Ce travail a été soutenu par le projet BRIANBOW européenne (FP7 Jeunes Explorateurs, Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jacopo Tessadori des commentaires utiles sur le manuscrit, et Silvia Chiappalone pour son aide dans la production des graphiques utilisés dans la vidéo.

La procédure a été fait en conformité avec les normes NIH pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité de Tel-Aviv University animale soin et l&#39;utilisation (nombre de permis - L-14-019). 1. Préparation d&#39;instruments et PDMS <ol><li> Préparer la plaquette (Table des matières, ou commander la plaquette d&#39;un laboratoire de microfabrication), un scalpel, et une paire de pinces à épiler - stérilisation ne est pas nécessaire. </li><li> Assurez-poly-D-lysine (PDL) Solution selon l&#39;une des conditions suivantes: 4 mg / ml dans du tampon borate 0,1 M, pH 8, et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer PDMS pochoirs selon la procédure suivante: <ol><li> Préparer polydiméthylsiloxane (PDMS, élastomère de silicone) en mélangeant ensemble la base et l&#39;agent de durcissement avec un rapport de 10: 1, puis mélanger les deux substances pendant environ 5 min. </li><li> Place dans la chambre à vide à deux reprises pendant 15 min à chaque fois et de vérifier bulles ont disparu. </li><li> QuandPDMS est prêt, préparer tournette: boutons d&#39;azote ouverts pour permettre l&#39;utilisation du gaz, placer la plaquette de silicium (figure 1A) sur spinner, et utiliser le vide pour l&#39;empêcher de bouger. </li><li> Verser PDMS sur plaquette et activer le spinner pendant 1 min à 1000 rpm (crée environ 100 um hauteur). </li><li> Placez plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 30 min. </li><li> Lorsque le PDMS a durci, définir les frontières de l&#39;pochoir avec PDMS, en utilisant une pipette Pasteur. Placez plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 30 min. </li><li> Lorsque les PDMS frontières ont durci, utiliser un scalpel pour couper les stencils selon les frontières et de décoller le pochoir de silicium de la plaquette (un PDMS carré contenant un seul motif). </li></ol></li></ol> 2. Boîte de Pétri et lamelle Préparation <ol><li> Préparer 23 mm lamelles de verre carrée et nettoyez-les selon l&#39;ordre suivant: <ol><li> Laver à l&#39;eau distillée, 70% d&#39;éthanol, et l&#39;acétone. </li><html><li> Laver avec de l&#39;isopropanol et séchage rapide avec de l&#39;azote. </li></ol></li><li> Placez motifs PDMS pochoirs sur la lamelle, et appuyez doucement pour vérifier qu&#39;ils sont fermement attachés à la surface du verre. Placer dans la chambre à vide pendant 15 min. </li><li> 1 ml de l PDL sur pochoir. Insérer la lamelle dans la chambre à vide à deux reprises pendant 20 min chaque fois, et laisser PDL O / N à sécher. </li><li> Préparer boîte de Pétri pour créer un réseau de cellules de soutien: <ol><li> Couvrez la surface du plat (3,5 cm) avec 1 ml de PDL pour 2 h en RT. Retirer la chute PDL aide d&#39;une pipette. </li><li> Laver avec de l&#39;eau distillée et laisser sécher. Placer une très petite goutte de la graisse de silicone sur chaque coin de la lamelle. </li></ol></li><li> Placez la lamelle sur le centre de la boîte de Petri (ie, les PDMS devraient être orientés vers le haut) et appuyez doucement pour vérifier l&#39;attachement. </li><li> Retirez délicatement PDMS de lamelle en utilisant une pince à épiler. Pour la stérilisation, exposer à illumination UV pendant 7 min. </li></ol>le &quot;&gt; 3. Multi-Electrode Array (MEA) Préparation <ol><li> Clean MEA dans cet ordre (Table des Matières): <ol><li> Laver avec de l&#39;eau sous l&#39;eau courante et soniquer dans un détergent enzymatique concentré trois fois. </li><li> Soniquer en eau distillée 3 fois. </li><li> Laver avec de l&#39;eau distillée (dans le capot, 1000 pointe du pi) pour 3 fois et le lieu sous UV pendant 30 min. </li></ol></li><li> Appuyer la préparation du réseau: <ol><li> Préparer le moule de réseau de soutien conçu. <ol><li> Verser PDMS dans une plaque à 12 puits (diamètre 22 mm). </li><li> Lorsque le PDMS est durcie sortir du moule et l&#39;aide d&#39;un