authors gratefully acknowledge funding support from the Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR), and Fonds de Recherche du Qu&#233;bec &#8211; Sant&#233; (FRQS) (to MGF) and CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (to LDD).
The authors wish to thank Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard and Carmen Movila for technical assistance.

Soins aux animaux a suivi les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et de l&#39;approbation par le Conseil de l&#39;Université de Montréal sur la protection des animaux (protocole N ° 10-Rech-1560). Des informations détaillées sur les matériaux et les méthodes utilisées est fourni dans le tableau 1. 1. Anesthésie <ol><li> Insérer un cathéter à lumière unique dans une veine jugulaire. </li><li> Sedate la brebis utilisant acépromazine (Atravet 10 mg / mL) 2 mg par voie intraveineuse environ 30 min avant l&#39;induction de l&#39;anesthésie, afin de réduire le stress associé à la procédure qui à son tour réduit les niveaux de cortisol. </li><li> Administrer le diazépam (Diazepam 5 mg / ml) 20 mg, la kétamine (Ketalar 100 mg / ml) 05.04 mg / kg et de propofol (10 mg de propofol / mL) de 0,5 à 1 mg / kg par voie intraveineuse pour induire une anesthésie générale. </li><li> Insérer un cathéter d&#39;échange des voies respiratoires dans la trachée en utilisant un laryngoscope avec une lame de type Wisconsin (extra-longues de 350 mm Gauchers lame) pour faciliter l&#39;intubation avec. Faites glisser la sonde endotrachéale de silicium (diamètre de 9 à 12 mm Intérieur) hors du cathéter d&#39;échange des voies respiratoires et dans la trachée. Cette technique facilite le processus d&#39;intubation. Gonfler le ballonnet de la sonde endotrachéale avec soin pour éviter une ulcération de la trachée induite par la pression et fixer le tube à la tête de la brebis. </li><li> Branchez la sonde endotrachéale au circuit respiratoire de l&#39;appareil d&#39;anesthésie et de commencer immédiatement la ventilation mécanique. Réglez les paramètres de ventilation pour maintenir un P a CO 2 dans les limites normales de 35 à 45 mmHg. </li><li> Insérer un cathéter dans l&#39;artère auriculaire (22 à 20 g; 1 dans [0,9 x 25 mm] à 1,16 dans [1,1 x 30 mm]) et se connecter à tube non conforme à surveiller directement la pression artérielle. </li><li> Utilisez un moniteur physiologique multi-paramètre à enregistrer l&#39;électrocardiogramme, pression artérielle directe, la saturation en oxygène (SpO 2), la capnographie (P ET CO 2), et la température toutes les 5 min. Transférer tout physiologic données via un câble série à un ordinateur central de recueil des données physiologiques. Maintenir la température normale du corps en utilisant une couverture à circulation d&#39;eau. </li><li> Administrer une solution de poly-ionique équilibrée à 10 mL / kg pour la première heure de l&#39;anesthésie générale, puis de réduire à 5 ml / kg / h. </li><li> Administrer triméthoprime-sulfadoxine 5 mg / kg IV de la brebis juste avant l&#39;incision de la peau que l&#39;antibioprophylaxie. </li><li> Utilisez des techniques aseptiques en standard avec toutes les manipulations chirurgicales de la brebis et le fœtus. </li><li> Barrière infirmière les brebis à tout moment. Cela inclut également le personnel non-chirurgicales. Cela permettrait de minimiser le potentiel pour enzootique par exemple, Coxiella burnetii. Utiliser des gants et des masques N-95 (type) en tout temps. </li></ol> 2. Présentation de la procédure chirurgicale <ol><li> Faire une incision médiane de 20 cm à travers la paroi abdominale inférieure immédiatement crânienne à la mamelle par le biais de la ligne blanche pour minimiser les dommages des muscles