Nous tenons à remercier Alex Hitchen et Meg Booth pour leur aide avec les essais d&#39;accouplement. Ce travail a été soutenu par le NERC subvention NE / H015604 / 1 à TP.

1. Préparation de Fly alimentaire avec du colorant alimentaire <ol><li> Prenez un flacon Drosophila standard avec environ 20 ml de nourriture dans le fond (figure 1). Utilisation suivant la recette de mélange de la nourriture en utilisant 1 litre d&#39;eau bouillante: 10 g de gélose, 85 g de dextrose, 60 g de farine de maïs, 40 g de levure, et on agite pendant 5 min de fermenter. Ajouter 25 ml de 10% nipagen une fois que le mélange est refroidi à 75 ° C. </li><li> Après la nourriture a refroidi et solidifié ajouter deux gouttes (environ 0,5 à 1 ml) de colorant alimentaire bleu en haut de la nourriture et répartis sur toute la surface du flacon (Figure 1). Utilisez un colorant de couleur différente si l&#39;on préfère. </li><li> Laisser la nourriture pendant deux jours dans le réfrigérateur afin que le colorant est absorbé par la couche supérieure de la nourriture; cela évite d&#39;endommager l&#39;humidité excessive vol pendant la période de maturation. Ajouter un petit morceau de papier de soie si l&#39;humidité excessive est toujours un problème pour éponger l&#39;humidité supplémentaire et ensuiteenleve le. </li><li> Transfert d&#39;oiseau sur les aliments individuellement ou en groupes. Remarque: Les mouches gagneront coloration intestinale sein un jour d&#39;être placé sur la nourriture. En variante, mûrir pleinement les mouches sur la nourriture teints avant l&#39;expérience (augmentation de la mortalité pendant la période de maturation n&#39;a pas été observé de l&#39;exposition à colorant alimentaire). </li><li> Vérifiez que les mouches teints peuvent être facilement distingués des mouches non teints. Se ils ne peuvent être distingués, répétez les étapes 1.1 à 1.4 en utilisant soit une concentration plus élevée de colorant, ou un colorant différent. </li></ol> 2. Deux essais d&#39;accouplement mâles, en utilisant colorant alimentaire <ol><li> Pour produire des descendants, configurer plusieurs flacons contenant des paires de mouches mâles et femelles (petits groupes de mâles et les femelles sont également appropriés, bien prendre soin d&#39;éviter l&#39;entassement des larves). Autoriser les femelles à pondre des oeufs et se déplacent les mouches à de nouveaux flacons tous les 5-7 jours. flacons de conserver à une température appropriée pour les espèces d&#39;intérêt (22 ° C fou D. pseudoobscura et D. subobscura et 25 ° C pendant D. melanogaster). </li><li> Avant de recueillir les mouches expérimentales supprimer toutes les mouches des flacons de collecte à un temps de jeu avant de recueillir des mâles et des femelles pour se assurer qu&#39;ils seront vierges (D. melanogaster - 6 h à 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 h à 22 ° C, et D. subobscura - 24 h à 22 ° C). Remarque: Si les mouches ne sont pas vierge cette volonté biais de leur comportement lors des essais d&#39;accouplement 15. <ol><li> Store et mâle adulte individuellement dans des flacons mm en plastique standard 75 x 20 (~ 20 ml contenant de la nourriture). Cela évite les effets négatifs sur le comportement d&#39;accouplement mâle et remise en forme vu chez certaines espèces où les mâles sont gardés en groupes 16. </li><li> Exposer la moitié des hommes du traitement désiré (CO 2 anesthésie dans ce cas). Utilisez un tapis de CO 2 ou appuyez sur pour exposer les mouches pendant le temps nécessaire. moitié de magasin du males dans chaque traitement sur les aliments de couleur jusqu&#39;à ce que l&#39;accouplement a lieu. Cela leur permettra de distinguer visuellement au cours des essais d&#39;accouplement. </li><li> Pour transférer vol utilisent un aspirateur 17. Étiqueter chaque flacon pour identifier à la fois le traitement et l&#39;état de couleur du mâle. Ici, utiliser quatre traitements (anesthésie, non-couleur = G-NC, l&#39;anesthésie, de couleur = GC, sans anesthésie, non coloré, NG-NC, et aucune anesthésie, coloré, NG-C). </li></ol></li><li> Transfert femelles nouvellement écloses dans des flacons de produits frais à mûrir en tant que groupes de dix. </li><li> Permettre aux mouches de mûrir à l&#39;âge d&#39;accouplement (D. melanogaster - 3 jours, D. pseudoobscura - cinq jours, D. subobscura - 7 jours 18 magasin vole à une température appropriée pour les espèces étudiées (par exemple, 22 ° C D. . pseudoobscura et D. subobscura et 25 ° C pendant D. melanogaster). </li><li> Déplacez les femelles à des flacons individuels (suiteaining ~ 20 ml de nourriture) un jour avant le procès d&#39;accouplement pour l&#39;acclimatation à la fiole d&#39;accouplement. Marquez ces flacons de telle sorte que les flacons peuvent être différenciés. Soyez prudent pour aveugler l&#39;expérience en utilisant l&#39;étiquetage neutre (ce est à dire, de 1 à 150) de sorte qu&#39;il ne est pas possible de deviner l&#39;identité de vol dans ne importe quel flacon. Remarque: La personne qui met les mouches dans chaque flacon devra connaître l&#39;identité de vol placés dans chaque flacon, elles signaleront dont le traitement a été souillé. Cependant, l&#39;observateur qui regarde l&#39;accouplement ne doit pas connaître leur identité. Pour ce faire, au moins deux expérimentateurs seront nécessaires, une à installer et une à observer. </li><li> Commencer les essais d&#39;accouplement entre 10 à 12 heures du matin, ou à un moment qui coïncide avec la lumière venant dans le cycle lumière / obscurité vol sont exposés à («aurore» pour les mouches). Ajouter deux mouches mâles à chaque flacon d&#39;accouplement (contenant une seule mouche femelle) à l&#39;aide d&#39;un aspirateur. Veiller à ce que les deux hommes sont de différents traitements (anesthésie oucontrôle) et que l&#39;on a coloration intestinal pour permettre de les différencier les uns des autres, et notez ce qui est mâle coloré. </li><li> Si l&#39;accouplement a lieu, enregistrer l&#39;état de l&#39;homme qui se accouple (soit en couleur ou non - de couleur). Si les essais durent 2 h, assument la femelle ne se accoupler. Note: 2 h est approprié pour ces espèces, mais d&#39;autres Drosophila peut avoir besoin de plus ou moins de temps. </li></ol> 3. seul mâle essais d&#39;accouplement <ol><li> Pour les essais Homme seul, répéter protocole n ° 2 avec deux changements: <ol><li> Dans l&#39;étape 2.3 ne gardez pas les hommes sur les aliments de couleur. </li><li> A l&#39;étape 2.7, ajouter un seul mâle à chaque flacon. </li></ol></li><li> A l&#39;étape 2.8, enregistrer le temps à la volée est ajouté à la fiole, le démarrage de l&#39;accouplement et le temps l&#39;accouplement terminé devraient être enregistrées. De ces valeurs, calculer succès de l&#39;accouplement, la latence, et la durée. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Utilisez le paquet de statistiques approprié pour analyse. Si les données sont normales et ne ont que deux traitements, utiliser des tests t ou modèle équivalent linéaire généralisé (GLM). Pour deux expériences de sexe masculin, utiliser des tests binomiale ou un GLM binomial qui sont disponibles dans un paquet de statistiques de base. Remarque: Pour les données d&#39;exemple, toutes les analyses ont été effectuées dans la version 3.0.3 R 19. </li><li> Vérifiez les données accouplement de latence et la durée de l&#39;accouplement de la normalité, en traçant histogrammes de fréquence des temps de latence et la durée pour chaque traitement 20, et en utilisant un test de normalité comme Shapiro-Wilk. Si ce ne est pas normal, transformer ou utiliser statistiques équivalentes non paramétriques 20. Remarque: Pour les données d&#39;exemple des expériences simples masculins transformation logarithmique a rencontré les exigences de normalité et d&#39;égalité des variances. </li><li> Si les données peuvent être normalisées, utilisation