We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

Poisson zèbre (souche de nacre) ont été élevés et a grandi selon des protocoles établis. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance, en utilisant mM Tricaine 0,4 pour l&#39;anesthésie et 1 mM Tricaine pour l&#39;euthanasie. Embryons de poisson zèbre et de larves ont été traitées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l&#39;animal tel qu&#39;approuvé par la commission compétente (Laboratoire de biologie animale de base MDI IACUC numéro 13-20). Cette étude a été approuvée par l&#39;Institut de recherche sur le génome humain soin et l&#39;utilisation des animaux Comité national, MDIBL institutionnelle Assurance # A-3562-01 sous le protocole # 14-09. Remarque: La procédure d&#39;imagerie qui capture la régénération des nageoires chez le poisson zèbre larvaire est résumée dans les étapes suivantes: 1. Résurrection de poisson zèbre pour les stades larvaires <ol><li> Ramasser les oeufs et placez environ 50 oeufs dans un plat 100 x 25 mm de Pétri contenant 0,03% de sel de l&#39;océan instantanée dans l&#39;eau déminéralisée complété par 0,00004% de bleu de méthylène. Incuber O / N dans un incubateur à 28,5 °. </li> &lt;li&gt; Le lendemain matin, retirer les embryons morts avec une pipette en verre et rincer les œufs dans une passoire avec 0,03% de sel de l&#39;océan instantanée dans l&#39;eau déminéralisée (milieu de l&#39;embryon appelé). Note: Medium comme Ringers 18, Hanks 18, 19 E2, E3 20 et Danieau 21 peut être préféré. </li><li> sup&gt; Ajouter moyen d&#39;embryons frais à l&#39;antenne. Si l&#39;on utilise des souches pigmentées, éventuellement ajouter 0,2 mM de 1-phényl-2-thiourée (PTU), comme PTU mélanogénèse et empêchera ainsi la pigmentation des larves. Laissez les embryons se développent plus loin dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à deux jours après la fécondation ou tout autre stade larvaire souhaitée. </li></ol> 2. Préparation de la chambre d&#39;imagerie <ol><li> Méthode 1: Imagerie chambres fabriqués à partir de PVC ou de tuyau en Teflon (Figure 1) Note: Cette méthode est similaire à Concha et Adams (1998) 22. <ol><li> Acquérir plastique de qualité de l&#39;eau potable ou les tubes en téflon d&#39;un magasin de matériel avec un un externe de 25 mmda 20 mm de diamètre intérieur. Couper le tube à faire des bagues d&#39;environ 10 mm d&#39;épaisseur avec une surface plane de chaque côté. Utilisez&gt; 200 papier de verre grain pour lisser les bords. </li><li> Nettoyez les anneaux avec de l&#39;eau chaude et 70% d&#39;éthanol et les laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Avec une pointe de pipette, appliquer de la graisse de silicium à la moitié d&#39;un anneau et fixez l&#39;anneau à un 75 mm x 25 mm couvercle en verre glissement. Vous pouvez également utiliser une seringue de 3 ml rempli avec de la graisse de silicium au lieu d&#39;une pointe de pipette. Remarque: Comme il est difficile d&#39;insérer la graisse de silicone dans la seringue de 3 ml, ajouter la graisse de silicone à une seringue de 30 ml et en utilisant ce premier remplissage de la seringue de 3 ml. </li></ol></li><li> Méthode 2: Préparation d&#39;une boîte de Petri comme une chambre d&#39;imagerie. <ol><li> Acquérir 35 ou 60 mm de diamètre des boîtes de Pétri avec une lamelle de verre fixée au couvercle (figure 2A). En variante, comme le montre la figure 3 de Distel &amp; Koester (2007) 23, percer une ouverture assez petit pour hune lamelle couvre-vieux dans le couvercle d&#39;une petite boîte de Pétri et appliquer de la graisse de silicium vers l&#39;extérieur avec une seringue de 3 ml. En utilisant une pointe de pipette propre, fixez attentivement une forme ronde ou carrée lamelle d&#39;épaisseur désirée à l&#39;extérieur (figure 2B). </li></ol></li><li> Pour se assurer que l&#39;agarose utilisé pour des séjours fermement attachés au cours de la procédure d&#39;imagerie de montage, fixez un maillage de plastique fin intérieur de