Les auteurs tiennent à remercier Ulrich Marggraf (ISAS) pour SU-8 de fabrication et Maria Becker (ISAS) pour l&#39;imagerie SEM. La recherche a été soutenue financièrement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), un Bundesministerium für Bildung und Forschung subvention (BMBF 0101-31P6541) et par le Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf grâce l&#39;École internationale d&#39;études supérieures Leibniz «biologie des systèmes Lab-on-a-Chip» pour un soutien financier.

Les protocoles sont conçus pour les neuroscientifiques, et sont résumées dans la figure 2. Comme tel, il est recommandé que la microfabrication des SU-8 maîtres utilisés pour la réplication PDMS est sous-traitée à des installations commerciales ou institutionnelles. Les deux modèles de masques de couche sont disponibles gratuitement que les informations complémentaires (ZIP) de la Société royale du site Chimie 12. Fait important, le SU-8 première couche doit être fabriqué sur une profondeur de 2,5 à 3,0 um, et le second à une profondeur de 25 à 30 um. Ce sont des dimensions clés nécessaires pour formation de réseaux de neurones efficace. La limite de taille de 3 microns est également nécessaire d&#39;éviter les neurones étant transportées ou de migrer entre les deux compartiments 12. 1. Microfluidique réplication de périphériques dans PDMS <ol><li> Mélanger le prépolymère PDMS à fond avec de l&#39;agent de durcissement (184) dans un rapport de 10:01 et dégazer le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 20 min en général. Vous pouvez aussi mettre le mélangeture dans un tube Falcon de 50 ml et utiliser faible g une centrifugation pour le dégazage. </li><li> Placer la couche microstructurée 2-SU-8 sur une plaquette plaque chauffante à 80 ° C et aligner des trames de polymère à chaque dispositif sur la tranche. Verser le PDMS dans les cadres jusqu&#39;à une profondeur de ≥ 5 mm et permettre&gt; 1 h afin d&#39;assurer le durcissement thermique complet. </li><li> Une fois durci, retirer la plaquette de la plaque de cuisson et laisser refroidir sur une surface plane. </li><li> Porter des lunettes de protection et de travail d&#39;un coin (loin des SU-8 microstructures) avec un scalpel rigide pour forcer doucement le cadre et PDMS de la plaquette. </li><li> Retirer le moule PDMS du cadre et utiliser une paire de ciseaux pour couper le dispositif de PDMS excès. Ce que l&#39;on appelle souvent clignotant est produit quand un mince film de PDMS s&#39;étend entre le bâti de polymère et la surface de la plaquette. </li><li> PDMS restants peuvent être appliqués sur toute la plaquette et on les durcit pour protéger la pastille durant le stockage. Enlever avant moulage d&#39;un dispositif ultérieur, et en faisant enlever tout particuler les contaminants de la surface. </li></ol> 2. Assemblée de l&#39;appareil et l&#39;interconnexion <ol><li> Préparer les ports d&#39;interface 6 en utilisant un 3 mm de diamètre biopsie punch. Travailler sur une surface sombre, dans de bonnes conditions d&#39;éclairage et les caractéristiques microstructurées tournées vers le haut pour faciliter l&#39;alignement des ports avec les canaux microfluidiques. </li><li> Inspectez l&#39;appareil pour les particules. Enlevez ces aide de ruban adhésif réversible. </li><li> Le circuit microfluidique est encapsulé à l&#39;aide d&#39;une couche de PDMS mince monté sur une lamelle de verre: Elles sont préparées par coulée d&#39;un petit volume (~ 0,5 ml) du mélange d&#39;agent de PDMS-durcissant (10:01, 601) sur la base d&#39;un flexible, qualité bactériologique boîte de Pétri. Appuyez doucement sur une lamelle sur la couche de PDMS, placer sur la plaque chauffante et le traitement thermique pendant quelques minutes. Rapidement après refroidissement, utiliser un scalpel pour découper et prix de la bicouche lamelle-PDMS de la boîte de Pétri. Couper avec des ciseaux si nécessaire. </li><li> liaison plasma de l&#39;appareil PDMSet la couche de