des tests t pour examiner les différences entre l&#39;accouplement et la durée de latence dans les simples essais d&#39;accouplement mâles en utilisant deux traitements 21. Si plusieurs traitements sont utilisés,essayez une analyse de variance (Anova) 20. Si les données ne peuvent être normalisées, essayez des tests non paramétriques équivalentes 21. </li><li> Utilisez les tests binomiaux pour tester un effet de soit colorant alimentaire ou de CO 2 anesthésie sur le succès d&#39;accouplement des mâles concurrents 20. Si plusieurs traitements sont utilisés, comme ce est le cas avec les données d&#39;exemple, utiliser un GLM avec une structure d&#39;erreur binomiale 21. </li><li> Pour les deux essais de sexe masculin dans les données d&#39;exemple, utilisez GLM avec des structures d&#39;erreur binomiale. Un GLM examiné couleur comme une variable de réponse (couleur = 0 et non-couleur = 1) avec des espèces, l&#39;état de gaz, et le traitement de gaz monté en explicative variables.One GLM examiné CO 2 comme une variable de réponse (gazés = 0 et non-gazés = 1) avec des espèces, l&#39;état de la couleur, et de traitement de gaz équipés. Dans chaque cas, produire le modèle maximale, et effectuer simplification du modèle basé sur 20 AIC. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ces données montrent que l&#39;impact de CO 2 anesthésie est incompatible entre les espèces, avec deux des trois espèces présentant peu d&#39;impact. Nos résultats suggèrent étiquetage avec un colorant alimentaire a eu un impact plus faible sur le succès de l&#39;accouplement mâle que le CO 2 anesthésie pour D. melanogaster. Ces expériences démontrent que les colorants alimentaires peuvent facilement et à moindre coût être utilisés pour marquer les mouches pour des essais d&#39;accouplement impliquant plusieurs mâles. Parmi les trois modèles espèces Drosophila examiné, seulement D. melanogaster a montré un effet de CO 2 anesthésie sur l&#39;accouplement dans une situation concurrentielle. En revanche, aucune des espèces a montré un effet de la collecte sur le gaz dans les essais d&#39;accouplement simples en termes de temps de latence accouplement, contrairement aux résultats précédents pour D. 5 melanogaster. L&#39;effet de la concurrence pourrait donc être en soulignant les effets de conditionnement physique plus subtiles de CO 2 anesthésie, qui ne sont détectablesdans des situations où la concurrence est mâle-mâle. Exposition au début de la collecte et un jour avant le procès ont un effet négatif sur la capacité des hommes de D. melanogaster pour gagner un accouplement. Exposition deux jours avant le procès mais n&#39;a pas montré d&#39;effet. Tant D. pseudoobscura et D. subobscura n&#39;a montré aucun effet de l&#39;exposition au gaz dans l&#39;un des essais. Une explication est que D. melanogaster était vulnérable à l&#39;exposition précoce à CO 2, car il doit être collecté tôt dans la vie (0 - 6 h vieux) que les autres espèces pour se assurer mâles sont vierges. Ainsi mâle D. melanogaster de cet âge peut être plus sensible que la cuticule de la mouche est encore durcissement, par rapport aux autres espèces qui ont eu longtemps pour leur cuticule à durcir. En général, cela soutient l&#39;idée que les effets du CO 2 anesthésie sont des espèces spécifiques et les enquêteurs devraient tester correctement l&#39;effet dans leurs espèces cibles. Currently, la majorité des travaux sur l&#39;effet de CO 2 anesthésie a été réalisée sur Drosophila melanogaster 5,11,22 et donc peut-être pas approprié d&#39;appliquer à d&#39;autres espèces apparentées. Procédé non invasif pour différencier variante présentée vol est un colorant alimentaire. Les résultats suggèrent ce traitement n&#39;a eu aucun effet en travers toutes les espèces examinées. Toutefois, bien que son utilisation a réussi à fournir un marqueur pas cher et facilement visible pour distinguer entre les individus, il convient de noter que le