scalpel, découper un trou au milieu pour créer une forme d&#39;anneau. </li><li> Placez un moule de réseau de soutien conçue sur le centre de la MEA (figure 2A) et couvrir le reste de la surface avec PDL pendant 2 heures à la température ambiante. </li></ol></li><li> Retirer PDL utilisant pipette et laver avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Retirer le moule et laisser sécher (figure 2A). &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Aligner à stencil MEA de la manière suivante: <ol><li> Placez pochoir sur micro manipulateur désigné. Utilisation d&#39;un microscope inversé pour aligner avec précision la structure à motifs à des électrodes, et d&#39;abaisser le gabarit jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit placé sur la surface de la MEA (Figure 2B). Remarque: Le contact avec un MEA bien nettoyée fournit adhérence de concurrence entre les PDMS et l&#39;AEM lui-même. </li><li> Soulevez le micromanipulateur et, si nécessaire, utiliser des pinces d&#39;appliquer une petite quantité de pression au-dessus des PDMS pour l&#39;empêcher détacher de l&#39;AEM. </li><li> Appuyez doucement pochoir à la surface de la MEA, et d&#39;utiliser un microscope pour vérifier qu&#39;il est fermement attaché, et bien aligné. (Figure 2C-D). </li></ol></li><li> Passer MEA dans la chambre à vide pendant 15 min; mettre une goutte de 1 ml de PDL sur pochoir. </li><li> Insérez dans la chambre à vide 2 fois pendant 20 min chacun. Laisser sécher PDL O / N dans l&#39;incubateur. </li><li> Avant de plaquage, enlever les pochoirs de PDMS AME et laver utilisant stérile water. Placer sous illumination UV pendant 7 min. </li></ol> 4. Dissection et de la culture <ol><li> Préparer cultures comme décrit dans Herzog et al. 2011 21. </li></ol> 5. Placage <ol><li> Calculer le nombre de cellules nécessaires pour le placage, en utilisant un hémocytomètre (densité optimale en fonction de la taille du circuit comme décrit dans la suite). <ol><li> Assurez-vous que la chambre de comptage (hémocytomètre) est propre et placer une lamelle sur elle (la consommation d&#39;alcool pour nettoyer). </li><li> Diluer 10 ul de la suspension de cellules dans 190 ul de milieu d&#39;étalement (dilution 1:20). </li><li> Charge 10 pi des cellules diluées sur le bord de la chambre de comptage et lentement pipeter les cellules permettant à la chambre à se remplir. </li><li> En utilisant un microscope inversé, de visualiser la grille de hémocytomètre. Déterminer le nombre de cellules dans la chambre par comptage direct (cellules saines doivent être ronds). Compter les cellules au sein de la grande witho carréut ceux qui traversent les bords. </li><li> Calculer la concentration de cellules: Nombre total de cellules / 1000 pi = Total cellules comptées × facteur de dilution x 10 4 (zone de l&#39;hémocytomètre). Remarque: Par exemple, si le facteur de dilution est de 20 et le total des cellules comptées étaient 100: 100 x 20 x 10 x 4 = 0,1 10 7 cellules / 1000 pi ou 1 x 10 6/100 pi. Afin de plaque 0,75 x 10 6 cellules, prendre 75 pi sur les cellules. </li></ol></li><li> Prendre le nombre de cellules nécessaires pour le placage par MEA unique ou boîte de Pétri, remettre en suspension les cellules pour empêcher l&#39;agrégation, et la plaque entre eux au centre, sur le dessus de la zone de patternate (si nécessaire, il est possible de diluer les cellules dans le milieu) . Pour la MEA, déposer une goutte de 100 pl dans le milieu. Pour lamelle, placez une goutte de 1 000 pi au milieu. </li><li> Incuber les cellules étalées à 37 ° C pendant 40 min. Ajouter à moyen placage pour les cellules étalées, jusqu&#39;à 1ml par MEA et 2 ml par lamelle. </li><li> Gardez à 37 ° C et, tous les quatre jours, diluer avec de milieu de croissance frais enrichi avec 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 et 0,75% glutamax. </li><li> De 6/7 DIV, après avoir vu les connexions entre les îles, diluer moyenne avec 10 pl / ml FUDR (25 mg désoxyuridine + 62,5 mg uridine dans 12,5 ml de MEM (milieu essentiel minimum d&#39;Eagle)) ou tout autre agent anti-mitotique pour empêcher gliale prolifération. </li></ol>

