locale. Pour cela, utilisez des tampons de coton et de l&#39;irrigation avec une solution saline tiède. Hémostase se produit systématiquement quelques minutes. </li></ol> 4. CEU Probe Positionnement <ol><li> Couvrir la dure-mère avec un gel à ultrasons. Ceci permet une transmission efficace des ondes ultrasonores entre la sonde et la moelle épinière (figure 7). </li><li> Stabiliser l&#39;esprit de la sonde à ultrasonsha pince qui peut être connecté par la suite à la trame 3D par un bras articulé. Positionner manuellement la sonde. Assurez-vous que la sonde est orienté pour obtenir une coupe sagittale longitudinale oblique. En position correcte, la moelle épinière est strictement horizontal sur l&#39;image et le canal central de la moelle épinière est visible le long du segment complet de la moelle épinière. NOTE: Positionnement devrait être guidée par l&#39;image en temps réel en mode B affichée sur l&#39;écran de la machine à ultrasons. La distance focale de la sonde à ultrasons doit être aligné avec le canal central de la moelle épinière. A ce moment, la face postérieure de la moelle épinière est accessible ce qui en fin de compte pour permettre le positionnement de l&#39;élément de frappe. </li><li> Lorsque optimale, bloquer le bras articulé pour stabiliser la position. </li></ol> 5. Préparation de l&#39;agent de contraste - Reconstitution de microbulles <ol><li> En utilisant le contenu d&#39;un kit de reconstitution commerciale et connecter la tige de piston en l&#39;attachant tightly dans la seringue (sens horaire). Ouvrez le blister du système de transfert et enlever le capuchon de la seringue. Ouvrez le bouchon du système de transfert et connecter la seringue pour le système de transfert (fixer hermétiquement). </li><li> Retirez le disque de protection du flacon. Faites glisser le flacon dans le manchon transparent du </li><li> système de transfert et appuyez fermement pour verrouiller le flacon en place. </li><li> Vider le contenu de la seringue dans le flacon en poussant sur la tige de piston. Agiter vigoureusement pendant 20 secondes pour mélanger tous les contenus dans le flacon pour obtenir un liquide homogène d&#39;un blanc laiteux. </li><li> Retourner le système et retirer soigneusement l&#39;agent de contraste dans la seringue. Dévissez la seringue du système de transfert. Après reconstitution (comme indiqué), 1 ml de la dispersion obtenue contient de 8 pi de l&#39;hexafluorure de soufre dans les microbulles. Dessinez la suspension de microbulles dans une seringue de 100 ml. Insérez le 100 ml seringue dans la pompe électrique. Fermez le couvercle. </li><li> Lancer une agitation constante de la rémicrobulles constitué. Obtenu sous agitation constante par rotation lente de la seringue, qui maintient la suspension de microbulles. Brancher la pompe au cathéter jugulaire à travers le tube flexible. Régler la machine à ultrasons pour &quot;mode harmonique&quot;. REMARQUE: Cette dernière correspond à la manière dont les microbulles peuvent être spécifiquement détectées et visualisées. Ce mode a un faible indice mécanique, qui ne détruit pas les micro-bulles par rapport à la B-mode. </li><li> Purger le cathéter de perfusion de la première dose (400 pi) de l&#39;agent de contraste. Au cours de cette première perfusion, vérifier que les microbulles ne apparaissent sur l&#39;écran de l&#39;échographie. Ceci confirme que l&#39;ensemble du circuit (à partir de la seringue à la circulation sanguine du rat) est intacte et ouverte. </li><li> Réglez l&#39;appareil à ultrasons à &quot;mode B&quot; pour visualiser le parenchyme de la moelle épinière et la destruction de ces microbulles restant dans la circulation sanguine. La fréquence élevée de la «B-Mode&quot; tranhaute énergie smits les microbulles, qui leur permet de panne. </li><li> Laissez l&#39;animal était encore environ 30 min. Cette période permet la stabilisation des paramètres hémodynamiques. </li></ol> 6. Évaluation du SCBF dans la moelle épinière Intact <ol><li> Régler la machine à ultrasons pour le mode &quot;Harmonic&quot;. Lancer la fois (1) la perfusion d&#39;agent de contraste (400 ul) et (2) le chronomètre. Remarque: Au cours de la perfusion, la concentration de microbulles dans la circulation sanguine doit