colorant était plus facile à distinguer dans D. pseudoobscura et D. subobscura que dans D. melanogaster. Précédent auteurs ont utilisé plusieurs couleurs (rouge, vert et bleu) 4,6. Nous avons trouvé coloration bleue d&#39;être les plus faciles à distinguer dans toutes les espèces, en particulier D. pseudoobscura et D. subobscura. En utilisant plusieurs couleurs serait éventuellement permettre des expériences plus complexes avec plusieurs flie marqués individuellements. Cependant, des tests préliminaires de différents colorants sont essentiels, comme certains colorants alimentaires ne parviennent pas à colorer les mouches, pouvant être digéré lorsqu&#39;ils sont consommés. D&#39;autres colorants peuvent avoir des effets toxiques et réduire la survie des mouches, et doivent être évités 14). Méthodes de colorants alimentaires alternatifs utilisant des colorants plus chers ont également été utilisés pour examiner l&#39;intégrité intestinale pour D. melanogaster 23. Ceux-ci peuvent fournir une alternative, bien que plus coûteux, procédé de teinture 23. La méthode de teinture est aussi rapide que le CO 2 aile écrêtage que les mouches peuvent être stockés sur la nourriture teinte de la collection. L&#39;absorption de la nourriture était rapide (~ 3 h), afin que le stockage O / N sur les aliments de couleur serait également suffisante pour marquer les mouches, tel qu&#39;il est utilisé dans d&#39;autres études 6. Toutefois, la durée de la coloration est relativement courte (~ 4-5 h) par rapport à l&#39;écrêtage de l&#39;aile (permanente) ou de la poussière marquage fluorescent (10-12 jours) 24. Comme espèces Drosophilavarient en apparence, différents colorants seront plus ou moins efficaces pour différentes espèces, et comme certaines souches (par exemple, les mutants knock-out) peuvent être vulnérables aux changements dans le régime alimentaire, l&#39;utilisation d&#39;un colorant nécessite un test préliminaire de son efficacité en particulier si plus exposition à long terme à des colorants peut être toxique 14. A la différence de l&#39;étude par Kalaw et al. 14, nous avons trouvé aucune mortalité significative après un stockage de plusieurs jours sur les aliments colorés pour D. melanogaster (3 jours), D. pseudoobscura (5 jours), ou D. subobscura (7 jours), probablement en raison de la différence de colorant utilisé. L&#39;étape critique pour une bonne utilisation de la technique de colorant est l&#39;étape 1.5, en validant ce que le colorant choisi fonctionne bien avec l&#39;espèce et la souche utilisée. Une autre technique consiste à appliquer de la poussière de couleur à l&#39;extérieur de la mouche avant l&#39;utilisation dans des expériences sur le terrain 24. Cette méthode a été utilisée pour le suivi des individus dans le domaine en raison to la durée de marquage et la facilité de la masse de marquage 24 mouches. Bien que nous ne avons pas explicitement testé cette méthode dans des essais d&#39;accouplement, il serait important d&#39;examiner les effets que la poussière pourrait avoir sur les sens importants dans l&#39;accouplement, en particulier chez la drosophile 25, 26. Chez les espèces, cependant, où la teinture intestinale ne est pas possible, ces méthodes pourraient convenir. En conclusion, nous avons constaté que dans deux des trois espèces testées (D. et D. pseudoobscura subobscura) n&#39;a été trouvée soit de CO 2 anesthésie ou colorant alimentaire sur la capacité d&#39;accouplement des mâles aucun effet. Pour D. melanogaster un effet négatif de CO 2 anesthésie a été détectée, mais colorant alimentaire n&#39;a pas affecté succès de l&#39;accouplement de cette espèce. Dans l&#39;ensemble, le procédé de teinture fournit un procédé simple et non invasive et pas cher pour identifier Drosophila individu qui est équivalente ou supérieure à celle des méthodes qui nécessitent CO 2 anesthésie. Ilest probablement cette méthode fonctionne à travers une gamme d&#39;espèces.