l&#39;anneau. Premièrement, couper la maille en écran de la fenêtre obtenue à partir d&#39;un magasin de matériel, à la taille du diamètre de la bague intérieure à l&#39;aide de ciseaux fins avec un angle. Ensuite, couper un petit rectangle&gt; deux fois la taille de la larve dans le milieu de la maille (figure 1, 2). </li><li> Appliquer quatre petits points de graisse silicone non-toxique pour l&#39;interface entre la lamelle et l&#39;anneau de chambre (figure 1A). </li><li> Utilisez une pince pour fixer le treillis fermement au fond de la lamelle de verre. </li></ol> 3. Montage et imagerie de la pré-injme- Larve (cette étape est facultative) Remarque: Cette étape se prête aux comparaisons entre la longueur nageoire amputée et régénéré, que le plan de l&#39;amputation après la régénération des nageoires est pas identifiable dans larves de poisson zèbre. <ol><li> Préparer une solution d&#39;agarose de 0,5 à 1,2% faible point de fusion dans le milieu de l&#39;embryon pour l&#39;immobilisation de l&#39;échantillon. </li><li> Chauffer l&#39;agarose dans un four micro-ondes et de transférer le liquide d&#39;agarose dans 1,5 ml tubes qui sont pré-chauffé à 42 ° C dans un bloc chauffant. </li><li> Laissez l&#39;agarose chaude refroidir à 42 ° C, qui peut être maintenu pendant plusieurs semaines à cette température. Essayez d&#39;éviter le pipetage larves dans agarose supérieure à 42 ° C, comme ce sera au détriment des animaux. </li><li> Anesthésier plusieurs larves en utilisant 10 ml de 0,4 mM tricaïne (pH 7) dans le milieu de l&#39;embryon dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. Préparer la tricaïne Selon le livre Recettes de poisson-zèbre 18. <ol><li> Vous pouvez également utiliser 10 ml d&#39;une dilution de 1: 1000 99% 2-phénoxyéthanol dans une boîte de Pétri de diamètre 60 mm. Poke les larves avec une pointe de pipette microloader plafonné pour évaluer leur réponse au toucher avant de continuer. Utilisez uniquement les larves non recevable. </li></ol></li><li> Transférer une larve dans la solution de gélose à 42 C ° à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en verre. Ne pas transférer le liquide excessive dans l&#39;agarose, sinon l&#39;agarose sera trop dilué et non solidifier. </li><li> Jeter le liquide restant de la pipette et transférer la larve avec une goutte d&#39;agarose dans une petite boîte de Petri (35 ou 60 mm de diamètre). Placez la larve de son côté pour l&#39;imagerie de la nageoire caudale. </li><li> Laisser la gélose se solidifier. Évaluer l&#39;agarose avec une pointe de pipette en plastique; la pointe se immerger dans l&#39;agarose si elle est trop liquide. Une fois que l&#39;agarose est solidifié, une petite indentation sera visible en touchant avec une pointe de pipette. Après solidification, ajouter la solution de tricaïne et passer à la loupe binoculaire qui sera utilisé plus tard pour imagerie time-lapse. <li> Utilisez un stéréomicroscope avec le logiciel time-lapse. Sélectionnez un objectif et grossissement approprié, qui sera utilisé plus tard pour l&#39;imagerie time-lapse. Ici, utiliser un 3,5 x 16 mm, distance de travail objectif sur un stéréomicroscope. Comme souhaité, utiliser les microscopes et autres lentilles de l&#39;objectif, mais choisir un grossissement appropriée pour tenir compte de xy-dérive et la croissance de la nageoire potentiel durant la procédure d&#39;imagerie. </li><li> Sélectionnez le mode de détection de la caméra sur le microscope. </li><li> Dans le logiciel, sélectionnez le mode &#39;live&#39; pour voir la larve à l&#39;écran. </li><li> Ouvrez la fenêtre «Propriétés» pour détecter automatiquement la luminosité. </li><li> Régler manuellement le contraste au microscope de base trans-illumination. </li><li> Déplacez la larve sur le champ de vision et de sélectionner la fonction de correction d&#39;ombrage pour minimiser fond pasISE. </li><li> Placez la larve de nouveau dans le champ de vision et prendre un instantané. Enregistrez l&#39;image. </li><li> Retirer