support pour produire une bonne étanchéité: Conditions idéales instrument spécifique. Par exemple, un four à plasma fonctionnant à 70 W et 40 kHz, dans une atmosphère d&#39;oxygène de 0,2 mbar pendant 40 secondes produit une excellente liaison PDMS-PDMS. Une fois le plasma traité, appuyez sur les deux pièces ensemble et laisser reposer pendant une minute pour coller correctement. </li><li> Utiliser un tube en silicone (1,6 mm d&#39;identité; 3,2 mm OD) pour s&#39;interfacer avec des pompes et des seringues. </li></ol> 3. Biomatériaux Modélisation et opérations microfluidiques Les protocoles de biomatériau in situ structuration, de la culture des neurones et des traitements fluidiques sont illustrés dans la figure 2. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Des protocoles microfluidiques Illustrated. A) PL et PLL-g-PEG motif; ajout de la couche d&#39;adhésion cellulaire (par exemple,PL, vert), avec production d&#39;évaporation de l&#39;eau du masque aligné B) de traitement par plasma atmosphérique de l&#39;air de la PL exposé.; deux broches d&#39;antenne sont utilisés, avec l&#39;antenne d&#39;introduction de plasma illustré avec une étoile rose. C) PBS (bleu) lavage par aspiration est utilisé pour éviter de contaminer la région de plasma traité par PL. D) La livraison de PLL-g-PEG (rouge ) par aspiration à enrober les régions de plasma traité E) cellule de chargement.; formation de réseaux microfluidique simultanée des neurones à deux compartiments d&#39;accompagnement par aspiration, F) médias (perfusion rose) à l&#39;aide d&#39;un flux à entrainement hydrostatique La G) traitements fluidiques isolées.; traitement périphérique d&#39;un agent de test (noir) livré à partir du fond de flanc d&#39;entrée par aspiration et H) de traitement central délivré de l&#39;entrée centrale inférieure par aspiration. Figure et légende reproduites avec la permission de la Royal Society of Chemistry(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Plasma immédiatement après le collage des canaux microfluidiques PDMS sont très hydrophile (angle de contact ≤ 5 °). De telles surfaces sont adaptés à l&#39;adhérence et à la culture de lignées cellulaires telles que les cellules différenciées analogues à des neurones humains SH-SY5Y. Pour la culture ex vivo des neurones primaires et la culture de lignées de cellules précurseurs neuronales telles que la lignée Lund de cellules mésencéphaliques humain (LUHMES) un revêtement de polyamine, soit la polylysine (PL) ou la polyornithine (PO), est nécessaire comme point d&#39;ancrage électrostatique. En plus des protéines d&#39;adhésion comme la laminine ou la fibronectine sont souvent requis que le revêtement de l&#39;intégrine interfaçage. Toutefois, les revêtements PL et PO se lient facilement les neurones, ce qui entrave la distribution microfluidique aux sites de réseau et également imposer des contraintes de cisaillement indésirables. Pour résoudre ce problème biomatériau à la pucestructuration est nécessaire de localiser les matériaux d&#39;adhérence au niveau des sites de piégeage et les microcanaux de excroissance. Cela favorise également le développement des liaisons inter-compartiments et réduit l&#39;enchevêtrement local. Le protocole comprend également l&#39;ajout de matériaux PEG dans les zones voisines pour assurer les protéines et les neurones sont limitées aux endroits désirés pendant une longue culture. Le protocole suivant est décrit dans la figure 3: <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. L&#39;eau de masquage pour la modélisation biomatériau par pochoir plasma. A) Illustration du processus de masquage de l&#39;eau avec les PDMS micropiliers épingler le ménisque d&#39;eau en place pour pochoir plasma. Courbure du ménisque dans le plan vertical a été négligée. B) de l&#39;eau masque visualisés avec un colorant rouge et positionné par ménisque pmanche. C) Le motif revêtement PL-FITC imagée après plasma pochoir. D) L&#39;addition de protéines de rejet et anti-cellule PLL-g-PEG-TRITC à un PL-FITC revêtement de plasma à motifs. Cela a été utilisé pour l&#39;enregistrement des cellules SH-SY5Y et également pour un motif d&#39;une couche supplémentaire de la fibronectine des cellules LUHMES. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> masquage de l&#39;eau pour in situ biomatériaux Modélisation par pochoir plasma <ol><li> Peu de temps après le collage de plasma pipette d&#39;un volume de 0,5 ul de PL ou PO (100 ug / ml dans du PBS 1x) dans l&#39;orifice central inférieur. En quelques secondes, l&#39;ensemble du circuit microfluidique est rempli par capillarité. Laissez agir quelques minutes pour enrober complètement les PDMS surfaces hydrophiles avec le polyamines. </li><li> Éliminer les molécules de polyamines non liés par lavage entraîné aspiration-avec 1x PBS (voir figure 2C) pendant 1 min. </li><li> Retirez tous PBS à partir des ports et chauffer l&#39;appareil par un éclairage avec un microscope. Cela augmente l&#39;évaporation à partir des ports pour la formation rapide du masque de l&#39;eau. Le masque de l&#39;eau (illustré sur la figure 3A et documentés dans la figure 3B) est établi à l&#39;intérieur de ~ 5 min. </li><li> Inspecter le dispositif par microscopie à assurer masquage d&#39;eau est terminée. S&#39;il vous plaît noter structures de réservoir en amont du site de réseau sont incluses dans la conception de masque pour prolonger la stabilité du masque de l&#39;eau (~ 15 min). </li><li> Insérer les broches en acier inoxydable dans les ports (figure 2B). Ceux-ci sont utilisés pour coupler le plasma généré par une décharge corona pression atmosphérique à main ou d&#39;un générateur Tesla (par exemple, fonctionnant à 2 MHz, le signal de 30 kV) 19,20 dans les canaux microfluidiques vacants. Pointer le bout de til plasmatique source proche de la pointe d&#39;une épingle et plasma traiter la microcanaux pour ≤ 1 sec. Utilisez conditions de faible éclairage pour observer la structuration de plasma. </li><li> Retirer le masque de l&#39;eau avec une étape de lavage. Utilisez aspiration parallèle des 3 ports supérieurs. Utiliser quatre longueurs égales de tubulure en silicone reliés par un adaptateur 4 voies à une pompe d&#39;aspiration pour réaliser une aspiration parallèle. Lancer aspiration et de distribution de PBS dans les 3 ports bas pour attirer PBS dans le circuit microfluidique. De cette manière, un contraste de matériau PDMS-polyamine est produit (voir la figure 3C). Évacuer PBS du circuit microfluidique et laisser reposer pendant plusieurs heures pour le restaurer, état hydrophobe natif. Ceci rend les PDMS entièrement non permissive de l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Si, nécessaires matériaux d&#39;adhésion supplémentaires, telles que la laminine ou la fibronectine les étapes suivantes sont nécessaires et doivent être effectuées immédiatement après avoir enlevé le masque de l&#39;eau: la pipette un de volume de 10 ul de la greffe co-polymère de poly-L- Lysine-poly (éthylène glycol) (PLL-g-PEG, 100 pg / ml, dans du PBS) dans les deux canaux de transmission indirecte de fond, suivi par aspiration à partir des canaux supérieurs flanquantes pendant 2 min. </li><li> Sans interruption de l&#39;écoulement, enlever l&#39;excès de PLL-g-PEG par échange avec un tampon PBS. Cette sélectivement enrobe les régions non revêtues de polyamine avec le fragment PEG agissant pour empêcher l&#39;adsorption de protéines et l&#39;adhésion cellulaire 17,21. </li><li> les protéines d&#39;adhésion comme la laminine ou la fibronectine peuvent ensuite être co-localisées avec le revêtement de poly-amine: Introduire à la pipette volumes de 10 ul de ces protéines de la MEC (typiquement 10 pg / ml) dans tous les trois orifices de fond. Aspirer des trois premiers ports jusqu&#39;à ce que le dispositif est rempli de la solution de protéine et incuber pendant 1 heure pour produire un revêtement de bonne