Au cours des dernières décennies, il a été un intérêt croissant dans la façon dont la sélection et la compétition sexuelle entre les hommes impact sur ​​l&#39;évolution de 1,2. Les expériences sur le comportement d&#39;accouplement ont joué un rôle important dans le développement et tester des théories de la sélection sexuelle 3,4. En particulier les espèces, de recherche utilisant du genre Drosophila, a grandement contribué à la compréhension de la sélection sexuelle et le comportement. Cependant, il est important de déterminer si des techniques couramment utilisées pourraient biaiser artificiellement les résultats d&#39;expériences d&#39;accouplement 5,6 standards. L&#39;anesthésie est souvent utilisé pour la manipulation et l&#39;identification dans des expériences 7. Par exemple, les mouches sont généralement collectés avant l&#39;accouplement, ou triés dans génotypes ou traitements expérimentaux utilisant du dioxyde de carbone (CO 2) anesthésique. Dans les expériences où deux ou plusieurs personnes doivent être distingué, il est de pratique courante pour anesthésier la fls et clip partie de l&#39;aile hors d&#39;identifier chaque individu, groupe ou le traitement 5,8. Il est essentiel, cependant, de comprendre comment CO 2 traitement aura une incidence sur le comportement. L&#39;effet de l&#39;anesthésie de CO 2 a été examiné dans Drosophila melanogaster dans laquelle les mâles exposés au CO 2 a pris beaucoup plus de temps pour se accoupler et globale eu du succès d&#39;accouplement inférieure que les hommes ou les hommes non-anesthésié anesthésiés en utilisant l&#39;exposition au froid 5. Cet effet a été observé à la fois lorsque l&#39;anesthésie a été appliquée sur le jour de l&#39;expérience et lorsque les mouches ont reçu un jour à récupérer. Cependant, cette étude a été limitée dans les essais ne examinant où un seul mâle a été présenté à chaque femelle 5. Un scénario plus réaliste est pour une femme de rencontrer plusieurs mâles 9,10, permettre la concurrence entre les hommes, ce qui pourrait permettre la détection des pertes plus subtiles de remise en forme masculine due à l&#39;anesthésie. L&#39;utilisation de CO 2 a également anesthésiefr trouvé pour réduire la fécondité et la longévité des adultes D. melanogaster quand ils sont exposés peu de temps après l&#39;éclosion, comme ce est souvent lors de la collecte vierge vole 11. Une alternative à l&#39;anesthésie CO 2 est de marquer les mouches en les nourrissant d&#39;aliments colorés avec un colorant 4,6,10,12,13. Ce colorant pénètre dans l&#39;intestin de la mouche et est visible à travers l&#39;abdomen, ce qui permet mouches de couleur pour être distingués de vol non colorés ou marqués de vol avec une couleur différente. Les méthodes diffèrent dans la manière dont cela peut être appliqué: d&#39;être ajouté directement à l&#39;aliment 12, par l&#39;intermédiaire de la pâte de levure-teinte complémentaire 6, ou par exposition à une nouvelle teinte substrat de produit alimentaire 13. Ces techniques de marquage semblent montrer aucun effet sur ​​4,6 de la capacité d&#39;accouplement. Cependant, un document examinant directement les effets de la même colorant alimentaire sur adultes D. melanogaster a trouvé une forte réduction de la durée de vie 14. Des travaux antérieurs ont également porté almost entièrement D. melanogaster, à la fois en ce qui concerne les effets de l&#39;anesthésie de CO 2 5,11 et colorant alimentaire 14 méthodes. Actuellement, il ya peu d&#39;informations sur la façon dont le CO 2 anesthésie ou l&#39;utilisation de la coloration intestinale affecte le comportement d&#39;accouplement des autres drosophile. L&#39;étude suivante évalue l&#39;effet de CO 2 anesthésie sur le comportement d&#39;accouplement de trois espèces de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, et D. subobscura). L&#39;effet de la collecte des mouches sur le CO 2 a été examiné à la fois simple et deux essais d&#39;accouplement mâle. L&#39;effet de CO 2 a également été trouvé pour varier en D. melanogaster 5 et ainsi de différentes périodes de latence entre l&#39;exposition au CO 2 et l&#39;accouplement ont été testés. Une méthode pour écrêtage anesthésie et l&#39;aile marquage alternatif: l&#39;utilisation de colorants alimentaires pour colorer vol est également évaluée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TWT-200-061G</td>
			<td>Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine mesh</td>
			<td>Any haberdashery</td>
			<td>-</td>
			<td>Fine curtain mesh is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-376</td>
			<td>Various brands of pipette tips would be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>58.49</td>
			<td>Larger vials or bottles could also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls</td>