l&#39;agarose de la larve d&#39;abord gratter l&#39;agarose de la tête. De cette façon, la larve peut être glissé hors de l&#39;agarose en tirant doucement la tête loin de l&#39;agarose restant avec une pointe de pipette microloader plafonné ou d&#39;une goupille d&#39;insectes. </li><li> Avec une pipette Pasteur en verre transférer la larve dans la solution de tricaïne frais. </li></ol> 4. Amputation Assay <ol><li> Préparer une solution agarose à 1,5% en utilisant le milieu de l&#39;embryon et versez une couche mince dans une boîte de Pétri. Laissez l&#39;agarose solidifier. </li><li> Sous un stéréomicroscope, placez le latéral de larve sur le agarose solidifié et amputer la nageoire caudale avec une aiguille 23 G de la seringue avec une légère pression (figure 3A). </li></ol> 5. Montage de la Larve pour imagerie time-lapse <ol><li> Procédez comme décrit dans les étapes 3.1 à 3.5 (figure 3B). </li><li&gt; Transfert une baisse de 0,5 à 1,2% d&#39;agarose liquide à 42 ° C contenant la larve dans l&#39;anneau de chambre de l&#39;imagerie (étape 2.1), orienter la larve et laissez l&#39;agarose solidifier. Remplissez la bague avec une solution de tricaïne. Alternativement, si la chambre de boîte de Pétri (étape 2.2) est utilisé, la larve monter sur la lamelle de couvercle et remplir le couvercle avec une solution de tricaïne. </li><li> Pour permettre une bonne cicatrisation ou la régénération des tissus de se produire, soigneusement gratter la gélose entourant la queue distale fin en utilisant une pointe de pipette microloader plafonné ou d&#39;une goupille d&#39;insectes. Essayez de ne pas nuire à la nageoire de façon répétée (figure 3C). </li><li> Décanter la solution contenant le Tricaine retiré agarose et remplir l&#39;anneau de chambre avec une solution de tricaïne frais. </li><li> Appliquer de la graisse de silicium en haut de l&#39;anneau de chambre et fixer une lame de verre de 25 mm x 75 mm. Essayez d&#39;éviter les poches d&#39;air dans la chambre, car ils vont interférer avec l&#39;imagerie de fond clair et dessécher la larve au fil du temps. </li><li> Si l&#39;on utilise une boîte de Petri queune chambre de formation d&#39;image, appliquer de la graisse de silicone sur le rebord supérieur du fond de chambre et remplir la chambre du bas avec une solution de tricaïne. Décanter avec soin la solution Tricaine dans le couvercle et retourner le couvercle d&#39;immerger la larve dans la solution de tricaïne de la chambre inférieure à un léger angle pour éviter les poches d&#39;air. La chambre sera scellé en raison de la graisse de silicium. </li></ol> 6. imagerie time-lapse <ol><li> Assembler une chambre d&#39;incubation chauffée comme décrit dans 23,24 (Figure 4) .Positionner la chambre d&#39;incubation dans le microscope et tourner sur la chaleur. Ajuster la température à 28 ° C pendant environ 10 à 20 min ou jusqu&#39;à ce que la température se est stabilisée. </li><li> Ouvrir l&#39;avant de la chambre d&#39;incubation chauffée et placer la chambre de formation d&#39;image sur le support de microscope avec le couvre-face vers le haut vers l&#39;objectif. </li><li> Positionner l&#39;ailette larvaire de manière à 2/3 du champ de vision reste inoccupé. Ceci assure la prise de lala croissance et la régénération de l&#39;ailette au cours de la procédure d&#39;imagerie sans avoir à repositionner la larve. <ol><li> Ajustez la larve montée à 28 ° C pendant ~ 30 min avant de commencer l&#39;enregistrement time-lapse pour éviter les changements de l&#39;intensité de fond clair ou des changements potentiels de l&#39;agarose. Sinon, utiliser un tampon préchauffée à commencer imagerie après la réduction du temps de réglage. </li></ol></li><li> Pour configurer l&#39;enregistrement time-lapse, ouvrir la fenêtre 6D multidimensionnelle Acquisition dans le logiciel de Axiovision et sélectionnez l&#39;option z-stack et time-lapse. </li><li> Facultatif) Dans l&#39;onglet z-pile et mode Slice, sélectionnez l&#39;épaisseur de la