augmenter, ce qui permet l&#39;imagination de contraste de la moelle épinière (figure 8). Etant donné que les microbulles sont rapidement détruites, la concentration sanguine de microbulles commence à diminuer dès que l&#39;injection est terminée ce qui génère une diminution progressive de contraste visualisation de la moelle épinière. </li><li> Après le bouton &quot;Clip Store&quot; sur la machine à ultrasons 1 min, sélectionnez (de presse). Cela permettra un pour sauver 1 min de raw données de l&#39;échographie et l&#39;enregistrement vidéo d&#39;imagerie (qui a été précédemment affiché sur l&#39;écran de l&#39;échographie). </li><li> Régler la machine à ultrasons pour &quot;B-Mode&quot;. Cela permettra d&#39;éliminer les microbulles restants. </li></ol> 7. expérimentale SCI <ol><li> Utilisation du micromanipulateur relié à la trame 3D, positionner le dispositif de l&#39;impaction de poids-goutte de sorte que la pointe de l&#39;impacteur entre en contact avec la dure-mère (sur la ligne médiane de la moelle épinière), à la jonction entre THX et ThXI (Figure 9) . Remarque: Ce niveau doit correspondre au milieu du segment de la moelle épinière observée avec le dispositif à ultrasons. Le percuteur et le corps de l&#39;élément de frappe sont de 8 mm de diamètre. La pointe de l&#39;impacteur, qui va générer la blessure, est de 3 mm de diamètre. </li><li> Placez la baguette du dispositif de l&#39;impaction à une position de 10 cm de haut. Induire la SCI expérimentale en libérant l&#39;attaquant du dispositif de l&#39;impaction. L&#39;attaquant tombe et libère ee impacteur, blessant la moelle épinière. L&#39;impaction sur mesure offre un impact équivalent à un poids de 10 g tombant d&#39;une hauteur de 10 cm. </li></ol> 8. Évaluation des SCBF 5 min post-SCI <ol><li> Répétez les étapes décrites dans la section 6 (Évaluation des SCBF). Les microbulles seront incapables de passer à travers la microvascularisation endommagé et l&#39;épicentre de blessure restera sombre (Figure 10). </li></ol> 9. Sacrifice d&#39;Animaux <ol><li> Euthanasier l&#39;animal avec une injection intraperitoneale létale de pentobarbital (100 mg). </li></ol> 10. Quantification des SCBF par Analyse Offline <ol><li> Démarrez le logiciel Ultra-Extend utilisée pour la quantification (sur machine à ultrasons). Sélectionnez &quot;Fichier&quot; puis sélectionnez les données brutes préalablement enregistrés et ouvrir les fichiers associés. Activez le mode «quantification» en appuyant sur ​​le bouton &quot;Chi Q&quot; (sélection). Select &quot;Set ROI&quot; (bouton) et de choisir la forme circulaire. </li><li> Sélectionnez &quot;Dessiner ROI&quot; (bouton) et d&#39;en tirer sept régions adjacentes circulaires d&#39;intérêt (ROI) sur la moelle épinière (Figure 11). Ouvrez le menu &quot;Montage&quot; et choisissez la &quot;valeur de la courbe&quot; de fonction. Observez le logiciel affichant plusieurs courbes, correspondant chacun à des changements de concentration de microbulles l&#39;intérieur d&#39;un retour sur investissement. NOTE: Chaque courbe a une &quot;perfusion deperfusion&quot; profil. La première phase de la courbe est plate et correspond à la période avant l&#39;arrivée des microbulles. Dans la deuxième phase, la concentration de microbulles augmente rapidement par suite de la perfusion. Dans la troisième phase, qui commence lorsque la perfusion est terminée, la concentration de microbulles diminue progressivement car ils disintegratse dans la circulation sanguine. </li><li> Placer la première ligne verticale au début de la deuxième phase de la cUrve et sélectionnez «SET». Ceci indique au logiciel où commencer analyse. </li><li> Placez la deuxième ligne verticale à la fin de l&#39;enregistrement et sélectionnez à nouveau &quot;SET&quot;. Ceci indique au logiciel où pour arrêter analyse. </li><li> Regardez le menu «Cv» et enregistrer la valeur &quot;AUC&quot;, qui correspond à la &quot;aire sous la courbe&quot; analysé. Cette valeur est proportionnelle à la SCBF à l&#39;intérieur de la ROI correspondant. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial conflict of interest. The ultrasound machine was graciously lent by the Toshiba France company. The Vueject pump was graciously lent by the Bracco France company.