<ol>
	<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+syntax:+cell+assemblies,+synapsembles,+and+readers.">Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers.</a> Neuron. 68, 362-385 (2010).</li><li>Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+and+hierarchically+modular+organization+of+brain+networks.">Modular and hierarchically modular organization of brain networks.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).</li><li>Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neural+representation+capacity+by+modular+architecture+in+networks+of+cortical+neurons.">Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).</li><li>Berdondini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microelectrode+array+(MEA)+integrated+with+clustering+structures+for+investigating+in+vitro+neurodynamics+in+confined+interconnected+sub-populations+of+neurons.">A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).</li><li>Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+bursting+activity+in+connected+neuronal+sub-populations.">Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations.</a> PloS One. 9, e107400 (2014).</li><li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+synchronous+oscillations+in+freely-organized+small+neuronal+circuits.">Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits.</a> PloS One. 5, e14443 (2010).</li><li>Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+neuronal+circuits:+a+new+platform+for+studying+the+role+of+modular+topology.">Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology.</a> Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).</li><li>Bonifazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+large-scale+experimental+and+theoretical+studies+for+the+realization+of+bi-directional+brain-prostheses.">In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.</a> Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).</li><li>Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triangular+neuronal+networks+on+microelectrode+arrays:+an+approach+to+improve+the+properties+of+low-density+networks+for+extracellular+recording.">Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).</li><li>Marconi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+functional+properties+of+neuronal+networks+with+controlled+topology.">Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology.</a> PloS One. 7, e34648 (2012).</li><li>Taylor, A. M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+compartmentalized+platforms+for+neurobiological+research.">Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).</li><li>Sorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+self-wiring+in+cultured+neural+networks.">Compact self-wiring in cultured neural networks.</a> J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+properties+for+biomedical+micro/nanosystems.">Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems.</a> Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).</li><li>Campo, A. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8:+a+photoresist+for+high-aspect-ratio+and+3D+submicron+lithography.">SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography.</a> Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).</li><li>Liu, G. T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kan+Y+Fabrication+of+high-aspect-ratio+microstructures+using+SU8+photoresist.">Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist.</a> Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).</li><li>Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+elastomeric+membranes+as+dry+resists+and+for+dry+lift-off.">Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off.</a> Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).</li><li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes.">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).</li><li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Fixed-Array+Multi-Microelectrode+System+Designed+for+Long-Term+Monitoring+of+Extracellular+Single+Unit+Neuronal-Activity+In+vitro.">New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro.</a> Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).</li><li>Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+of+spontaneous+activity+with+photoetched+microelectrode+surfaces+from+mouse+spinal+neurons+in+culture.">Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).</li><li>Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+microelectrode+array+to+monitor+the+bioelectric+activity+of+cultured+cells.">A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells.</a> Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).</li><li>Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+validation+of+in+vitro+extra-cellular+neuronal+recordings.">Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings.</a> J Neural Eng. 8, 056008 (2011).</li><li>Maccione, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+precise+identification+of+spikes+in+extracellularly+recorded+neuronal+signals.">A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).</li><li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture.">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab Chip. 9, 404-410 (2009).</li><li>Georger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+Patterns+of+Self-Assembled+Monolayers+for+Selective+Cell-Adhesion+and+Outgrowth.">Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth.</a> Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).</li><li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture.">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li><li>Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstamp+patterns+of+biomolecules+for+high-resolution+neuronal+networks.">Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 36, 135-141 (1998).</li><li>Petrelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+drop+patterning+for+rapid+on-chip+neuronal+connect-ability+assays.">Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays.</a> Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).</li><li>Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+networks+on+reliable+patterned+substrates.">Hippocampal networks on reliable patterned substrates.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Un protocole de croître réseaux neuronaux modulaires 2D in vitro composé de circuits fonctionnellement interconnectés est décrite. La procédure est basée sur un motif sur la couche adhésive cellulaire. Modélisation est réalisé avec PDMS pochoirs reproduire l&#39;aspect négatif de l&#39;architecture de réseau désiré. Pochoirs PDMS définissent les zones où la couche adhésive est déposée cellulaire. Une fois que les cellules sont étalées, ils assemblent spontanément aux îles recouvertes et ...