tranche et puis sélectionnez le mode Start / Stop. </li><li> Définir la position supérieure et inférieure de la pile. </li><li> Dans l&#39;onglet time-lapse, sélectionnez l&#39;intervalle et la durée du film et puis commencer le film en appuyant sur le bouton de démarrage. Nous avons constaté que des intervalles de 30 min sont suffisantes et cet intervalle ne génère pas de données excessive; Toutefois Shorteintervalles r peuvent être utilisés. </li><li> Vérifiez la position et z-stack dimensions au cours de la première heure si la larve n&#39;a pas été pré-réglée. Si nécessaire, repositionner la larve nouveau après une journée, que la larve a peut-être changé. </li><li> Enregistrez le fichier à la fin de l&#39;enregistrement time-lapse et procéder à la post-traitement et quantifications disponibles en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image, tels que Imaris 25 ou l&#39;open source des logiciels Image J 26 et 27 Fidji. </li></ol> 7. Analyse des données <ol><li> La détermination de la longueur de dérive. <ol><li> Ouvrez le film accéléré dans le logiciel d&#39;imagerie et enregistrer les fichiers dans le format de fichier propriétaire pour améliorer les performances du logiciel. </li><li> Sélectionnez la vue orthogonale à afficher différentes sections que les piles prévues. Pour la correction de la dérive, dans le menu Fidji, sélectionnez Plugins, puis l&#39;enregistrement, et «la dérive 3D correcte &#39;. Cela va ouvrir une fenêtre Fidji et effectuer les corrections de dérive. Correctla dérive de rotation dans la fonction Spots Imaris. Sinon, installer les plugins StackReg et TurboReg dans Image J et importer aux Fidji. Choisissez l&#39;algorithme de transformation souhaitée dans le plugin StackReg. </li><li> Pour mesurer les distances (par exemple, diamètre blesser ou longueur fin), sélectionnez l&#39;option «ajouter de nouveaux points de mesure» dans la barre d&#39;outils en haut à gauche. <ol><li> Sous «liste Configurer des Statistiques visibles valeurs &#39;dans le menu en bas à gauche, sélectionnez les valeurs statistiques à afficher. </li><li> Dans le &#39;Mode Ligne »sous l&#39;onglet Paramètres, sélectionnez« Paires (AB, CD ...) ». </li><li> Dans &#39;étiquettes Propriétés de sélectionner «Nom» et «Distance», pour afficher la distance entre les points A et B à côté de la ligne de mesure. </li><li> Passez en mode &#39;Edition&#39; et maintenez la touche Shift pour sélectionner le premier point à la fin de la notochorde. Ensuite, utilisez la même configuration pour sélectionner le deuxième point à la marge distale fin. </li><li> Sous l&#39;onglet «Statistiques», sélectionnez le bouton de disque (Exporter tous) en bas à droite pour afficher et exporter la distance dans l&#39;image. </li><li> Répéter les mesures à des moments sélectionnés en déplaçant le curseur sous l&#39;image vers la droite. Au lieu de créer de nouveaux points de mesure, les précédents peuvent être repositionnés en sélectionnant d&#39;abord le point avec le bouton gauche de la souris, puis en appuyant simultanément sur le décalage et le bouton gauche de la souris à la nouvelle position. </li></ol></li><li> Alternativement à l&#39;option des points de mesure, utiliser le spectateur de tranche pour mesurer les distances. Dans le mode d&#39;affichage de la tranche, faites défiler jusqu&#39;à une position désirée et cliquez sur la première et la deuxième position avec le bouton gauche de la souris. La distance est affichée. Toutefois, cette option ne permet pas pour l&#39;exportation de données. </li></ol></li><li> Déterminer la longueur des nageoires et zone dans ImageJ. <ol><li> Ouvrez le film time-lapse dans ImageJ utilisant un plugin qui reconnaît le format de fichier .zvi. Sinon, charger dans un QuickTime fichier ou une séquence de tiff. Remarque: Si vous utilisez un format de fichier TIFF non compressé, les dimensions de l&#39;image ne ont pas besoin d&#39;être spécifié. </li><li> Si l&#39;ouverture d&#39;un format de fichier différent