Bien que nous avons décrit comment utiliser CEU chez un rat SCI modèle de contusion, ce protocole peut être modifié pour tenir d&#39;autres objectifs expérimentaux ou modèles SCI. Nous avons choisi de mesurer SCBF à seulement deux points dans le temps (avant la lésion et 15 min post-SCI), mais le nombre de points dans le temps et le retard entre les mesures de SCBF peuvent être adaptés pour répondre aux besoins d&#39;autres études. Par exemple, dans notre travail précédent 17, nous avons mesuré...

Lésion de la moelle épinière (SCI) est une maladie dévastatrice qui conduit à une altération significative du moteur, sensoriel et les fonctions autonomes. À ce jour, aucun traitement a démontré son efficacité chez les patients. Pour cette raison, il est important d&#39;identifier de nouvelles techniques qui permettront d&#39;améliorer l&#39;évaluation des traitements potentiels et peut encore élucider blessures pathiophysiology 1. SCI est divisé en deux phases successives, dénommé blessures primaires et secondaires. La blessure primaire correspond à l&#39;insulte mécanique initiale. Alors que les groupes de blessures secondaires une cascade d&#39;événements biologiques différents (tels que l&#39;inflammation, le stress oxydatif et l&#39;hypoxie) qui contribuent à la suite de l&#39;expansion progressive de la lésion initiale, des lésions tissulaires et donc le déficit neurologique 2,3. A la phase aiguë de la SCI, thérapies neuroprotectrices visent à réduire la pathologie de la lésion secondaire et should conséquence d&#39;améliorer les résultats neurologiques. Parmi les nombreux événements de blessures secondaires, l&#39;ischémie joue un rôle essentiel de 4,5. Au niveau de l&#39;épicentre SCI, les microvaisseaux du parenchyme endommagés entravent le flux sanguin de la moelle épinière efficaces (FERC). En outre, SCBF est également significativement réduite dans la région entourant l&#39;épicentre de blessure, une zone spécifiquement connu comme la «zone de pénombre ischémique». Si SCBF ne peut pas être rapidement rétablie dans ces régions, l&#39;ischémie peut conduire à une nécrose parenchymateuse supplémentaires et des dommages aux tissus plus nerveux. Comme même la préservation des tissus moindre peut avoir des effets importants de la fonction, il est d&#39;un intérêt majeur pour développer des médicaments et des thérapies qui peuvent réduire l&#39;ischémie post-SCI. Pour mettre en évidence ce phénomène, travaux antérieurs ont montré que la préservation de seulement 10% des axones myélinisés était suffisant pour permettre la marche chez les chats post-SCI 6. Bien que plusieurs techniques ont été décrites pour évaluer SCBF, lay ont tous des limitations importantes. Par exemple, l&#39;utilisation de microsphères radioactives 7,8 et C14-iodopyrine autoradiographie 9 nécessite ultérieure sacrifice animal et ne peut être répétée à plus tard points de temps. La technique de dégagement d&#39;hydrogène 10 dépend de l&#39;insertion d&#39;électrodes intraspinales, qui peut en outre endommager la moelle épinière. Alors que l&#39;imagerie laser Doppler, photopléthysmographie 14,15 et in vivo microscopie optique 16 ont une profondeur / zone très limitée de la mesure 11-13. Notre équipe a déjà montré que contraste amélioré ultrasons (CEU) imagerie peut être utilisée pour évaluer en temps réel et in vivo les changements de SCBF dans le parenchyme rat de la moelle épinière 17. Il est important de noter que une technique similaire a été appliquée par Huang et al., Dans un modèle porcin de 18 SCI. CEU applique un mode spécifique d&#39;imagerie par ultrasons qui permet d&#39;associer im morphologique niveaux de grisâges (obtenus par le mode B classique) avec la distribution spatiale du flux sanguin 19. L&#39;imagerie de SCBF et la quantification repose sur l&#39;injection intravasculaire de produits de contraste pour échographie. L&#39;agent de contraste est constitué de microbulles d&#39;hexafluorure de soufre (de diamètre moyen d&#39;environ 2,5 pm et 90% d&#39;un diamètre inférieur à 6 pm) stabilisées par des phospholipides. Les microbulles reflètent le faisceau d&#39;ultrasons émis par la sonde améliorant ainsi l&#39;échogénicité de sang et augmentant le contraste des tissus en fonction de leur flux sanguin. Il est donc possible d&#39;évaluer le débit sanguin dans une région d&#39;intérêt donnée fonction de l&#39;intensité du signal réfléchi. Les microbulles sont également sans danger et elles ont été appliquées cliniquement chez l&#39;homme. L&#39;hexafluorure de soufre est rapidement effacé (la demi-vie terminale est de 12 min) et plus de 80% de l&#39;hexafluorure de soufre administrée sont retrouvés dans l&#39;air expiré dans les 2 minutes après l&#39;injection. Ce protocole fournit un moyen simple d&#39;utiliser CEU imvieillissement à évaluer les changements SCBF chez le rat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">External Fixator Hoffman 3</td>
			<td style="width:229px;">Stryker, Kalamazoo, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Toshiba Applio</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound machine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Sonovue</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Contrast agent : microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Vueject pump</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Electric pump for infusion of microbubbles bolus</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Aquasonic Ultrasound Gel</td>
			<td style="width:229px;">Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Isovet</td>
			<td style="width:229px;">Piramal Healthcare, Mumbai, India</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Isoflurane used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Ultra Extend</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Software used for quantification of spinal cord blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6</td>
			<td style="width:229px;">Canadian Tire, Toronto, Canada</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Set of pliers for Do-it-yourself job</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast enhanced ultrasound imaging for assessment of spinal cord blood flow in experimental spinal cord injury

