Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les télomères, tels que la levure télomérique non codant ARN TERRA localisation, et je peux insister sur le fait que c’est télomères d’origine ou en trans, un cromes-mants différents Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs de visualiser les molécules TERRA exprimer à partir d’un seul télomères dans les cellules vivantes. Claudio Oss Pegorar et Nicole Bettin, deux étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer à développer des cellules AGS selon le protocole de texte.
Puis quand les cellules atteignent 50 à 60%confluence les transpect avec sgRNA Cas9 exprimant vecteur et la cassette MS2. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par un milieu contenant de la néomycine. Après cela ajouter 10 microlitres de 0,25%Tripsyn à chaque puits d’une plaque de puits 96.
À l’aide d’un microscope et d’un marqueur, marquer la position de chaque clone visible dans le plat. Remplacez le milieu de culture Neomycin par suffisamment de PBS pour former un mince film de liquide sur les clones. À l’aide d’une pipette de 10 microlitres contenant cinq microlitres de trypsine, relâchez lentement la trypsine sur la colonie.
Laissez la trypsine détacher les cellules pendant une minute. Grattez la colonie avec la pointe, et aspirez-la dans la pointe. Après cela, transférer les cellules de la colonie dans un puits de la plaque de puits 96.
Incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Remplissez ensuite le puits de 150 microlitres de milieu sélectif. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de gélatine à chaque puits de trois plaques de puits de 96 puits.
Incuber les assiettes à température ambiante pendant 30 minutes et laver les assiettes avec du PBS deux fois. Après que les clones atteignent 90% de confluence, aspirer le milieu de chaque puits de la plaque, et laver la plaque avec PBS. Ajouter ensuite 30 microlitres de trypsine à chaque puits, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, ajoutez 70 microlitres de milieu sélectif à chacun des puits. Perturbez les cellules en descendant de haut en bas. Transférer 30 microlitres du mélange au puits de la plaque d’ADN gélatiné contenant 120 microlitres de milieu sélectif.
Transférer ensuite 30 microlitres du mélange dans la plaque de congélation gélatincée contenant 50 microlitres de milieu. Placez l’ADN dans l’incubateur, et laissez les cellules se développer à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent 90% de confluence. Après cela, ajouter 80 microlitres de congélation glacée moyenne à chaque puits de la plaque de congélation.
Sceller la plaque avec du parafilm, remplacer le couvercle et envelopper la plaque dans du papier d’aluminium. Ensuite, gardez les plaques de congélation à 80 degrés Celsius. Après que les clones dans la plaque d’ADN atteignent 90% de confluence, lavez la plaque avec PBS deux fois.
Puis lyse les cellules avec 50 microlitres de tampon lyse. Couvrir la plaque de parafilm, remplacer le couvercle et envelopper la plaque dans un enveloppement saran. Après cela, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, ajoutez 100 microlitres de solution de chlorure de sodium à chaque puits et autorisez les précipitations d’ADN pendant six heures ou toute la nuit à température ambiante. Puis inverser la plaque et la laver trois fois avec 200 microlitres d’éthanol 70% par puits. Ajouter 20 microlitres de solution RNase A à chaque puits de la plaque, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Après cela, utilisez trois microlitres d’ADN génomique pour l’amplification PCR, et configurer la machine PCR. Cultivez les clones positifs PCR dans six plaques de puits selon le protocole de texte. Une fois que les clones atteignent 90% de confluence, lavez les cellules avec PBS, et ajoutez 250 microlitres de tampon de lyse avec Proteinase K à chaque puits.
Utilisez un grattoir cellulaire pour gratter les cellules et transférez le Lysate dans un tube de 1,5 millilitre. Incuber le Lysate à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Ajouter un millilitre d’éthanol au Lysate et agiter vigoureusement.
Permettre aux clones de se développer en F-12K moyen selon le protocole de texte. Ajoutez ensuite l’adénovirus exprimant le Cre aux cellules une fois qu’ils atteignent 70% de confluence. 48 heures après l’infection, diviser les cellules en trois plats de 10 centimètres.
Puis la culture des troisièmes plats pour la congélation cellulaire, et l’extraction de l’ARN. Tout d’abord, plaquez les clones TERRA-MS2 et les cellules AGS de type sauvage dans des plats de fond en verre. Ajoutez ensuite le polybrene et le MS2-GFP exprimant le rétrovirus au milieu.
Après 24 heures jeter le milieu contenant le rétrovirus, et ajouter un milieu frais sans phénol rouge pour les cellules. Enfin, à l’aide d’un microscope inversé et d’une image de caméra sensible, les cellules ont l’objectif et l’ouverture appropriés. Dans ce protocole, des clones de cellules cancéreuses contenant une étiquette de séquence MS2 à un seul sous-telomere ont été créés et photographiés.
Les clones résistants à la néomycine ont été examinés à l’aide de PCR. Les clones positifs ont été cultivés à lysed pour l’extraction génomique d’ADN et l’analyse méridionale de tache. Les clones positifs à la PCR et à l’analyse des taches du Sud ont été infectés par le CRE-GFP exprimant l’adénovirus afin d’éliminer le gène néomycine présent dans la cassette MS2.
Une fois que l’élimination du gène de résistance à la néomycine a été confirmée, l’ARN extrait des clones a été testé pour l’expression des transcriptions terra-MS2. Afin de visualiser les transcriptions terra-MS2 dans les cellules vivantes par microscopie confoccale, les clones sélectionnés ont été infectés par un rétrovirus exprimant une protéine de fusion MS2-GFP. Les transcriptions et les télomères TERRA-MS2 ont été simultanément visualisés dans les cellules vivantes par microscopie confoccale en co-exprimant la protéine de fusion MS2-GFP et une protéine liant les télomères fusionnés mCherry, TRF2, chez les clones sélectionnés.
Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de faire tous les efforts possibles pour sélectionner un seul clone au lieu d’une population mixte de clones. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme un FISH d’ADN sur les propagations chromosomiques, peuvent être utilisées afin de visualiser l’intégration de la cassette MS2 dans les cellules fixes. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie à des chercheurs dans le domaine des télomères pour explorer la localisation cellulaire des molécules terra telomere unique dans les cellules humaines vivantes.
N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs viraux et des matières radioactives peut être extrêmement incertain. Et des précautions, telles que le port de manteaux de laboratoire, gants et l’utilisation de boucliers en plexiglas pour minimiser les radiations doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