qualité. </li><li> Éliminer les protéines en excès par aspiration PBS à partir des 3 ports de fond. </li></ol></li><li> Microfluidique unique neurone rangeant <ol><li> Prime appareils avec appropriémangé médias. Ajouter des volumes de 20 pi à 3 orifices de fond et par aspiration parallèle à partir des trois ports supérieurs remplir rapidement le circuit microfluidique avec les médias. Utiliser un raccord de tubulure à 4 voies pour coupler les trois orifices supérieurs par l&#39;intermédiaire de tube en silicone de longueur égale à une pompe d&#39;aspiration. </li><li> Ajouter 20 ul d&#39;une suspension de cellules désagrégées (1 x 10 6 cellules / ml) à chacun des ports d&#39;entrée (0 flanquantes, dans la figure 1). </li><li> Équipé d&#39;une pompe d&#39;aspiration avec un régulateur de débit ou utiliser une seringue pour l&#39;aspiration douce des 3 ports supérieurs. Neurone complet de formation de réseau nécessite généralement 1 min. </li><li> Récolter les neurones excédentaires restantes dans les quatre ports d&#39;accompagnement avec une pipette pour rangeant dans des dispositifs microfluidiques ultérieures. </li><li> Retirez le tube. Remplissez tous les ports avec les médias et placer l&#39;appareil dans l&#39;incubateur. En quelques heures, les cellules deviennent totalement adhérente sur le modèle biomatériau. </li></ol></li><li> Neuron Culture, sélective traitement fluidique, et Immunostaining <ol><li> Échanger les médias par perfusion périodique utilisant l&#39;avance hydrostatique (2 mm de différence de hauteur de la colonne est lent approprié). </li><li> Alternativement, submerger le dispositif microfluidique dans les médias, d&#39;échanger les médias périodiquement (2-3 jours) avec des cultures de cellules standard. </li><li> Fluidiques traitements sélectifs de chaque neurone compartiment de culture ou de l&#39;excroissance des neurites compartiment central sont obtenus comme suit: Distribuer 20 ul de la substance d&#39;essai dans l&#39;orifice de fond du canal d&#39;intérêt, et aspirer de l&#39;orifice au dessus. Pour de longs traitements réduisent le débit à l&#39;aide d&#39;un régulateur de débit et de reconstituer la substance d&#39;essai au besoin. </li><li> Protocoles IMMUNOCOLORATION varient pour chaque cible moléculaire et réactifs associés. Afin de lutter contre le risque potentiel de dommages induits par cisaillement aux neurones un débit lent a été utilisé. Il en résulte une augmentation des temps d&#39;application pour perfuser pleinement le système, un allongement des délais de protocole normales. Hyperfusion drostatic utilisant les ports avec différentes hauteurs de la colonne (par exemple, par 2 mm) a été utilisé pour fournir des réactifs. Plus réactif et plus rapide suppression à l&#39;aide d&#39;une pompe peuvent être utilisés pour réduire les délais d&#39;expérimentation. Connectez une pompe d&#39;aspiration pour les trois ports supérieurs à attirer réactifs des 3 ports de fond. </li></ol></li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+olfactory+transport+of+inhaled+manganese+((MnCl2)-Mn-54)+to+the+rat+brain:+Toxicokinetic+investigations+in+a+unilateral+nasal+occlusion+model.">Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).</li><li>Magal&#227;es, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells.">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li><li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation.">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La technique de formation de réseau microfluidique est le premier de son genre qui permet une manipulation simple neurone de précision pour établir cultures minimalistes. Couplé avec la méthode in situ de structuration biomatériau, une approche puissante pour aligner les modèles de cellules avec des structures microfluidiques, ces cultures minimalistes ont des niveaux de connectivité haut de intercompartment à une réduction de l&#39;enchevêtrement local. Ces caractéristiques peuvent être u...