Réduction du flux sanguin de la moelle épinière (SCBF) (c.-à-ischémie) joue un rôle clé dans une lésion traumatique de la moelle épinière (SCI) pathophysiologie et est donc une cible importante pour les thérapies neuroprotectrices. Bien que plusieurs techniques ont été décrites pour évaluer SCBF, ils ont tous des limitations importantes. Pour surmonter ce dernier, nous proposons l&#39;utilisation du temps réel contraste amélioré échographie (CEU). Ici, nous décrivons l&#39;application de cette technique dans un modèle de contusion de rat de SCI. Un cathéter jugulaire est d&#39;abord implanté pour l&#39;injection répétée d&#39;agent de contraste, une solution de chlorure de sodium de l&#39;hexafluorure de soufre microbulles encapsulées. La colonne vertébrale est alors stabilisé avec un 3D-cadre sur mesure et de la moelle épinière dure-mère est exposée par une laminectomie au THIX-ThXII. La sonde à ultrasons est ensuite positionné à la partie postérieure de la dure-mère (revêtue de gel d&#39;ultrasons). Pour évaluer SCBF base, une seule injection intraveineuse (400 pi) de contrest agent est appliqué pour enregistrer son passage dans le système microvasculaire de la moelle épinière intacte. Un dispositif à chute de poids est ensuite utilisé pour générer un modèle de contusion expérimentale reproductible de SCI. agent de contraste est ré-injecté 15 minutes après la blessure pour évaluer les changements post-SCI SCBF. CEU permet en temps réel et in vivo évaluation des changements de SCBF suivante SCI. Chez l&#39;animal indemne, échographie a montré le flux sanguin inégale le long de la moelle épinière intacte. En outre, 15 min post-SCI, il y avait ischémie critique au niveau de l&#39;épicentre tandis SCBF resté conservé dans les zones les plus reculées intacte. Dans les régions voisines de l&#39;épicentre (à la fois rostrale et caudale), SCBF a été significativement réduite. Cela correspond à la «zone de pénombre ischémique» décrit précédemment. Cet outil est d&#39;un intérêt majeur pour évaluer les effets des thérapies visant à limiter l&#39;ischémie et la nécrose tissulaire résultant à la suite de SCI.