Preuves expérimentales et théoriques soutiennent la possibilité que le cerveau fonctionne par l&#39;activation coordonnée des agencements de piles 1-5, qui peut être considéré comme unités fonctionnelles dynamiques qui interagissent de façon transitoire avec l&#39;autre, mise en forme et les différents états sous-jacents du cerveau. Modularité fonctionnelle dépend également et associé à l&#39;organisation modulaire de la structure des circuits cérébraux 6,7. Comment la fonction et la structure des circuits cérébraux façonnent mutuellement est encore l&#39;une des principales questions ouvertes en neurosciences. Afin de fournir une meilleure compréhension de cette question, il est important d&#39;identifier les cadres expérimentales optimales où il est possible de répondre, au moins partiellement, ces questions. Depuis contrôlée manipulation de la dynamique spatio-temporelles des réseaux neuronaux dans des expériences in vivo est difficile, le développement de modèles in vitro de réseaux neuronaux est d&#39;un grand intérêt en raison de leur acc facileessibility, la surveillance, la manipulation et la modélisation de 8,9. Au cours des dernières années, dans les technologies appuyées par des méthodes in vitro substrat de modelage avancées ont permis d&#39;induire réseaux neuronaux pour développer une gamme de structures modulaires prédéfinis 3 et d&#39;étudier les propriétés fonctionnelles des réseaux avec des topologies imposées 10. En particulier, les méthodes ont récemment été utilisés pour organiser des réseaux en imposant des contraintes 4,11 physique. En effet, pour étudier le lien entre la structure et la fonction dans les réseaux neuronaux et de fournir une représentation simplifiée mais plausibles d&#39;interagir assemblées de neurones, les systèmes in vitro doivent fournir des sous-populations neuronales interconnectées. 2D cultures neuronales homogènes largement étudiés ne imposent pas de contraintes spatiales sur le câblage des circuits émergente auto-organisée. Par conséquent, une approche possible pour façonner assemblages de cellules interconnectées artificiellement est de positionner différentes populations neuronales dans naissainially zones distinctes. La distance entre ces zones ne empêche pas les assemblées inter connexions. Cette approche, tout en assurant un contrôle considérable sur la complexité du réseau, a été montré pour fournir un répertoire plus riche de modèles de synchronisation 6,7,12. Afin de faciliter une culture reproductible des assemblées de neurones modulaires, un protocole d&#39;assembler l&#39;auto-organisation des réseaux neuronaux en groupes reliés par des axones et dendrites est présentée et décrite. La structure polymère pour le confinement physique des cultures de neurones a été créé à partir polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS est un élastomère largement utilisé pour des applications biomédicales en raison de sa biocompatibilité, la transparence et la 13 perméabilité aux gaz. Le PDMS est préparé et exclu de la micro-usiné SU8 2075 14,15 structures par spin-coating un PDMS liquides sur un «maître» comme décrit précédemment dans Jackman et al. 16 TIl a réalisé modelé réseaux neuronaux sont composés de modules interconnectés de taille différente et ils ont été obtenus avec succès sur les deux lamelles et Micro Arrays électrodes (AME) 17-20. La densité des connexions entre les modules peut changer les caractéristiques de la synchronisation du réseau, à partir d&#39;un réseau entièrement synchronisée, typique des cultures homogènes, à des états transitoires de synchronisation entre modules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Vacuum Chamber</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>5305-0609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine PDL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell - Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well culture plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8217;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone grease - SILICAID 1010</td>
			<td>&#160;aidchim Ltd</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA1060-Inv-BC</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC02</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>03-033-1c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Minimum Essential Medium-Eagle</td>
			<td>Biological Industries Beit Haemek</td>
			<td>01-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Electrode Arrays 4Q</td>
			<td>Multi Channel Systems</td>
			<td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr</td>
			<td>cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon wafer</td>
			<td>microchem</td>
			<td>SU8-2075</td>
			<td>Preparation protocol: www.microchem.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, surface treatment, cellular plating, and culturing of modular neuronal networks composed of functionally inter-connected circuits