sans les informations de fichier, sélectionnez &#39;échelle Set&#39; dans le menu &#39;Analyser&#39; abord définir la distance d&#39;image et l&#39;unité. Dans le menu &#39;échelle Set&#39;, tapez le &#39;Distance en pixels », ci-dessous genre dans la distance connue&#39; pour la valeur de pixel (ce qui peut être obtenu en mesurant le nombre de pixels sur une barre d&#39;échelle qui a été ajoutée à l&#39;image , puis cliquez sur Mesurer pour obtenir le résultat), et le «Unité de longueur&quot; (typiquement «um»). Puis cliquez sur OK. </li><li> Pour les mesures de la nageoire sélectionnez l&#39;outil &quot;Sélection Freehand &#39;dans la barre d&#39;outils et décrivent les ailettes en maintenant le bouton gauche de la souris tout en tirant le long du contour de la nageoire. Pour les mesures de longueur de nageoire, sélectionnez l&#39;outil en ligne «droite» et de tracer une ligne entre les points désirés êtremesuré. </li><li> Cliquez sur l&#39;option &#39;Mesure&#39; sous &#39;Analyser&#39; pour afficher la zone et de la longueur de la nageoire. Répétez cette étape aussi souvent que nécessaire pour les points de temps multiples du film. </li></ol></li><li> Utilisation de logiciel de statistiques, les données peuvent être représentées graphiquement. </li></ol>

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Les auteurs ne ont rien à divulguer.

La méthode présentée permet d&#39;observer la cicatrisation et la régénération des tissus à vivre larves de poisson zèbre avec l&#39;imagerie in vivo time-lapse sur un stéréomicroscope fond clair, en utilisant un relativement simple set-up. Cette procédure nécessite certains aspects importants que nous avons testés, qui permettront d&#39;optimiser le résultat: 1) De faibles concentrations d&#39;agarose (~ 0,5%) permettra de minimiser les obstacles du poisson zèbre larves sans cesse croissante de croissance, 2) Suppression de la gélose autour de la nageoire est important de ne pas à masquer le processus de guérison, 3) de piégeage de l&#39;agarose dans un maillage plastique retient l&#39;agarose et de l&#39;animal dans une position stable pendant toute la procédure, et 4) un environnement contrôlé en température correcte, ce qui est essentiel pour la viabilité des larves. Nous avons adapté une étuve d&#39;incubation 23,24, qui utilise le film à bulles qui est enregistré sur un carton, et un élément chauffant en forme de dôme filaire pour contrôler la température et la circulation de l&#39;air avec des fluctuations minimales au cours de laprocédure d&#39;imagerie. Cette chambre simple et rentable peut être préparé pour se adapter à ne importe quel microscope. Une chambre d&#39;incubation chauffée similaire a été également utilisé pour les souris d&#39;imagerie et le développement du poussin 24,29. Nous suggérons que les larves pré-amputée sont montés pour une image pré-amputation, amputation démonté, et remonté pour l&#39;imagerie time-lapse. Bien qu&#39;il soit possible d&#39;effectuer ces étapes en une seule étape dans la chambre de formation d&#39;image finale, d&#39;après notre expérience, nous avons trouvé que amputer la nageoire caudale sur une lamelle de verre ne est pas optimale, car elle déchire le tissu et ne entraîne pas une coupe nette. La méthode d&#39;amputation à base d&#39;agarose en utilisant une aiguille de seringue a été initialement décrit par Kawakami et ses collègues (2004) 16 et est également, dans notre expérience, idéal pour effectuer les amputations. Ainsi, la série assez compliquée d&#39;étapes que nous avons présenté est bien justifiée et garantit un résultat optimal de régénération. Nous avons montré que larval poisson zèbre au 2 dpf peut être imagée jusqu&#39;à 1,5 jours en agarose et la solution de tricaïne. Nous avons utilisé de tricaïne (pH 7) solution de pH optimisé préparé avec du sel de Instant Ocean, qui ne interfère pas avec la santé de l&#39;échantillon pour la période d&#39;imagerie présenté. Nous avons déjà cependant aussi démontré que