abdominaux. <ol><li> Retract grand épiploon crânienne et les cornes utérines sont palpés manuellement. Palper chaque corne du corps de l&#39;utérus à la pointe de la corne de remarquer le nombre de fœtus et de leur taille. Si il ya plus d&#39;un fœtus, choisir le plus grand fœtus en évaluant manuellement la taille de la tête et la largeur entre les orbites. </li><li> Maintenir la tête du fœtus choisi fermement dans l&#39;utérus partiellement extériorisé. Effectuer un 10 cm hysterotomy sur la grande courbure avec des ciseaux de Metzenbaum. Mettez immédiatement au-dessus de la tête un gant chirurgical stérile sans latex rempli de solution saline stérile comme si elle était un coup de main. Sinon, utilisez 4x4 humides de garder la tête fœtale humide. Fixez l&#39;utérus à la paroi abdominale. <ol><li> Extérioriser les droites et gauches membres thoraciques et tirez doucement le foetus de l&#39;utérus jusqu&#39;à l&#39;appendice xiphoïde. </li></ol></li><li> Insérez cathéters de polyvinyle dans la droite et brachial gauche veine et les artères en utilisant une technique de coupe-bas standard. Insérez another polyvinylique cathéter dans la cavité amniotique fixateur par son extrémité sur le sternum du fœtus. <ol><li> Utilisez cathéters stériles seulement. Nous recommandons la stérilisation de gaz dans votre installation standard. Attacher chaque cathéter à une aiguille et l&#39;aiguille à une double robinet d&#39;arrêt pour permettre le prélèvement de sang ou plus tard surveillance de la pression. </li></ol></li><li> Suturer électrodes en acier inoxydable pour le manubrium, pointe du sternum et à chaque point de l&#39;épaule pour surveiller l&#39;électrocardiogramme (ECG). </li><li> Retour du fœtus dans l&#39;utérus. Tous les cathéters et les électrodes de sortie via une petite incision dans le flanc gauche. </li><li> Fermez la laparotomie utilisation d&#39;une fermeture à trois couches. Suturer la paroi abdominale avec un monofilament synthétique résorbable suture USP 2 en mode continu simple. Fermez l&#39;espace sous-cutanée avec un synthétique résorbable tressée USP 0 en mode continu simple. Utilisez chirurgicales agrafes en acier inoxydable pour fermer l&#39;incision de la peau. </li></ol></li><li&gt; Description détaillée de la procédure chirurgicale <ol><li> Retirer la laine en rasant le processus xiphoïde à la glande mammaire et le long du pli du flanc de chaque côté avec une lame # 40. Nettoyer l&#39;abdomen ventral puis à fond avec un gluconate de chlorhexidine à 4% et une brosse douce pendant 3 min. <ol><li> Effectuez un gommage stérile standard avec le gluconate de chlorhexidine 4% à partir du centre de l&#39;abdomen et de progresser de manière centrifuge pendant 3 min. Verser une solution saline stérile sur l&#39;abdomen pour enlever le savon désinfectant. Pour l&#39;étape finale de la préparation chirurgicale, effectuer trois passages alternés de solution de gluconate de chlorhexidine à 2% et de l&#39;alcool isopropylique à 70%. </li></ol></li><li> Vérifiez que la profondeur de l&#39;anesthésie est adéquat avant l&#39;incision. Faire une incision laparotomie norme de l&#39;ombilic à juste crânienne à la mamelle par le biais de la ligne blanche pour minimiser les dommages des muscles abdominaux. </li><li> Insérez une longue pince éponge dans l&#39;abdomen le long de la paroi abdominale gauche jusqu&#39;àà la position de sortie prévue pour les cathéters dans la région paracostal. <ol><li> Poussez les conseils de la pince contre le mur jusqu&#39;à ce qu&#39;un assistant peut localiser et confirmer le site approprié. Ouvrez légèrement (1 cm) les mâchoires de la pince et laissez l&#39;assistant faire une incision de 2 cm d&#39;épaisseur totale. </li><li> Extérioriser