Le cerveau fonctionne par l&#39;activation coordonnée et la communication dynamique des assemblées de neurones. Une question majeure est de savoir comment ouvert un vaste répertoire de motifs dynamiques, qui sous-tendent les fonctions cérébrales les plus diverses, peut émerger d&#39;une organisation topologique fixe et modulaire des circuits du cerveau. Par rapport aux études de circuits neuronaux in vivo qui présentent des difficultés expérimentales intrinsèques, les préparations in vitro offrent une possibilité beaucoup plus grande à manipuler et sonder les propriétés structurelles, dynamiques et chimiques des systèmes neuronaux expérimentales. Ce travail décrit une méthodologie expérimentale in vitro qui permet croissante des réseaux modulaires composés par les assemblées de neurones spatialement distincts, fonctionnellement interconnectés. Le protocole permet de contrôler les deux dimensions (2D), l&#39;architecture du réseau neuronal à différents niveaux de complexité topologique. Une structuration de réseau désiré peut êtreréalisé à la fois sur des lamelles régulières et substrat intégré tableaux micro-électrodes. Structures micro-usinées sont gaufrées sur une tranche de silicium et utilisés pour créer des pochoirs polymères biocompatibles, qui incorporent les caractéristiques négatives de l&#39;architecture de réseau souhaitée. Les pochoirs sont placés sur des substrats de culture au cours de la procédure de revêtement de surface d&#39;une couche moléculaire pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire. Après élimination des pochoirs, les neurones sont étalées et ils spontanément redirigées vers les zones revêtues. En diminuant la distance inter-compartiment, il est possible d&#39;obtenir des circuits neuronaux isolées ou reliées entre elles. Pour favoriser la survie des cellules, les cellules sont co-cultivées avec un réseau neuronal de support, qui est situé à la périphérie de la boîte de culture. Des enregistrements électrophysiologiques et optiques de l&#39;activité de réseaux modulaires respectivement obtenus à l&#39;aide de substrats micro intégré réseaux d&#39;électrodes et d&#39;imagerie de calcium sont présentés. Bien que chaque module présente spontsynchronisations mondiaux aneous, l&#39;apparition de synchronisation inter-module est réglementée par la densité de connexion entre les circuits.

Un SU8-2075 moule sur une tranche de silicium avec une épaisseur de caractéristique d&#39;environ 100 um a été utilisée pour façonner le PDMS. Le motif est composé de plusieurs carrés de dimensions, avec une longueur de côté et la distance variant entre 200 et 700 um (figure 1B). La taille de la place a été choisi pour adapter le champ de vision d&#39;un 10X (pour les îles avec une longueur de côté &lt;800 um) et d&#39;un objectif 20X (pour les îles avec une longueur de côté &lt;400 um...

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Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l&#39;espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur ​​les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité électrophysiologique.

Conception, Traitement de surface, Cellulaire Placage et culture des réseaux neuronaux modulaires Composé de circuits Fonctionnellement Inter-connectées

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

design-surface-treatment-cellular-plating-culturing-modular-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K vues.  Tel-Aviv University.  Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l'espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l'adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur ​​les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité élec...

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Recherche

Neurosciences

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Une procédure d&#39;implantation de tableaux organisés de microfils pour enregistrements unitaires dans Awake, se comportant Animaux

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

En boucle fermée expériences neuro-robotique l&#39;analyse des propriétés de calcul de réseaux neuronaux

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Détermination de l&#39;expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d&#39;astritcy primaires utilisant la biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

La Stimulation électrique chronique transcrânienne et Intracortical enregistrement chez le rat

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic entraînement des Oscillations thêta hippocampique en comportement des souris

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...