Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral allemand de l&#39;Éducation et de la Recherche (BMBF), la biologie des systèmes de signalisation dans le cancer (Helmholtz Alliance sur la biologie des systèmes) et le Centre de recherche allemand contre le cancer (DKFZ).

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives institutionnelles du DKFZ. Attention: Afin de prévenir la contamination de RNase échantillons, prendre des précautions de base pour éviter la contamination RNAse et préparer tous les tampons avec de l&#39;eau traitée au DEPC. 1. Préparation de saccharose dégradés <ol><li> Préparer 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 et solutions de saccharose 50% (voir le tableau 1). Commencer à préparer des gradients en ajoutant lentement 2 ml d&#39;une solution de saccharose à 50% à la partie inférieure d&#39;un tube d&#39;ultracentrifugation polyallomère. Geler la couche en plaçant les tubes pendant 20 minutes à -80 ° C. </li><li> Ajouter les couches suivantes à réduire les pourcentages de saccharose avec des étapes de congélation entre les deux, de se retrouver à 17,5% de saccharose. Gardez gradients sur la glace pendant plus de solutions de saccharose afin d&#39;éviter la décongélation des couches sous-jacentes. </li><li> Préparer des gradients de saccharose fraîchement un jour avant utilisation et les conserver à 4 ° C. Alternatively préparer gradients à l&#39;avance, conserver à -80 ° C et décongeler à 4 ° C la nuit avant l&#39;expérience. </li></ol> 2. Préparation de tissu (cordon et / ou du cerveau épinière) <ol><li> Anesthésier la souris par une overdose de xylazine et de kétamine en NaCl et perfuser transcardiaque avec 20 ml de sels équilibrée solution de Hank (HBSS) contenant 200 ug / ml CHX ribosomes qui immobilise sur transcripts associés. Confirmez anesthésie appropriée par l&#39;absence de réponse à pincées d&#39;orteil. </li><li> Extrait rapidement les tissus. Ouvrez la dorsale de crâne et extraire le cerveau. Effectuer une laminectomie de l&#39;ensemble thoracique de la colonne vertébrale lombaire et extraire la moelle épinière. Utiliser le cerveau entier (~ 400 mg) ou un morceau de la moelle épinière (~ 90 mg) de 4 cm, respectivement. </li><li> Transfert tissu dans de la glace froide homogénéisation tampon A (voir le tableau 1) (moelle épinière: 1 ml; cerveau: 4 ml) et couper en petits morceaux avec un scalpel propre pour permettre une absorption accrue de cycloheximide. Perform toutes les autres étapes sur la glace. </li><li> Incuber pendant 15 min et homogénéiser le tissu mécaniquement à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur Dounce. Homogénéisation soigneusement contrôlée est nécessaire de veiller à ce que les noyaux restent intacts. Traiter tous les échantillons de la même manière à assurer la comparabilité. Remarque: pour les tissus du cerveau: Broyer le tissu par 5 coups avec un pilon hermétique. Pour les tissus de la moelle épinière: perturber par 5 coups avec un pilon à ajustement lâche, suivie par 5 autres coups d&#39;un pilon avec ajustement serré. </li><li> Prenez aliquotes (400 pi pour le cerveau et 200 pi de la moelle épinière), gel flash et conserver à -80 ° C pour l&#39;isolement de l&#39;ARN total. </li><li> Retirer les noyaux et les cellules sans perturbation et de fragments de tissus par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 ° C. Centrifugation à faible vitesse empêche la perte des ribosomes. </li><li> Lyse des fragments de membranes dans le surnageant exempt de germes pendant 30 min par ajout de NP-40 et les détergents désoxycholate de sodium (chacun à une concentration finale de 1%). </li></ol><ol><li> Cette étape élimine les composants gras à partir de l&#39;échantillon qui, autrement, masquer le signal dans le profil de polyribosome. Tout d&#39;abord, pré-refroidissement des seaux d&#39;ultracentrifugation et rotor à 4 ° C et préparer 2 M, 1,1 M et 0,9 M solutions de saccharose (voir le tableau 1). </li><li> Mélanger lysat avec un 1,22 volumes de solution 2 M de saccharose et de les transférer dans un tube en polyéthylène d&#39;ultracentrifugation. Remplissez