Les dispositifs microfluidiques utilisés pour compartimenter les neurones sont devenus un outil standard en neurosciences, permettant aux chercheurs de manipuler physiquement et chimiquement les régions subcellulaires des neurones, y compris les somata, les axones, les dendrites et les synapses. Ces dispositifs de culture compartimentés peuvent aider à répondre à de nombreuses questions dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les axones s’étendent pendant le développement pour former des synapses, comment les synapses se transforment et se reformer à la suite de dommages à l’axon et comment les conditions pathologiques peuvent se propager transsynaptiquement dans des maladies comme la maladie d’Alzheimer. Ce protocole décrit l’utilisation de la puce multicompartment en plastique préassemblée pour compartimenter les neurones primaires de rat de culture.
Le principal avantage de l’utilisation de ces puces est qu’elles fournissent une méthode facile à utiliser et hautement reproductible pour compartimenter les neurones. Un autre avantage est que ces puces produisent une croissance plus saine et à long terme des neurones et des axones isolés que les appareils compartimentés à base de silicium précédents et sont également compatibles avec la microscopie haute résolution. D’autres systèmes modèles, y compris les cellules souches humaines, peuvent également être cultivés dans la puce compartimentée préassemblée.
Pour commencer, placez une puce stérile et multicompartite dans une boîte de Pétri. Ajouter 100 microlitres d’une solution de précodage au puits supérieur gauche de la puce et lui permettre de circuler à travers le canal principal dans le puits adjacent. Ensuite, remplissez le puits inférieur gauche de la puce avec 100 microlitres de la solution de précodage.
Cette fois, attendez cinq minutes pour permettre à la solution de circuler à travers les micro-rainures. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de la solution de précodage au puits supérieur droit et laissez-le couler à travers le canal principal dans le puits adjacent. Après 90 secondes, remplissez le puits en bas à droite de 100 microlitres de la solution de précodage et incubez la puce pendant 10 minutes.
Inclinez soigneusement la pointe pipette, loin du canal principal et aspirez la solution de chaque puits. Ensuite, ajoutez immédiatement 150 microlitres de PBS au puits supérieur gauche et attendez une minute et demie. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS au puits inférieur gauche et attendez cinq minutes pour permettre au liquide de circuler à travers les micro-rainures.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS aux puits en haut à droite et en bas à droite, dans cet ordre. Après 10 minutes, aspirez à nouveau le PBS et répétez les étapes de lavage une deuxième fois. Après le deuxième lavage, aspirez le PBS des puits comme avant en balançant la pointe de pipette, loin de l’ouverture du canal.
Ensuite, ajouter 100 microlitres de 0,5 mélange par mil poly-D-Lysine solution, au puits supérieur gauche de la puce. Attendez une minute et demie, puis remplissez le puits inférieur gauche avec 100 microlitres de la solution Poly-D-Lysine. Répétez ce processus sur la moitié droite de la puce.
Fermez la boîte de Pétri. Ensuite, placez la puce dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, rincer la puce deux fois avec PBS comme décrit précédemment.
Ensuite, aspirez le PBS de l’appareil. Immédiatement, ajoutez 100 microlitres de médias de culture cellulaire au puits supérieur gauche de la puce. Après une minute et demie, ajouter les médias au puits inférieur gauche.
Attendez cinq minutes pour permettre aux médias de circuler à travers les micro-rainures, puis répétez le processus de remplissage sur le côté droit de la puce. Préparer une suspension cellulaire des neurones hippocampaux de rat dissociés selon les protocoles établis. Retirez la majorité des supports dans chaque puits de la puce, mais laissez les canaux remplis.
Ensuite, chargez immédiatement cinq microlitres de la suspension cellulaire dans le puits supérieur droit et cinq autres microlitres de suspension cellulaire dans le puits inférieur droit. Lors du chargement des cellules, pointer la pointe de la pipette vers le canal principal. Après le chargement des cellules, transférer la puce à un stade microscope et de s’assurer que les neurones sont dans le canal principal.
Après avoir attendu cinq minutes pour que les cellules s’attachent, ajoutez environ 150 microlitres de médias de culture neuronale à chacun des puits supérieurs et inférieurs à droite. Ajouter ensuite 150 microlitres de supports à chacun des puits supérieurs et inférieurs gauches. Couvrir la boîte de Pétri et placer la puce dans un plateau humidifié dans un incubateur de 5 % de dioxyde de carbone et de 37 degrés Celsius.
Tout d’abord, retirez 20 microlitres du puits inférieur gauche du compartiment axonal et placez-le dans le puits supérieur-droit du compartiment somatique. Attendez deux minutes pour que le débit à l’intérieur de chaque canal soit égalé. Ensuite, retirez 50 microlitres de supports du compartiment axonal et ajoutez 0,3 microlitre d’un millimolaire Alexa Fluor 488 hydrazide à ce média.