<html> Tissu neuronal est très complexe; un mélange cellulaire hétérogène spatialement ordonné dans des couches et des compartiments définis et avec une connectivité plastique par des contacts cellulaires et en particulier par l&#39;intermédiaire des axones et dendrites excroissances. De nouvelles techniques sont nécessaires pour conférer une plus grande liberté d&#39;expérimentation pour gagner une compréhension plus profonde et mécanismes démêler centrales à la maladie, le développement et la fonction saine. La chambre Campenot 1,2 et, plus récemment, des modes de réalisation microfabriqué 3,4 peuvent être utilisés pour la préparation ex vivo des co-cultures de neurones en réseau ayant la capacité de perturber sélectivement les différentes populations somatiques et également leurs excroissances de neurites. Ces dispositifs microfluidiques ont par exemple été utilisés pour étudier la dégénérescence axonale et la régénération chimique suivante 5,6 ou laser axotomie 6-8, tauopathie 9, la diffusion virale 10,11, et la localisation des ARNm dans les axones 4. ent &quot;&gt; Pour étendre la portée des neurobiologistes, les développements technologiques sont nécessaires pour préparer les co-cultures de neurones minimalistes. Cela permet désenchevêtrement du réseau neuronal pour l&#39;étude du système avec une seule cellule et une précision sub-cellulaire. L&#39;obligation pour les nombres de cellules minimaux ouvre la possibilité d&#39;analyser les différents types de cellules rares, y compris les cellules de la substantia nigra dopaminergiques pertinents pour la maladie de Parkinson, les ganglions de la spirale de l&#39;oreille, des neurones périphériques, et les cellules souches. Au-delà, l&#39;économie cellulaire est pertinente à l&#39;initiative 3R. L&#39;utilisation de ces plates-formes microfluidiques, des écrans de toxicité à grande échelle ou d&#39;autres haut débit, riche en données série expérimentale nécessitant des neurones des animaux peut maintenant être considérée. Dans ce document, les protocoles pour la fabrication et l&#39;utilisation d&#39;un dispositif microfluidique sont décrits. Formation de réseau microfluidique en combinaison avec un biomateri in situProcédé de formation de motifs al peut être utilisé pour l&#39;enregistrement des co-cultures de neurones fortement interconnectés en utilisant les nombres de cellules minimal. Formation de réseaux microfluidique est basé sur une approche de flux différentiel 12-15, où les pièges microstructurées sont placés dans un circuit fluidique (illustré avec des images MEB de la figure 1). Le chemin 0 → 1 présente la plus faible résistance fluidique (R 2&gt; R 1) pour le transport de neurones à une rangée linéaire d&#39;ouvertures microstructurées - les ports d&#39;entrée vers les canaux de la croissance des neurites. Occupation du piège par une seule cellule empêche localement le flux de détourner les lignes de courant pour piéger les cellules suivantes dans les pièges voisins. Occupation totale des pièges contenus dans le tableau commute le rapport fluidique (R 1&gt; R 2) pour dévier les lignes de courant dans le trajet sinueux (0 → 2) pour produire un mode de fonctionnement en dérivation pour l&#39;élimination des excès de neurones. Figure 1. Microfluidique circuit. A) Le circuit de résistance différentielle fluidique pour seule formation de réseaux de neurones, avec accompagnement des chambres de culture reliés entre eux par des canaux de la croissance des neurites. B, C images) au MEB de la bicouche neurone compartimentée matrice de co-culture avec des ménisques micropiliers goupiller. Avec cette conception, structures neurone piégeage en forme de trident ont été utilisés pour promouvoir fasciculation des excroissances de neurites. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> La préparation des réseaux neuronaux microélectrodes sur des substrats planaires peut facilement être atteint (pour exampl<html> es de notre groupe, voir Frimat et al. 16 et Heike et al. 17). Cependant, l&#39;encapsulation des motifs de matériau bioactif dans des dispositifs PDMS et à l&#39;exigence d&#39;alignement échelle micrométrique de ceux-ci aux canaux microfluidiques pose un défi technique majeur. Dans la section 3.1 un protocole pour l&#39;en-puce, ou in situ, la préparation de modèles de biomatériaux est présenté. Ces modèles permettent l&#39;enregistrement des neurones pendant de longues échelles de temps de la culture et de promouvoir des excroissances entre les compartiments. Microstructures ménisque-épinglage sont utilisées pour aligner une dite masque de l&#39;eau avec le neurone sites et des canaux de l&#39;excroissance de neurites rangeant. Le masque protège les revêtements de l&#39;eau des molécules d&#39;adhésion pendant le traitement au plasma, tandis que les surfaces exposées sont désintégrées pour définir le motif de biomatériau. En outre, les protocoles sont prévus pour la culture de cellules et pour l&#39;isolation fluidique nécessaire pour le traitement sélectif des différents compartiments de co-culture. ve_content &quot;&gt; Les protocoles sont conçus pour tirer parti des principes conviviales de lithographie douce pour la réplication de poly (diméthyl) (PDMS) des dispositifs microfluidiques 18. De même, biomatériau in situ structuration en est simple, l&#39;exploitation évaporation de surface et les phénomènes de tension, et seulement nécessitant une source de plasma portatif peu coûteux. Circuit microfluidique efficacement les traitements spécifiques des programmes de chargement de la cellule et des soutes qui rend ces opérations simplement une question de la distribution des matériaux dans l&#39;orifice inférieur correspondant et l&#39;aspiration par le haut. De cette manière, il est destiné à donner les neurobiologistes la liberté de préparer et d&#39;utiliser des dispositifs microfluidiques dans leurs propres laboratoires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">PDMS Sylgard 184</td>
			<td style="width:163px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDMS Elastosil RT 601</td>
			<td style="width:163px;">Wacker</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Coverslips</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td>630-1590</td>
			<td>130-160 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">3 mm Biopsy Punches</td>
			<td style="width:163px;">Kai Medical</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Handle with care - extremely sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">S-50-HL</td>
			<td>1.65 mm ID; 3.35 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix)</td>
			<td style="width:163px;">Braun</td>
			<td style="width:143px;">6064204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">4-Way Tubing Connector</td>
			<td style="width:163px;">VWR or Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Flow Regulator</td>
			<td style="width:163px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:143px;">722645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">0.5 mm Pins</td>
			<td style="width:163px;">Dressmaking Departments</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">PLL-g-PEG</td>
			<td style="width:163px;">SuSoS</td>
			<td style="width:143px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td>Stability in storage can be an issue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-lysine-FITC</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P3069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">poly-ornithine</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">fibronectin</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">laminin</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">PBS</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Inverted Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">Example Aspiration Pump</td>
			<td style="width:163px;">KNF Neuberger, Laboport</td>
			<td style="width:143px;">N811KVP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:235px;">Hand Held Corona Discharge Device</td>
			<td style="width:163px;">Leybold-Heraeus, USA</td>
			<td style="width:143px;">VP23</td>
			<td>May not comply with your country&#39;s safety standards</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Femto Plasma Oven</td>
			<td style="width:163px;">Diener Electronic</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Vacuum Dessicator or Centrifuge</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neuronal co-cultures with single cell precision