tous les tubes à volume égal de 10 ml avec 1,1 M solution de saccharose, puis recouvrir soigneusement avec 0,9 M solution de saccharose. </li><li> Placer les tubes d&#39;ultracentrifugation dans des seaux d&#39;ultracentrifugation pré-réfrigérés. Centrifuger pendant 3 heures à 100 000 g à 4 ° C. Au cours de ce processus les ribosomes se déposer dans le culot alors que les composants gras flottent et restent dans le surnageant. </li></ol> 4. Gradient de saccharose fractionnement <ol><li> Retirer le surnageant et dissoudre le culot dans un tampon d&#39;homogénéisation B (voir le tableau 1 </strong&gt;). Mesurer l&#39;absorbance à 260 nm pour chaque échantillon en utilisant un appareil équivalent ou Nanodrop et normaliser les quantités à charger en fonction de la valeur d&#39;absorbance. </li><li> Placez gradients de saccharose (préparation est décrite dans une section précédente) dans les seaux d&#39;ultracentrifugation pré-réfrigérés. échantillons soigneusement sur le dessus de la pente de la couche. Ajouter un gradient de saccharose à blanc comme témoin technique. </li><li> Ajuster le poids de chaque godet avec un tampon d&#39;homogénéisation. Centrifuger les échantillons de 1,5 h à 285 000 xg à 4 ° C. </li><li> Commencez à préparer la Isco fractionnement 30 min avant la fin de la centrifugation. Si un autre modèle de colonne de fractionnement est utilisée, suivre le protocole du fabricant. <ol><li> Réglez la sensibilité appropriée (0,2 AUFS pour cerveau ou 0,05 AUFS pour la moelle épinière) pour la lampe UV et l&#39;allumer pour se réchauffer. Assemblez le perceur du tube, connectez via la pompe de roulement à une solution de saccharose à 60% par le perceur de tube. </li><li> Testez la configuration en pompant saccharose (flux rate: 1 ml / min), en particulier s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites dans les tuyaux qui va introduire des bulles dans le gradient. </li><li> Fond flan absorption en pompant manuellement tampon à gradient dans le détecteur d&#39;UV et de corriger la ligne de base. </li></ol></li><li> Retirez délicatement les seaux d&#39;ultracentrifugation contenant les gradients de saccharose avec des échantillons sédimentés du rotor et placer sur la glace. Éviter tout heurt des gradients pour éviter la perte de résolution. </li><li> Gradients s&#39;exécuter sur la colonne de fractionnement. Exécutez gradients vides premier à évaluer l&#39;absorption de fond et d&#39;assurer la configuration technique adéquate. <ol><li> Attacher le gradient de détecteur UV et percer le fond du tube avec le dispositif de perçage de tube. Démarrer le pompage de 60% de saccharose, ce qui déplace le gradient vers le haut avec des échantillons sédimentés à travers le détecteur d&#39;UV et dans le compte-gouttes. </li><li> L&#39;absorbance à 260 nm est documentée pour générer le profil d&#39;absorption de l&#39;échantillon, avec des pics indiquant la sédimentationtion des ARNm associés à des sous-unités ribosomiques, monosomes et augmenter par la suite le nombre de ribosomes. </li></ol></li><li> Prélever des échantillons en 20 fractions par le compte-gouttes (600 pi de chacun, en tubes de 2 ml). </li></ol> 5. RNA de fractions individuelles <ol><li> Ajouter 10% SDS à une concentration finale de 1% à chaque fraction et bien mélanger afin de déployer des protéines et dissocier les ribosomes. A ce stade, les échantillons peuvent être congelés à -80 ° C. Selon la question à traiter, les fractions peuvent être regroupées en fonction du profil d&#39;absorbance. </li><li> Isoler l&#39;ARN à l&#39;extraction phénol / chloroforme acide, ce qui supprime également des traces de contamination d&#39;ADN. <ol><li> Ajouter un volume d&#39;acide phénol / chloroforme (préchauffé à la température ambiante) pour chaque échantillon, la chaleur pendant 10 min à 65 ° C et la pression de sortie sous la hotte après. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 20 minutes à 17 000 xg à température ambiante. Soigneusement transférer phase aqueuse à 1.5 mltube. Soyez conscient de l&#39;inversion de phase dans les fractions de saccharose plus denses, où la phase aqueuse peut être au fond après centrifugation. </li><li> Ajouter un volume d&#39;isopropanol, 1/9 d&#39;acétate de sodium en volume (pH 5,2) et 1 ul de chaque échantillon GlycoBlue afin de précipiter l&#39;ARN. Conserver les échantillons au moins 1 h à -80 ° C. </li><li> Centrifuger pendant 30 min à 17 000 xg et 4 ° C. GlycoBlue fournit une visualisation de la pastille. Retirer le surnageant, laver culot une fois avec de la glace froide 80% d&#39;éthanol et de l&#39;air culot sec. Dissoudre le culot dans RNAse eau libre. </li></ol></li><li> Quantifier quantité d&#39;ARN par Nanodrop et analyser l&#39;intégrité de l&#39;ARN par une puce Bioanalyzer. ARN qui est obtenu par le protocole présenté est adapté à tous état de l&#39;art des tests à haut débit, y compris puces à ADN et le séquençage profond. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Bien polyribosome fractionnement n&#39;est pas une nouvelle technique, il demeure une question particulièrement difficile. Sur la base du matériau d&#39;entrée, l&#39;optimisation substantielle peut être nécessaire. Cela est particulièrement le cas pour les échantillons in vivo dans le SNC, où la quantité de matière est souvent une limitation et gras composants des tissus entravent l&#39;isolement des ARNm de traduction. La plupart des protocoles de fractionnement publiés portent sur ​​des levures ou des lignées de cellules de mammifères, et il existe des protocoles établis pour le cerveau 12,13,14. En revanche, il n&#39;y a pratiquement plus de publications décrivant le fractionnement de la moelle épinière, et les protocoles précédents nécessitent la moelle épinière d&#39;un grand nombre d&#39;animaux à mettre en commun 15. Pour ces raisons, plusieurs modifications essentielles ont été apportées pour adapter le protocole de fractionnement pour les tissus du système nerveux central, y compris la simple moelle épinière de souris. Immobilisation ribosome avec cycloheximide est effectuée pendant la perfusion de l&#39;animal pour éviter la dissociation des ribosomes During le long processus d&#39;extraction de tissu. Par la suite, les ARN polysomique sont extraits d&#39;une manière spécifique afin de maximiser le rendement en polyribosome. Tout d&#39;abord, contrôlée homogénéisation du tissu par douncing, maintient le noyau intact et empêche la contamination de l&#39;ADN. Le noyau est ensuite retiré de manière fiable par centrifugation. La combinaison de détergents NP-40 et le désoxycholate de sodium assure une lyse du réticulum endoplasmique et la libération de ses membranaires associées ribosomes. En outre, les composants absorbant les UV dans la myéline riche lipides masquent les profils de polyribosome. Myéline flottation est donc nécessaire, où les composés denses tels que polyribosomes sont culottées et composés plus légers tels que la myéline flotteur et 16 sont supprimés. Polyribosomes sont ensuite sédimentés sur un gradient de saccharose à 17,5% à 50%. Au lieu de la superposition et le gel manuellement chaque couche de saccharose, des gradients peuvent également être préparés en utilisant un mélangeur à gradient. Extraction d&#39;ARN à partir de fractions à l&#39;aide acide phénol / chloroforme permet DNA pour être enlevée avec un minimum de perte de l&#39;ARN. Cependant, l&#39;inversion de phase peut se produire à des fractions de saccharose denses (ci-dessus fraction 16). Ce protocole offre des avantages sur les autres méthodes classiques qui traitent le niveau de la traduction. Par exemple, à la fois la mesure de phosphorylée S6 (un marqueur de traduction de premier plan) ainsi que l&#39;étiquetage des chaînes naissantes avec des radio-isotopes fournissent des informations sur les niveaux de traduction mondiales mais révèlent peu sur ce qui est spécifiquement en cours de traduction. Polyribosome fractionnement, d&#39;autre part, permet non seulement l&#39;évaluation globale de la traduction, mais également de l&#39;identité de traduction et les ARNm des protéines régulatrices associées. PCR quantitative en temps réel peut être réalisée sur des ARN isolés pour une lecture rapide de ARNm sélectionnés, et