Pipette de haut en bas pour mélanger la solution, puis retourner les supports contenant le colorant fluorescent dans le compartiment axonal. À ce stade, placez la puce sur le microscope et l’image comme vous le souhaitez. Pour effectuer l’axotomie à l’intérieur de la puce, d’abord, retirez le média du compartiment axonal, en gardant la pointe pipette loin de l’entrée du canal principal.
Conservez les supports retirés dans un tube de centrifugeuse pour l’instant. Ensuite, placez la pipette d’aspiration près, soit l’entrée du canal principal du compartiment axonal et aspirer le compartiment axonal complètement. Continuer à aspirer la zone pendant une à deux minutes.
Remplacez le compartiment axonal par le supports stocké. Assurez-vous que la solution est complètement retirée du compartiment et que les axones sont sectionnés en regardant l’échantillon au microscope. Ensuite, couvrez la puce et retournez-la à l’incubateur.
Pour commencer l’immunostaining de fluorescence, enlevez la plupart des médias de la puce, gardant les compartiments intérieurs hydratés. Immédiatement, ajoutez 100 microlitres de solution de fixation aux puits supérieur des compartiments axonal et somatique. Après une minute, ajouter 100 microlitres de solution de fixation aux puits du fond et fixer les cellules pendant 30 minutes à température ambiante.
Retirez la majeure partie de la solution des puits et ajoutez immédiatement 150 microlitres de PBS à chacun des puits du haut des compartiments axonal et somatique. Attendez deux minutes pour que le PBS s’écoule dans les puits du fond, puis, retirez le PBS et rincez les puits deux fois plus en utilisant ce même processus. Après le dernier rinçage, retirez la plupart du PBS des puits de la puce et ajoutez immédiatement 150 microlitres de PBS avec 0,25% triton x-100 à chacun des puits supérieur des compartiments axonal et somatique.
Attendez 15 minutes, puis retirez la majeure partie du liquide des puits. Immédiatement, ajoutez 150 microlitres de solution de blocage à chacun des puits supérieur des compartiments axonal et somatique. Après 15 minutes, retirer la majeure partie du liquide des puits et immédiatement, ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps primaire, à chacun des puits supérieur des compartiments axonal et somatique.
Couvrir la puce pour minimiser l’évaporation et incuber les cellules dans l’anticorps primaire pendant une heure à température ambiante. Ensuite, rincez la puce en enlevant la majeure partie de la solution et en ajoutant immédiatement 150 microlitres de PBS à chacun des puits supérieur des compartiments axonal et sématique. Après cinq minutes, retirer le PBS des deux puits et répéter le rinçage deux fois de plus.
Maintenant, retirez la majeure partie du liquide des puits et immédiatement, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dans PBS, à chacun des puits supérieur des compartiments axonal et somatique. Couvrir la puce pour minimiser l’évaporation et incuber la puce pendant une heure à température ambiante. Comme indiqué précédemment, rincez la puce trois fois avec PBS puis, montez et imagez les puces telles que décrites dans le protocole texte qui l’accompagne.
Montré ici, est une comparaison côte à côte des neurones cultivés sur des puces en plastique et des dispositifs PDMS. La croissance neuronale est comparable dans les deux plates-formes jusqu’à 15 jours en culture, mais à des âges de culture plus longs, les axones isolés dans la puce en plastique, semblent plus sains avec moins de battements. Pour visualiser davantage les axones dans les compartiments axonal, ces échantillons ont également été immunodétachés pour la béta tubuline III, qui montre la croissance axonale saine dans les puces en plastique à 22 jours dans la culture.
D’autres taches avec des échantillons de 24 jours montrent des neurones cultivés dans les puces en plastique pour exprimer à la fois les marqueurs synaptiques excitatoires et inhibiteurs, vGlut1 et vGat. Voici les deux marqueurs synaptiques combinés avec des neurones mCherry étiquetés rétrogrades. Pour démontrer l’adéquation de cette puce pour les études sur les lésions et la régénération de l’axone, des neurones rétrogrades étiquetés ont été photographiés avant et 24 heures après l’axotomie.
Une ampoule de rétractation et un axon régénérant sont tous deux évidents après l’axotomie. Ces résultats sont équivalents aux données publiées à l’aide d’appareils basés sur PDMS. Les puces multicompartement classiques offrent une option facile à utiliser pour compartimenter les neurones qui fournissent des cultures neuronales à long terme, qui demeurent viables pendant plus de trois semaines.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de semer le nombre approprié de neurones et de s’assurer que votre incubateur est bien humidifié pendant la culture.