les conseils de la pince dans l&#39;incision, ouvrir à nouveau, et de saisir délicatement les cathéters avec la pince qui est finalement sorti de l&#39;abdomen à travers l&#39;incision abdominale ventrale. Fait à noter, certains groupes implanter les cathéters et extériorisent eux. Ceci présente l&#39;inconvénient que intraoperatorie surveillance ECG foetal est impossible. </li></ol></li><li> Palper l&#39;utérus pour déterminer la position et le nombre foetal. Déterminer le fœtus plus grand en utilisant la distance inter-auriculaire. Inciser la paroi utérine sur la grande courbure dessus du dos de la tête, en évitant les cotylédons. <ol><li> Insérez une canule émoussée à travers les membranes placentaires pour obtenir une améchantillon de fluide niotic sans hémorragie. Inciser les membranes placentaires l&#39;aide de ciseaux. </li></ol></li><li> Extérioriser la moitié du crâne du foetus à travers cette incision. Placez un gant en latex non chirurgical stérile rempli de solution saline stérile à 37 ° C sur la tête du fœtus pour aider à maintenir la normothermie. <ol><li> Lors du retrait de la partie supérieure du corps du foetus de l&#39;utérus, ont l&#39;assistant de tenir le haut de l&#39;Babcock pour éviter la perte de liquide amniotique. Puis, en utilisant de nouveau la pince Babcock, serrer les membranes fœtales et paroi utérine de la peau pour prévenir la contamination abdominale avec le liquide amniotique. </li><li> Exposer seules les parties du corps du foetus qui doivent être instrumenté et de garder les autres parties à l&#39;intérieur de l&#39;utérus ou couvertes par des tissus stériles chaudes et humides (37 ° C), respectivement. </li></ol></li><li> Enlever les deux membres thoraciques pour faciliter l&#39;exposition de l&#39;artère brachiale et la veine bilatéralement. Inciser le long de la face interne des deux antebrachium et les soinsdisséquer entièrement autour de l&#39;artère brachiale et la veine. </li><li> Insérez cathéters de polyvinyle dans le droit et les artères brachial gauche et le brachial gauche veine en utilisant une technique de coupe-bas standard. <ol><li> Libérer le navire à être sondé de tissus adjacents de plus de 1 cm. Ligaturer la partie distale du récipient avec une suture absorbable synthétique 2-0 USP tressé. Preplace une ligature à la partie proximale du navire, mais le garder déliée. <ol><li> Avec des ciseaux Castroviejo, couper transversalement le navire à environ 30% de son diamètre. Arrêter l&#39;écoulement de sang partiellement en tirant sur le fil de suture proximal. Insérer le cathéter dans une direction proximale. </li></ol></li><li> Insérez le polyvinyle cathéter jusqu&#39;à 8 cm proximalement ou jusqu&#39;à ce que la résistance est détectée puis tirez légèrement vers l&#39;arrière. Fixer temporairement l&#39;aspect proximal du cathéter à l&#39;aide d&#39;une pince vasculaire. Placer un autre fil de suture à la fois autour de l&#39;aspect proximal et distal du cathéter. Un assistant est en permanence aspirating et rinçage du cathéter pour assurer la perméabilité du cathéter. </li><li> Fermez la peau du fœtus en utilisant une suture tressée synthétique résorbable USP 2-0, avec un motif de suture continue. </li></ol></li><li> Pour le droit et l&#39;épaule gauche, manubrium et le processus xiphoïde, fixer une électrode en acier inoxydable isolé pour faciliter la surveillance de l&#39;ECG foetal. </li><li> Suturer la pression amniotique et l&#39;échantillonnage cathéter au sternum. Ce cathéter est fenêtrée à son extrémité. </li><li> Fixez tous les cathéters sur le dos du fœtus en utilisant une tresse matériel de suture absorbable USP 2-0 synthétique. </li><li> Avant le remplacement du foetus dans l&#39;utérus avant, le