			<td>Lewis Medical Solutions</td>
			<td>28170</td>
			<td>The size of cotton will vary depending on the size of vials used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Food colouring</td>
			<td>Thesugarcraftcompany</td>
			<td>-</td>
			<td>Other dye colours and brands can have variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>BOC</td>
			<td>BOC 40VK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie Markers</td>
			<td>Steadtler</td>
			<td>Lumocolor 313 S</td>
			<td>Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td>Salter</td>
			<td>SL3920</td>
			<td>Any stopwatch with a good digital display would be fine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila

expériences d&#39;accouplement utilisant la drosophile ont grandement contribué à la compréhension de la sélection sexuelle et le comportement. Expériences nécessitent souvent des méthodes simples, faciles et bon marché de faire la distinction entre les individus dans un procès. Une technique standard pour ce est de CO 2 et l&#39;anesthésie puis étiquetage ou AILES chaque volée. Cependant, ce est invasif et a été montré pour influer sur le comportement. D&#39;autres techniques ont utilisé la coloration pour identifier les mouches. Cet article présente une méthode simple et non invasive pour l&#39;étiquetage Drosophila qui leur permet d&#39;être identifiés individuellement dans des expériences, en utilisant le colorant alimentaire. Cette méthode est utilisée dans les essais où deux mâles sont en concurrence pour se accoupler avec une femelle. Teinture permis l&#39;identification rapide et facile. Il n&#39;y a, cependant, une certaine différence dans la force de la coloration pour les trois espèces testées. Les données sont présentées montrant le colorant a un faible impact sur ​​le comportement d&#39;accouplement que le CO 2 chez la drosophile mélanoGaster. L&#39;impact de CO 2 est disponible anesthésie dépendre de l&#39;espèce de la drosophile, avec D. pseudoobscura et D. subobscura montrant aucun impact, tandis que D. melanogaster mâles avaient réduit succès d&#39;accouplement. Procédé de teinture présenté est applicable à une large gamme de modèles expérimentaux.

Deux essais d&#39;accouplement mâle - L&#39;effet de l&#39;anesthésie de CO 2 sur le comportement d&#39;accouplement Le meilleur modèle trouvé pour expliquer la variation de l&#39;effet de CO 2 contenue anesthésie espèces comme facteur (avec pseudoobscura D. et D. subobscura condensé comme ils ont montré aucune différence entre les uns les autres). Dans D. pseudoobscura et D. subobscura il n&#39;y avait aucun effet significatif de CO 2 anesthésie en cas de succès de l&#39;accouplement dans deux essais de sexe masculin (Z 1589 = 0,087, P = 0,931). Pour D. melanogaster, les mâles exposés à CO 2 anesthésie avaient succès d&#39;accouplement significativement plus faible (= 2,467 Z1,589, P = 0,014). Il y avait aussi une interaction significative entre les espèces et le traitement (χ 2 = 6,83 1,589, P = 0,009) avec un effet plus être vu quand D. melanogaster ont été exposés au gaz lors de la collecte ou un jour avant que des essais (tableau 1). However, D. melanogaster mâles exposés à CO 2 deux jours avant le procès expérimentale ne ont pas montré un effet de CO 2. Deux essais d&#39;accouplement mâle - L&#39;effet de la coloration intestinale sur le comportement d&#39;accouplement Modèle simplification montré aucun effet significatif de colorant alimentaire étant trouvé pour l&#39;une des trois espèces (P&gt; 0,1). Lorsque le traitement ou l&#39;état de gaz ont été inclus dans l&#39;analyse ci ne étaient pas non significative (P&gt; 0,1). Les proportions des croisements réussis pour les mouches de couleur à travers les traitements sont présentés dans le tableau 2. La différence de coloration entre les mouches reprend en colorée et non colorée alimentaire peut être vu sur la figure 1. L&#39;intensité de la coloration des aliments intestinal était supérieure à D. pseudoobscura et D. subobscura que dans D. melanogaster. Accouplement essais simples - L&#39;effet de l&#39;utilisation de CO 2 m sur l&#39;anesthésiele comportement de fonc- Il n&#39;y avait pas de différence dans la latence accouplement pour l&#39;une des trois espèces de CO 2 lors de l&#39;anesthésie a été utilisé pour recueillir récemment émergé adultes. Un effet a été trouvé pour la durée de l&#39;accouplement dans D. subobscura quand elle a été exposée au CO 2 de deux jours avant les essais d&#39;accouplement (figures 2 et 3; tableau 2). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" /> Figure 1. Photo montrant flacons de couleur et coloré Fly Alimentation Non (A) et la force de intestinale Coloration à Malé D. Subobscura (B). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" /> Figure 2. La moyenne et 95% des intervalles de confiance pour Copulation latence pour les trois espèces étudiées dans les essais Homme seul, lorsque les mâles étaient Anesthésierd (barres légères) ou non anesthésiés (barres foncées) lors Perçues comme vierges avant la maturité sexuelle. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" /> Figure 3. La moyenne et 95% Intervalles de confiance à la copulation Durée pour les trois espèces étudiées dans les essais Homme seul, lorsque les mâles ont été anesthésiés (barres lumineuses) ou non Anesthésié (barres foncées) lors de la collecte que Vierges avant la maturité sexuelle. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Traitement </td><td> Espèce </td><td> No. essais </td><td> No. mouches colorées qui se sont accouplés </td><td> p-valeur </td><td> No. mouches gazés qui se sont accouplés </td><td> p-valeur </td></tr><tr><td rowspan="3"> Collection de CO 2 </td><td> D. mel </td><td> 73 </td><td> 36 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 0,0344 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td>79 </td><td> 41 </td><td> 0,8221 </td><td> 44 </td><td> 0,3682 </td></tr><tr><td> D. sous </td><td> 71 </td><td> 40 </td><td> 0,3425 </td><td> 33 </td><td> 0,6353 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Exposés à CO 2 18 heures avant </td><td> D. mel </td><td> 57 </td><td> 28 </td><td> 1 </td><td> 19 </td><td> 0,0163 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 65 </td><td> 32 </td><td> 1 </td><td> 31 </td><td> 0,8043 </td></tr><tr><td> D. sous </td><td> 68 </td><td> 38 </td><td> 0,3961 </td><td> 35 </td><td> 0,9036 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Exposés à CO 2 deux jours. </td><td> D. mel </td><td> 56 </td><td> 19 </td><td> 0,0222 </td><td> 32 </td><td> 0,3497 </td></tr><tr><td> D. pse </td><td> 70 </td><td> 32 </td><td> 0,5504 </td><td> 33 </td><td> 0,7202 </td></tr><tr><td> D. sous </td><td> 56 </td><td> 29 </td><td> 0,8939 </td><td> 26 </td><td> 0,6889 &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table> Tableau 1. Résultats de deux expériences Homme Choice toutes les espèces et traitements examinés. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Espèce </td><td> Trait </td><td> df </td><td> t-valeur </td><td> p-valeur </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. melanogaster </td><td> Latence </td><td> 58 </td><td> 1,379 </td><td> 0,174 </td></tr><tr><td> Durée </td><td> 58 </td><td> 1,243 </td><td> 0,221 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. pseudoobscura </td><td> Latence </td><td> 109 </td><td> 0,419 </td><td> 0,676 </td></tr><tr><td> Durée </td><td> 109 </td><td> 0,436 </td><td> 0,664 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. subobscura </td><td> Latence </td><td> 83 </td><td> 0,098 </td><td> 0,922 </td></tr><tr><td> Durée </td><td> 83 </td><td> 1,767 </td><td> 0,081 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Résultats de se accoupler expériences simples examinant l&#39;effet de la collecte sur le CO 2 Anesthésie sur le accouplement latence et la durée. Les tests ont été réalisés sur trois espèces de Drosophila melanogaster (D., D. et D. pseudoobscura subobscura).

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Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Insectes teinture pour comportement essais: le comportement d&#39;accouplement des anesthésié<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

9.7K vues.  University of Liverpool. This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Vidéo: Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Recherche

Neurosciences

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Etudier la base neurophysiologique de comportement locomoteur Adaptive chez les insectes

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Méthodes de dosage à Drosophila Comportement

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Une simple mouche Essai de comportement alimentaire dans<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilisation de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

A Behavioral Essai pour mécanosensibilité de marcm-fondé clones dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Des essais pour détecter des structures réfléchissant les UV et de déterminer leur importance dans Maté préférence en utilisant la Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un moyen simple pour mesurer Transformations en récompense le comportement de recherche Utilisation<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantification du comportement de toilettage de la drosophile

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...