Avec le protocole décrit ci-dessus, il est possible de mapper le SCBF le long d&#39;un segment de la moelle épinière sagittal longitudinal. Dans la moelle épinière intacte, il semble y avoir des irrégularités de SCBF au sein du parenchyme (Figure 12). Ceci peut être expliqué par la répartition variable des artères radiculo-médullaire (RMA) d&#39;un animal à l&#39;autre. RMA se réfère à segmentaire artères qui atteignent l&#39;artère spinale antérieure (ASA...

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Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Contraste échographie amélioré pour l&#39;évaluation de la moelle épinière flux sanguin dans la partie expérimentale Traumatisme médullaire

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K vues.  Faculté de Médecine Paris Diderot Paris VII, U942. Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

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Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Aiguë et chronique Test tactile sensorielle après un traumatisme médullaire chez le rat

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Recherche

Médecine

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

Un modèle de contusion de graves lésions de la moelle épinière chez les rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination is disrupted by spinal cord injury (SCI), control of respiratory muscles innervated below the injury level is compromised1,2 leading to respiratory muscle dysfunction and pulmonary complications. These conditions are among the leading causes of death in patients with SCI3. Standard pulmonary function tests that assess respiratory motor function include spirometrical and maximum airway pressure outcomes: Forced Vital Capacity (FVC), Forced Expiratory Volume in one second (FEV1), Maximal Inspiratory Pressure (PImax) and Maximal Expiratory Pressure (PEmax)4,5. These values provide indirect measurements of respiratory muscle performance6. In clinical practice and research, a surface electromyography (sEMG) recorded from respiratory muscles can be used to assess respiratory motor function and help to diagnose neuromuscular pathology. However, variability in the sEMG amplitude inhibits efforts to develop objective and direct measures of respiratory motor function6. Based on a multi-muscle sEMG approach to characterize motor control of limb muscles7, known as the voluntary response index (VRI)8, we developed an analytical tool to characterize respiratory motor control directly from sEMG data recorded from multiple respiratory muscles during the voluntary respiratory tasks. We have termed this the Respiratory Motor Control Assessment (RMCA)9. This vector analysis method quantifies the amount and distribution of activity across muscles and presents it in the form of an index that relates the degree to which sEMG output within a test-subject resembles that from a group of healthy (non-injured) controls. The resulting index value has been shown to have high face validity, sensitivity and specificity9-11. We showed previously9 that the RMCA outcomes significantly correlate with levels of SCI and pulmonary function measures. We are presenting here the method to quantitatively compare post-spinal cord injury respiratory multi-muscle activation patterns to those of healthy individuals.

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

The purpose of this publication is to present our original work on a multi-muscle surface electromyographic approach to quantitatively characterize respiratory muscle activation patterns in individuals with chronic spinal cord injury using vector-based analysis.

Evaluation de l&#39;activation des muscles respiratoires aide respiratoire évaluation du contrôle moteur (MRAC) chez les personnes atteintes de maladies chroniques Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Contrôlée corticale modèle d&#39;impact pour Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Un système de radio-télémétrique de surveiller la fonction cardiovasculaire chez le rat avec la moelle épinière Transection et embryonnaires souches neurales greffes cellulaires

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d&#39;auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibré Forceps modèle de compression de la moelle épinière des blessures

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...