Réalisation microfluidiques de la chambre Campenot ont suscité un grand intérêt de la communauté des neurosciences. Ces plates-formes de co-culture interconnectés peuvent être utilisés pour étudier une variété de questions, allant de la neurobiologie développementale et fonctionnelle à l&#39;infection et la propagation de la maladie. Cependant, les systèmes classiques nécessitent des apports importants cellulaires (plusieurs milliers par compartiment), l&#39;insuffisance de l&#39;étude des cellules de faible abondance, comme primaire nigra dopaminergique substance, les ganglions spirale, et les neurones de melanogaster de drosophile, et peu pratique pour l&#39;expérimentation à haut débit. Les cultures denses sont également hautement enchevêtrées localement, avec quelques excroissances (&lt;10%) interconnectant les deux cultures. Dans cet article, les protocoles microfluidiques et structuration simples qui sont décrits relever ces défis: (i) un seul neurone microfluidique méthode rangeant, et (ii) un procédé de masquage de l&#39;eau pour la modélisation de plasma revêtements de biomatériaux à REGIster neurones et favoriser l&#39;excroissance entre les compartiments. Co-cultures de neurones minimalistes ont été préparés avec de haut niveau (&gt; 85%) connectivité autre et d&#39;peuvent être utilisés pour des expériences à haut débit de la neurobiologie avec une précision d&#39;une cellule unique.