clenbutérol administrer 30 pg lentement IV plus de 15 min pour éviter une hypotension et pour fournir la relaxation de l&#39;utérus. </li><li> Suturer les membranes foetales utilisant USP 4-0 matériau tressé de suture absorbable synthétique avec un motif continu. Incorporer un seul cathéter ou électrode à la fois dans les closure pour assurer une fermeture étanche. Utilisez un modèle à double couche de Cushing en respectant les principes Halsted pour fermer la couche musculaire de l&#39;utérus en utilisant un matériau de suture USP 0 tressé synthétique résorbable. Enterrer soigneusement les noeuds chirurgicaux. </li><li> Utilisation d&#39;un modèle de suture en bourse, sécuriser tous les cathéters et les câbles ECG à leur sortie de l&#39;incision paracostal gauche. </li><li> Utilisation d&#39;un monofilament synthétique matériel de suture absorbable USP 2 sécuriser la ligne blanche avec un motif continu. Fermez les tissus sous-cutanés utilisant USP 2-0 tressé matériel de suture absorbable synthétique avec un motif continu. Fixez la couche de la peau avec des agrafes chirurgicales. </li><li> Administrer 250 mg d&#39;ampicilline par voie intraveineuse et à nouveau via le cathéter amniotique dans la cavité amniotique. Remplacez les liquides amniotiques perdus avec une solution saline chaude. </li><li> Placez tous les cathéters extériorisés et électrodes ECG dans un endroit sac pour maintenir la stérilité. Placez un jersey autour du torse de la brebis pour sécuriser toute la une de cathétersélectrodes D du corps de la brebis. </li><li> Arrêtez anesthésie générale, et l&#39;extubation la brebis fois réflexes laryngés sont revenues à la normale. </li><li> Retour à la brebis à une cage métabolique, une fois qu&#39;elle est stable après une anesthésie générale. La brebis résidera dans la cage métabolique pendant toute la durée de l&#39;expérience. La brebis doit être capable de se tenir debout, se coucher et manger ad libitum tout en surveillant le fœtus non-anesthésiés sans sédatif la mère. </li><li> Pour les trois jours suivants, administrer des antibiotiques à titre prophylactique pour la brebis (triméthoprime sulfadoxine 5 mg / kg) et le fœtus (250 mg d&#39;ampicilline par voie intraveineuse et à nouveau via le cathéter amniotique). </li><li> Évaluer l&#39;état métabolique des deux brebis et le foetus en utilisant analyses de sang gaz. </li><li> Rincez tous les cathéters avec le volume minimal de solution saline héparinée possible. Attention - Ne pas dépasser la dose quotidienne de l&#39;héparine et fluides admissible pour le fœtus. Il est possible de surcharger le fluide fœtus. Rincer une fois lentementune journée ~ 5 ml de NaCl par ligne après une prophylaxie antibiotique. </li></ol></li><li> L&#39;enregistrement et l&#39;analyse des données <ol><li> Pendant l&#39;opération, éventuellement enregistrer les taux de l&#39;ECG et cardiaques maternels et fœtaux ainsi que la mère de la pression artérielle et de la pression des voies aériennes (Paw) en continu (figure 1). Utilisez la fenêtre Moniteur vie pour acquérir toutes les données ECG maternels exception. Flux ces données dans le convertisseur analogique-numérique avec des signaux ECG foetaux et maternels; passer ECG maternelle et fœtale abord dans 1 901 pré-amplificateur. Enregistrer et afficher toutes les données dans le logiciel du fabricant. </li><li> Il suffit mL de l&#39;échantillon 1 artérielle simultanément à partir de la brebis et le foetus pour l&#39;analyse des gaz du sang artériel, le lactate, le glucose et l&#39;excès de base détermination (dans le plasma) en commencer de la chirurgie fœtale (immédiatement après l&#39;insertion du premier cathéter artériel) et après la fermeture de l&#39;utérus . </li><li> Lors de la récupération post-opératoire, prendre un 3 mL de l&#39;échantillon de sang fœtal pour mesurer l&#39;IL-6 et de TNF-α Inflammprofils toires. Centrifuger le plasma à 4 ° C (4 min, 4000 g), transférer et stocker le plasma à -80 ° C pour les tests ELISA ultérieure. Note: Pour l&#39;application des résultats représentatifs rapportés, six jours après la chirurgie, les animaux ont été sacrifiés en utilisant une injection intraveineuse de pentobarbital de sodium 20 mL. La croissance fœtale a été évaluée par le corps, le cerveau, le foie et le poids maternels. La durée de la période expérimentale varie évidemment en fonction du design choisi pour la question de recherche particulière, et peut atteindre ~ 6 semaines. </li></ol></li><li> Analyses de cytokines (étape optionnelle) <ol><li> Déterminer les concentrations de cytokine (IL-6, TNF-a) dans le plasma en utilisant un sandwich à-spécifique ovine ELISA. Des anticorps anti-mouton monoclonaux pré-couche souris (capture anticorps IL-6) ou anticorps monoclonal de souris anti-bovine (TNF-α) à une concentration de 4 pg / ml sur la plaque ELISA à 4 ° C pour O / N, après 3 fois laver avec du tampon de lavage (0,05% de Tween 20 dans du PBS, du PBST). </li><li>Bloquer les plaques pendant 1 h avec 1% de BSA dans du PBST. Laver les plaques avec du tampon de lavage 3 fois. </li><li> Utilisez des protéines recombinantes de moutons (IL-6, TNF-a) en standard ELISA, préparer un dilutions en série vont de la norme 1 de 2000 ng / ml à la norme 7 de 31,25 pg / ml. </li><li> Charge 50 pi de normes de protéines diluées en série et échantillons par puits et incuber pendant 2 heures à température ambiante, laver les plaques 3 fois. Exécuter toutes les normes et les échantillons en double. </li><li> Appliquer 50 pi d&#39;anticorps polyclonaux de lapin anti-mouton (anticorps de détection IL-6) ou le lapin anticorps polyclonal anti-bovine (TNF-a) à une dilution de 1: 250 dans des puits et incuber pendant 30 min à température ambiante. Laver les plaques avec le tampon de lavage 5 fois. </li><li> Ajouter 50 ul de la chèvre anti-lapin conjugué IgG-HRP (dilution 1: 5000) pendant 30 min. </li><li> Incuber avec 50 ul de solution de substrat TMB par puits. </li><li> Arrêtez couleur réaction de développement au moment désiré avec 25 pi de 2 N d&#39;acide sulfurique. </li><li> Lire la plAtes sur lecteur de plaque ELISA à 450 nm, avec une correction de longueur d&#39;onde 570 nm. Remarque: Au cours de nos essais, la sensibilité du test ELISA d&#39;IL-6 était de 16 pg / ml, la sensibilité du test ELISA de TNF-a était de 13,9 pg / ml, respectivement. Pour tous les essais, les intra-dosage et inter-dosage coefficients de variance a été &lt;5% et &lt;10%, respectivement. </li></ol></li><li> analyses statistiques Remarque: Les méthodes statistiques exacts dépendront de la question de recherche. Nous rapportons ici les méthodes utilisées pour tester les différences significatives dans les gaz du sang présentés dans le tableau 2. <ol><li> Testez la distribution normale des données en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov suivie par des tests paramétriques ou non paramétriques avec ajustement pour les comparaisons multiples, le cas échéant. </li><li> Utilisez K-moyens d&#39;analyse de cluster pour identifier les fœtus dans la cohorte qui étaient spontanément hypoxique et de déterminer le Pô 2 et O 2 valeurs Sam respectifs (considérer M 2 &lt;20 mmHg ou O 2 Sam &lt;55% fetal hypoxie). 44-48 </li><li> Utilisez un logiciel statistique comme SPSS pour les analyses. </li><li> Présenter les données sous forme de moyenne ± écart-type avec des différences statistique à p &lt;0,05 considéré comme significatif. </li></ol></li></ol>