l&#39;utilisation de tricaïne en milieu Danieau permet imagerie time-lapse de 2,5 dpf poisson zèbre larvaire sur un microscope confocal pour au moins deux jours 30. Ainsi, les conditions optimales de tampon peuvent se étendre santé larvaire et la longueur de formation d&#39;image. Alternativement, des concentrations plus faibles de tricaïne peuvent être utilisés pour l&#39;anesthésie, ou 2-phénoxyéthanol, que nous avons trouvé est bien toléré pendant les stades larvaires et les adultes à 28 ° C pendant au moins 60 h. Pour éviter les défauts dans la régénération des nageoires, nous avons supprimé l&#39;agarose de la nageoire caudale avant l&#39;imagerie. Nos données montrent que moins de 1,5 jours, la nageoire est régénéré à environ 60%. Ce taux de régénération est compatible avec une étude antérieure définissant un 3 jourss un temps moyen pour nageoire caudale régénération larves de poisson zèbre jusqu&#39;à 6 dpf 16. Méthodes alternatives à l&#39;agarose pourraient toutefois être utilisés pour monter le poisson pour l&#39;imagerie. Par exemple, le plasma mince coagule 31 ou éthylène-propylène fluoré (FEP) tubes revêtus de la méthylcellulose et remplis avec des concentrations très faibles agarose (0,1%) ont été recommandées pour la microscopie nappe de lumière 32 et peut convenir pour notre méthode présentée. Cependant, nous ne recommandons pas la méthylcellulose et 0,1% d&#39;agarose, comme ils exigent que l&#39;échantillon sont montés au fond de la chambre en raison de l&#39;absence de solidification de ces médias. Des concentrations très élevées de méthylcellulose seront en outre générer des poches d&#39;air sur la base de notre expérience, et ceux-ci peuvent interférer avec la procédure d&#39;imagerie. Si ces moyens sont préférés à l&#39;aide de la chambre de fond, il est important qu&#39;une distance de travail approprié entre la lentille d&#39;objectif et l&#39;échantillon est présent. Il convient de noter que méthylcellulose comme un milieu de montage ne ​​est recommandé que pour un maximum de 1 jour, car il peut interférer avec la santé des larves 32. Montage du spécimen dans le couvercle peut entraîner une tendance à la baisse lente gravitationnelle. Il est donc recommandé d&#39;images multiples sections à chaque point de temps, qui peut être projeté dans un seul plan ou seulement les images qui sont dans le plan focal peut être extraite pour assembler le film final. Imagerie l&#39;échantillon à la chambre inférieure pourrait être une autre méthode pour éviter la dérive vers le bas potentiel. caillots de plasma pourraient être utiles pour éviter la dérive, que le plasma se en tiendra à la couche externe enveloppante (EVL, périderme) 31 et peuvent donc stabiliser l&#39;échantillon. Cela doit néanmoins être testée, ainsi que combien de temps le poisson zèbre larves peut être maintenue dans la formation de caillots de plasma sans interférer avec la santé des larves ou la régénération des nageoires. Notre film a été assemblé en utilisant des sections individuelles (26 um)d&#39;une pile z-enregistré, qui couvre toute l&#39;épaisseur de l&#39;ailette (~ 10 um) et qui représente la dérive de potentiel z de l&#39;ailette au cours de la procédure d&#39;imagerie. Afin de conserver l&#39;information en 3-D, il est également possible de projeter z piles en images uniques. Parce que cela peut entraîner dans le flou de l&#39;image, fond clair déconvolution peut être souhaitable. Logiciel, tel que Deconvolve ou X3 Autoquant pourrait être utilisé à cette fin. Alternativement, des algorithmes mathématiques (décrites dans Tadrous 33) peuvent être appliqués pour obtenir une fonction d&#39;étalement de point de rapport signal sur bruit (SNR). Obtention d&#39;un SNR élevé représente l&#39;un des principaux obstacles à fond clair déconvolution. Bien que cette méthode nécessite un contraste élevé et l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon mince, il serait approprié pour l&#39;imagerie de la nageoire caudale en raison de