L’objectif global de ce protocole est d’examiner et de quantifier la régénération musculaire dans un modèle de maladie musculaire du poisson-zèbre. Cette méthode fournit un pipeline à haut débit qui est non seulement rentable, mais aussi hautement reproductible pour marquer le potentiel de régénération d’un muscle malade dans un contexte in vivo. Avnika Ruparelia, chercheuse à l’Institut australien de médecine régénérative, fera la démonstration de la procédure avec moi.
Pour le génotypage d’embryons vivants, pelez le film protecteur transparent de la surface supérieure d’une puce d’extraction d’ADN à 24 chambres et utilisez une pointe de filtre de 20 microlitres avec une pointe coupée pour transférer un seul embryon anesthésié dans 13 microlitres de milieu embryonnaire dans chaque chambre de la puce. Lorsque tous les embryons ont été chargés, montez doucement la puce sur la plate-forme de génotypage des embryons de poisson zèbre en plaçant un côté en premier, suivi du reste de la puce. Apposez le couvercle de la plate-forme magnétique sur la puce pour empêcher l’évaporation du milieu embryonnaire pendant le protocole d’extraction de l’ADN et fermez le couvercle.
Réglez l’unité de base sur 2,4 volts, 0,051 ampère et 0,12 watt et démarrez le protocole d’extraction d’ADN. La plate-forme doit commencer à vibrer, ce qui peut être évalué en touchant doucement le couvercle. Pendant que le programme est en cours, préparez une plaque de 24 puits en ajoutant un millilitre de milieu embryonnaire à chaque puits et étiquetez les tubes à bande de huit puits à utiliser pour la collecte du matériel d’ADN de chaque embryon.
Après huit minutes d’extraction, appuyez sur le bouton on/off pour arrêter les vibrations de la plate-forme, retirez doucement le couvercle magnétique et soulevez la puce de la plate-forme. Transférer 10 microlitres de milieu embryonnaire d’une chambre dans le puits approprié du tube à bande de huit puits et ajouter immédiatement deux gouttes de milieu embryonnaire frais aux chambres. Transférer l’embryon de la chambre dans un puits approprié de la plaque de 24 puits préalablement préparée.
Lorsque tous les embryons ont été transférés, placez la plaque dans un incubateur de 28 degrés Celsius. Effectuer les essais de génotypage en aval appropriés sur le matériel génétique recueilli dans les tubes à bandes de huit puits afin de déterminer le génotype de chaque embryon. Une fois le génotype de chaque embryon identifié, transférez les embryons dans des boîtes de Petri de 90 millimètres contenant 25 millilitres d’eau moyenne et incubez les plaques à 28 degrés Celsius jusqu’à lésion musculaire.
Quatre jours après la fécondation, utilisez une pipette pour transférer une larve anesthésiée dans une nouvelle boîte de Pétri et retirez soigneusement tout excès de milieu de la boîte sous un microscope à dissection. Orientez le poisson de telle sorte que la tête soit à gauche, la queue à droite, la région dorsale est vers le haut et la région ventrale vers le bas, et utilisez une aiguille de calibre 30 pour faire un coup de poignard précis rapide dans un à deux somites dans le muscle époxyde au-dessus du pore anal et horizontalement au myoseptum. Appliquez une goutte de milieu embryonnaire sur le poisson-zèbre blessé et transférez soigneusement la larve dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu embryonnaire frais par puits.
Lorsque toutes les larves ont été blessées, placez la plaque dans l’incubateur à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que le poisson-zèbre soit imagé. Pour quantifier la régénération musculaire, ouvrez une image post-blessure d’un jour dans un logiciel d’analyse d’image approprié et utilisez l’outil polygone pour dessiner une forme autour du site de la plaie. Utilisez le logiciel pour mesurer la surface et l’intensité moyenne de biréfringence de la région et copiez ces valeurs dans les cellules D3 et E3 du modèle fourni.
Dessinez deux régions supplémentaires couvrant chacune une à deux somites non blessées et mesurez la superficie et les intensités moyennes de biréfringence de chacune de ces régions. Copiez ces valeurs dans les cellules D4 et D5 et E4 et E5 du modèle. Répétez ensuite la mesure pour les mêmes régions dans l’image des trois jours suivant la blessure.
Lorsque la biréfringence a été mesurée de la même manière dans toutes les images, calculez la biréfringence normalisée pour chaque région en divisant l’intensité moyenne de biréfringence de chaque région par sa surface. Pour chaque point temporel, calculez la biréfringence normalisée moyenne des deux régions non blessées afin de fournir un point de référence pour le muscle non blessé. Pour déterminer l’étendue de la blessure musculaire au premier jour après la blessure, divisez la biréfringence normalisée de la région de la blessure par la biréfringence normalisée moyenne des régions non blessées.
Pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire, divisez la biréfringence normalisée de la région de la blessure dans l’image des trois jours suivant la blessure par l’intensité normalisée moyenne des régions non blessées à ce stade. Enfin, calculez l’indice de régénération en divisant la valeur de l’étendue de la régénération musculaire au troisième jour après la blessure par la valeur de l’étendue de la lésion musculaire au premier jour après la blessure. Dans cette analyse représentative, une couvée d’embryons provenant d’un croisement entre deux poissons-zèbres hétérozygotes Lama2 a été transférée sur une puce d’extraction d’ADN et génotypée par la suite.
Alors que les blessures musculaires entraînent une réduction de l’intensité de la biréfringence au premier jour après la blessure, la régénération réussie du muscle entraîne une augmentation de la biréfringence dans la même région. Il convient également de noter que, bien que les larves de type sauvage présentent une intensité de biréfringence uniforme en raison d’un schéma musculaire normal, l’intensité de biréfringence dans le muscle des larves knock-out lama2 est inégale et très sporadique probablement en raison d’une intégrité musculaire réduite. Comme observé, les larves de type sauvage et déficientes en Lama2 présentent une intensité de biréfringence significativement accrue dans le site de la plaie trois jours après la blessure par rapport à un jour après la blessure, ce qui indique que le muscle s’est régénéré.
La détermination de l’indice de régénération révèle que les larves déficientes en Lama2 présentent une augmentation frappante de la régénération musculaire par rapport aux animaux de type sauvage. Bien que ce protocole nous permette d’identifier toute altération de la capacité du muscle à se régénérer dans des modèles de maladie musculaire, une analyse cellulaire et moléculaire en aval doit être effectuée pour identifier les mécanismes responsables des changements observés. Cette méthode nous a permis d’identifier comment l’altération de la fonction des cellules souches musculaires et une altération des éléments de niche associés contribuent à la pathogenèse des maladies musculaires, ce qui nous permet d’identifier de nouveaux mécanismes pathologiques.