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L&#39;anesthésique et les procédures chirurgicales sont présentés qui sont nécessaires à l&#39;établissement d&#39;un modèle animal pour l&#39;étude de la physiologie et de la pathophysiologie du fœtus: le mouton fœtal non-anesthésié chroniquement instrumentés. Quatre étapes critiques dans le protocole doivent être soulignés. Tout d&#39;abord, passer les cathéters et les électrodes à travers le flanc maternelle: il est important que cela soit fait à la fois d&#39;éviter...

Une variété de modèles animaux existent pour l&#39;étude de deux grossesses normales et compromis, y compris les rongeurs de laboratoire, les primates non humains et les ruminants domestiques. 1,2,3,4,5 La brebis gestantes chroniquement instrumentés a été largement utilisé pendant 50 ans un modèle de développement et les réponses foetal humain à des stimuli physiopathologiques tels que le lipopolysaccharide (LPS). 6-10 Les lésions après une exposition de LPS imitent exactement ce que l&#39;on voit chez les prématurés avec leucomalacie périventriculaire, qui est due à un profil de maturation similaire des deux espèces. 11, 12 Autres complications de la grossesse ont également été étudiés dans les moindres détails comme la découverte que les glucocorticoïdes prénatales promouvoir le développement du poumon 13-15 et la compréhension de l&#39;impact de la restriction de croissance intra-utérin (RCIU) sur le fœtus 16,17. L&#39;utilisation intensive du modèle de fœtus de mouton est due à la unique susceptibilité du mouton fœtal non-anesthésié à la mise en place et la maintenance des cathéters et des électrodes chirurgicale, ce qui permet le prélèvement de sang répétitif, l&#39;enregistrement de l&#39;activité bioélectrique, l&#39;application de la stimulation électrique et en imagerie cérébrale in vivo. 18 La télémétrie est également possible, bien que moins fréquemment utilisé encore en raison de la sophistication supérieur à mettre en place ainsi que le coût initial et de maintenance. 19 En outre, le modèle de fœtus de mouton est très polyvalent autant de variantes de l&#39;instrumentation sont possibles en fonction des mesures d&#39;intérêt. Par exemple, il est possible d&#39;enregistrer plus de jours à quelques semaines des signaux multivariés en temps réel tels que les mouvements fœtaux de respiration, l&#39;activité électrique du cerveau, les réponses cardiovasculaires, électrocardiogramme, le débit sanguin régional à une gamme d&#39;organes utilisant des sondes ou des microsphères flux, etc. Merci à cette polyvalence, un large éventail d&#39;études ont été menées, y compris le développement de la cardigansystème ovascular 20,21, hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS) 22, le développement du cerveau de développement et 23 états de sommeil en particulier 24, effets de l&#39;hypoxie / 25 asphyxie, hypothermie thérapeutique 26, inflammation 6-11, combinaison des deux 27, glucocorticoïdes 28,29, anti-dépresseurs 30, dysplasie broncho-pulmonaire (BPD) 31,32, programmation fœtale 33,34,35,36,37,38,39 ou le développement de nouvelles modalités de surveillance du fœtus avant et pendant le travail au nom mais à quelques domaines d&#39;investigation. 40,41,42,43 L&#39;objectif global de la méthode présentée est de montrer la mise en œuvre de base de ce modèle polyvalent. Il permet d&#39;établir une grande variété de protocoles expérimentaux aiguës et chroniques étudier la physiologie et la physiopathologie fœtal sur la intégrative, orgue, les niveaux cellulaire et moléculaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE Light source</td>
			<td>Schott-Fostec</td>
			<td>A20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060 - 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006 - 09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003 - 12</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scalpel blades #12</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10012 - 00</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16044 - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00272 - 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont SS forceps - angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203 - 25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided silk suture size 6-0</td>
			<td>Teleflex Medical</td>
			<td>07 - 30&#160; - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Tape</td>
			<td>transpore</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride 100 mg/ml</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409 - 2051 - 05</td>
			<td>Final Does is 80 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td>Vecdo</td>
			<td>NDC 50989 - 234 - 11</td>
			<td>Final Does is 10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive orange 14</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R - 8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Final Concentration: 118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217 - 3</td>
			<td>Final Concentration: 4.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P -285</td>
			<td>Final Concentration: 1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Jan-00</td>
			<td>Final Concentration: 0.57 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 310 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 5.95 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Final Concentration: 5.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED bioamplifier and ADC units</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited, 
			Unit 4, Science Park, 
			Milton Road, 
			Cambridge CB4 0FE 
			ENGLAND.</td>
			<td>Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurolog analog signal bioamplifier</td>
			<td>Digitimer Ltd 
			37 Hydeway 
			Welwyn Garden City 
			Hertfordshire, AL7 3BE, England</td>
			<td>NL108A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABL800Flex</td>
			<td>Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5804R</td>
			<td>Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 
			Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrow Jugular Catheterization Set</td>
			<td>Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atravet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazepam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketalar</td>
			<td></td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SurgiVeT</td>
			<td>Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters</td>
			<td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Ventilator</td>
			<td>Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte-W</td>
			<td>Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA</td>
			<td></td>
			<td>22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow LW6000</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Babcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl catheters</td>
			<td>SCI (Scientific Commodities Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrocardiogram (ECG)</td>
			<td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>four copper electrodes in single sheath, 2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS II USP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim sulfadoxine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Argon Medical, Cat&#160;041220001A</td>
			<td></td>
			<td>Double 4-way Stopcock with male luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202389</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202322</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instrumentation of near-term fetal sheep for multivariate chronic non-anesthetized recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as endotoxins, bacteria, umbilical cord occlusions, hypoxia and various pharmacological treatments. The life-saving clinical practices of glucocorticoid treatment in fetuses at risk of premature birth and the therapeutic hypothermia have been developed in this model. This is due to the unique amenability of the non-anesthetized fetal sheep to the surgical placement and maintenance of catheters and electrodes, allowing repetitive blood sampling, substance injection, recording of bioelectrical activity, application of electric stimulation and in vivo organ imaging. Here we describe the surgical instrumentation procedure required to achieve a stable chronically instrumented non-anesthetized fetal sheep model including characterization of the post-operative recovery from blood gas, metabolic and inflammation standpoints.