sa largeur réduite. Un net avantage de la méthode de formation d&#39;image présentée est qu&#39;elle est rapidement adaptable à tout stéréomicroscope équipé d&#39;une une caméra CCDd logiciels time-lapse et offre une alternative à faible coût à plus coûteux systèmes d&#39;imagerie confocale. Bien que cette méthode ne utilise pas de fluorescence pour la détection de cellules, il peut être étendu pour des applications en utilisant un système automatisé pour le contrôle de l&#39;obturateur et de post-imagerie logiciel de déconvolution 34. Cela permettrait aux utilisateurs d&#39;observer davantage les processus de réparation et de régénération de la plaie avec une seule cellule ou une résolution subcellulaire sur des périodes de temps plus longues. La clarté optique et la facilité avec laquelle des larves de poisson zèbre embryonnaire et peuvent être manipulés, et la capacité d&#39;adaptation de cette méthode à toute stéréomicroscope le rend approprié pour l&#39;enseignement de la biologie des vertébrés de base dans une salle de classe. Cette méthode peut fournir aux étudiants une meilleure compréhension des processus biologiques fondamentaux qui sous-tendent la réparation des tissus et la régénération. D&#39;autres processus biologiques qui ont été capturées avec une méthode similaire sont le développement embryonnaire du poisson zèbre 23,34 et cardiaquefonction (non publié). Cette méthode offre également la possibilité pour la réparation des plaies et la régénération de surveillance des larves qui ont été génétiquement manipulées et pharmacologiquement.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
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			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&#34; (Home Depot)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING&#174; HIGH VACUUM GREASE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips 20 &#181;l (Eppendorf, Cat. No. 930001007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe&#160;(BD, Cat. No. 309657)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Discovery.V12 compound microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Plan Apo S 3.5X objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

La technique présentée est appropriée pour élucider la dynamique de la réparation des tissus, en réponse à l&#39;amputation. Le film montre que l&#39;amputation de la nageoire déclenche d&#39;abord un cordon de bourse effet, caractérisé par des contractions par des câbles d&#39;actine-myosine qui sont présents dans l&#39;ailette 28 fois (figure 5 A, B). Parallèlement, les cellules sont extrudées de la plaie (voir vidéo). La contraction peut donc être un moyen pour expulser les cellules qui sont susceptibles destinées à subir la mort cellulaire. Nos résultats montrent en outre que la croissance du développement de la larve se produit indépendamment de la régénération (film), alors que la régénération des nageoires ne lance pas jusqu&#39;à environ 14 heures après l&#39;amputation, telle que mesurée par la longueur des nageoires et la zone au cours de temps de 36 heures suite de l&#39;amputation (Figure 5C , D). La croissance ailette de régénération total après 1,5 jours était d&#39;environ 60% de la longueur initiale ailette (figure 5E). Pris ensemble, ces résultats démontrent que l&#39;amputation tr<html> Iggers contraction ailette, l&#39;extrusion de cellules provenant de la plaie, et une réponse régénérative temporellement retardé. Alors que les cellules sont probablement extrudées destinées à subir la mort cellulaire, la nature de ces cellules doit encore être clarifiée. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> Figure 1. Imagerie ensemble d&#39;anneau de chambre (A) représenté est un anneau en plastique qui est fixée à une lamelle couvre-objet avec de la graisse de silicone. Une maille en plastique est fixé à l&#39;intérieur de la chambre avec quatre petits points de la graisse au silicone. (B) la chambre contenant la larve monté est rempli avec une solution de tricaïne et une lame de verre est fixé à la partie supérieure. (C) Un monté deux jours-larve (flèche) est représentée à plus fort grossissement pour dépeindre sa taille par rapport à la maille.