exploits de masquage de l&#39;eau de surface tension. La tolérance à la pression à l&#39;interface air-liquide échelles inversement avec le rayon de courbure [ <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Produisant des interfaces très stables à des dimensions microfluidiques. Les micropiliers ancrer efficacement le masque de l&#39;eau en place. formation d&#39;un masque de l&#39;eau est conduite par évaporation à partir des ports microfluidiques, avec l&#39;augmentation...

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Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Les protocoles pour seul neurone de formation de réseau microfluidique et le masquage de l&#39;eau pour le motif de revêtements de biomatériaux plasma dans la puce sont décrits. Co-cultures fortement interconnectés peuvent être préparés en utilisant les entrées de cellules minimales.

Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K vues.  ISAS.  Les protocoles pour seul neurone de formation de réseau microfluidique et le masquage de l'eau pour le motif de revêtements de biomatériaux plasma dans la puce sont décrits. Co-cultures fortement interconnectés peuvent être préparés en utilisant les entrées de cellules minimales. 

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Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Recherche

Neurosciences

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

D&#39;enregistrement optique de l&#39;activité neuronale supraliminaire avec une résolution à cellule unique et un seul pic

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerf-muscle co-cultures

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Une procédure d&#39;implantation de tableaux organisés de microfils pour enregistrements unitaires dans Awake, se comportant Animaux

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulaires enregistrement de l&#39;activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which macrophages are induced to produce conditioned medium (CM) that promotes neurite outgrowth. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are acutely dissociated and plated. After the neurons are stably attached, peritoneal macrophages are co-cultured on a cell culture insert overlaid on the same well. Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) is applied to the co-cultures for 24 h, after which the cell culture insert containing the macrophages is moved to another well to collect CM for 72 h. The CM from the co-cultures treated with db-cAMP, when applied to a separate adult DRG neuron culture, exhibits robust neurite outgrowth activity. The CM obtained from the db-cAMP-treated cultures consisting of single cell type alone, either DRG neuron or peritoneal macrophage, did not exhibit neurite outgrowth activity. This indicates that the interaction between neurons and macrophages is indispensable for the activation of macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity into CM. Thus, our co-culture paradigm will also be useful to study intercellular signaling in the neuron-macrophage interaction to stimulate the macrophages to be endowed with a pro-regenerative phenotype.

The current protocol presents experimental procedures to stimulate cultured macrophages to be endowed with capacity to release molecular factors that promote neurite outgrowth. Treatment of cAMP to the neuron-macrophage co-cultures induces the macrophages to produce conditioned medium that possesses strong neurite outgrowth activity.

Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other therapeutic strategies, there is currently no cure available for the injured or diseased brain. Cell replacement appears as a promising therapeutic strategy for neurodegenerative conditions. To this day, neural stem cells (NSCs) have been successfully generated from fetal tissues, human embryonic cells (ES) or induced pluripotent stem cells (iPSC). A process of dedifferentiation was initiated by activation of the novel human GPI-linked glycoprotein, which leads to generation of pluripotent stem cells. These blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) differentiate in vitro into cells with a neural phenotype as shown by brightfield and immunofluorescence microscopy. Ultrastructural analysis of these cells by means of electron microscopy confirms their primitive structure as well as neuronal-like morphology and subcellular characteristics.

We present a genetically modified-free (GM-free) method to obtain cells with a neuronal phenotype from reprogrammed peripheral blood cells. Activation of a signaling pathway linked to novel human GPI-linked protein reveals an efficient GM-free method for obtaining human pluripotent stem cells.

Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...