38 brebis de temps datée enceintes ont été instrumentés à 128 ± 2 jours de gestation (DGA, ~ 0,88 gestation, terme 145 DGA) avec artérielle, veineuse et cathéters amniotique et l&#39;électrocardiogramme (ECG) électrodes avec une technique stérile sous anesthésie générale (deux brebis et le fœtus ). En cas de grossesse gémellaire le plus grand fœtus a été choisi sur la base de la palpation et estimer le diamètre intertemporelle; alternativement, le fœtus doit être instrumenté peut être choisi au h...

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Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

Le modèle chroniquement instrumentés de fœtus de mouton non anesthésié est utilisée pour étudier le développement du fœtus humain dans la santé et la maladie, car elle permet le placement chirurgical et l&#39;entretien des cathéters et des électrodes, prises de sang répétitif, l&#39;injection d&#39;une substance, un enregistrement de l&#39;activité bioélectrique et l&#39;imagerie in vivo. Nous décrivons les procédures nécessaires pour établir ce modèle.

Instrumentation de Near terme fœtus de mouton pour multivariées chroniques enregistrements non anesthésiés

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K vues.  CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC.  Le modèle chroniquement instrumentés de fœtus de mouton non anesthésié est utilisée pour étudier le développement du fœtus humain dans la santé et la maladie, car elle permet le placement chirurgical et l'entretien des cathéters et des électrodes, prises de sang répétitif, l'injection d'une substance, un enregistrement de l'activité bioélectrique et l'imagerie in vivo. Nous décrivons les procédures nécessaires pour établir...

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Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l&#39;épididyme

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intraveineuse amniotique et In Utero une Transplantation chez le modèle murin

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Échographie de haute fréquence pour l’analyse du développement foetale et placentaire In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

Culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Récapituler la transition de lassuck au soudement in Vitro à l'aide d'organoïdes intestinaux fœtaux

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). Following TO, retention of the secreted epithelial fluid increases luminal pressure and induces lung growth. Various animal models have been defined to understand the pathophysiology of CDH and TO. All have their own advantages and disadvantages such as the difficulty of the technique, the size of the animal, cost, high mortality rates, and the availability of genetic tools. Herein, a novel transuterine model of murine fetal TO is described. Pregnant mice were anesthetized, and the uterus exposed via a midline laparotomy. The trachea of selected fetuses were ligated with a single transuterine suture placed behind the trachea, one carotid artery, and one jugular vein. The dam was closed and allowed to recover. Fetuses were collected just before parturition. Lung to body weight ratio in TO fetuses was higher than that in control fetuses. This model provides researchers with a new tool to study the impact of both TO and increased luminal pressure on lung development.

Various animal models of congenital diaphragmatic hernia and fetal tracheal occlusion present advantages and disadvantages regarding ethical issues, cost, surgical difficulty, size, survival rates, and availability of genetic tools. This model provides a new tool to study the impact of both tracheal occlusion and increased luminal pressure on lung development.

Modèle transuté d’occlusion trachéale foetale chez la souris

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vitrification d’ovocytes mûris in vitro prélevés sur des ovaires adultes et prépubéraux chez des moutons

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...