&quot;_blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> Figure 2. chambre Imaging assemblage réalisé à partir des boîtes de Pétri. (A) Montré est un verre commerciale supérieure à fond de verre boîte de Pétri avec un filet de plastique attaché à la lamelle de verre. (B) montré est une chambre de boîte de Pétri pour elle-même avec un trou percé dans le couvercle et une lamelle couvre-joint de l&#39;extérieur avec de la graisse de silicone. Le maillage et les larves sont montés à l&#39;intérieur de la chambre contenant une solution de tricaïne. Pour sceller la chambre, de la graisse de silicium est appliqué à la, jante extérieure supérieure de la chambre inférieure et le couvercle supérieur fixé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ialt = mg &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Schéma de l&#39;amputation et de montage d&#39;une larve pour l&#39;imagerie. (A) Pour l&#39;amputation, placer une larve anesthésiés sur une boîte de Pétri agarose-couché et amputer la nageoire caudale avec une aiguille de seringue. (B) Pour le montage, transférer la chenille avec une pipette de transfert dans un tube de 1,5 ml remplie de 42 ° C agarose liquide et pipeter une goutte contenant la larve dans la chambre d&#39;imagerie, orienter le poisson et couvrent la solidification de l&#39;agarose avec du milieu d&#39;embryon. (C) Grattez l&#39;agarose de la nageoire caudale à l&#39;aide d&#39;une pipette de microloader plafonné ou un outil similaire et remplacer moyen d&#39;embryons avec du milieu frais. (D) image la nageoire caudale sous un stéréomicroscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 4. chambre d&#39;incubation chauffée auto-construit. (AC) Montré est une chambre d&#39;incubation chauffée en carton, du papier bulle et Velcro. Un chauffe-dôme filaire (à l&#39;origine conçu pour l&#39;incubation des oeufs de poulet) est attaché à la chambre à l&#39;aide de ruban d&#39;aluminium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> Figure 5. dynamique de régénération Fin. (A) Schéma de la méthode de dosage de l&#39;amputation et la quantification fin de queue utilisé pour déterminer la longueur de nageoire (flèche rouge) et de la zone (cadre rouge de la fin). (B) Tail amputation fin déclenche d&#39;abord la contraction de la nageoire, suivie par regenerative excroissance tissulaire. L&#39;ailette subit également la croissance du développement, comme le montre l&#39;augmentation de la taille latérale. (C) indiquée est la longueur ailette en fonction du temps, indiquant un départ de la croissance linéaire de régénération à ~ 14 hpa. (D) La quantification de la zone ailette révèle une baisse initialement de taille, qui peut être attribuée à la contraction de l&#39;ailette. Après ~ 14 h, les ailettes taille augmente à un rythme linéaire. (E) Comparaison de la longueur de nageoire avant l&#39;amputation et après 36 h montre ~ 60% de reprise. Barre d&#39;échelle: 100 um abréviations: pré-ampli, pré-amputation; heures après l&#39;amputation, hpa; regen, la régénération; Ampère, l&#39;amputation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">Film</a> . Fin régénération au cours de temps de 36h. Montré est une nageoire caudale d&#39;une larve de 2,5 jours au cours de la régénération. À partir croissance régénérative 30 min après amputation est imagé par intervalles de 30 min sur un stéréomicroscope utilisant un objectif 3.5x.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

capturing-tissue-repair-zebrafish-larvae-with-time-lapse-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K vues.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Vidéo: Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d&#39;imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...