les microréseaux et le séquençage de prochaine génération ARN peut être réalisée pour des études larges de génome. Les optimisations présentées ici permettent la technique pour être utilisé avec des quantités minimes de tissus du système nerveux central, donc diminuement le nombre d&#39;animaux nécessaires et améliorer la qualité expérimentale globale en réduisant le temps de traitement des tissus. D&#39;autre part, cette technique ne peut pas distinguer les ribosomes au point mort de ceux traduction. Transcriptions portant ribosomes bloqués seront sédiments dans les fractions lourdes, et cela doit être gardé à l&#39;esprit lors de l&#39;interprétation des données. Il existe des techniques récentes communiquées, à savoir RiboTaq et TRAP, dans laquelle les ribosomes sont étiquetés avec des étiquettes ou des journalistes épitopes respectivement d&#39;une manière spécifique de type cellulaire et ARNm isolé par immunoprécipitation 17,18 associés. Cette technique peut être couplé à polyribosome fractionnement d&#39;offrir une grande résolution lire des populations cellulaires spécifiques. Pied-impression ribosome est une autre technique nouvelle qui implique la digestion de nuclease pour générer des petits fragments, ou «traces», des ARNm qui sont protégées par les ribosomes. Les bibliothèques sont ensuite générés à partir de ces empreintes et séquencés. Cette méthode provIdes une analyse complète du génome spécifique de codon sur la traduction et est en mesure d&#39;identifier les ribosomes bloqués, non-AUG codons et les petits amont cadres de lecture ouverts, qui ne peuvent être atteints par polyribosome fractionnement 19. Cependant, polyribosome fractionnement peut être couplé à un profilage ribosome pour l&#39;isolement des fragments digérés contenant des ribosomes simples, enrichissant ainsi les espèces moléculaires nécessaires à la préparation de bibliothèque dans lequel la pureté élevée de l&#39;échantillon est souvent nécessaire. Pris ensemble, polyribosome fractionnement est une méthode souple et durable avec la signification peut être couplé à diverses applications en aval, y compris des dosages génomiques telles que le séquençage de largeur de la prochaine génération.

L&#39;expression génique est déterminée par l&#39;action combinée de la transcription, la traduction et la stabilité de l&#39;ARNm et des protéines, avec la traduction en gardant l&#39;effet le plus prédominant 1. Il est maintenant évident que chacune de ces étapes est très réglementé. Micro-ARN, la formation de granules d&#39;ARN alternatif, et la polyadénylation cytoplasmique quelques exemples de régulation post-transcriptionnelle de l&#39;expression génique 2,3. Chacun de ces mécanismes découple la transcription de la traduction et influe sur le protéome dans le système biologique d&#39;intérêt. Ainsi, sans surprise, seuls les niveaux d&#39;ARNm sont une lecture imparfaite des niveaux de protéines 4. Protéomique quantitative fournit l&#39;évaluation la plus directe de l&#39;expression génique, mais malgré les progrès récents, il ya encore des limitations considérables sur la sensibilité et la résolution de la séquence de la protéine. Par conséquent, l&#39;adressage translatome, le répertoire des ARNm traduire, offre un excellent compromis entre l&#39;étude de latranscriptome et protéome. Il est plus précis que la transcriptomique en évaluer l&#39;expression finale de gène, et fournit à la fois une couverture plus élevée et la résolution de la séquence de la protéomique. Dans les systèmes de mammifères, la plupart des événements de la traduction commence par l&#39;initiation de cap-dépendante. Un groupe de facteurs d&#39;initiation eucaryote avec la petite sous-unité ribosomique 40S assembler à la coiffe 5 &#39;d&#39;un ARNm. Le complexe balaie ensuite l&#39;ARNm et en atteignant le codon AUG, recrute la grande sous-unité ribosomique 60S pour former un ribosome 80S complets. Le produit de l&#39;étape d&#39;élongation avec le ribosome se déplaçant le long de l&#39;ARNm, avec des facteurs d&#39;élongation aider l&#39;incorporation d&#39;acides aminés à partir des ARNt chargés à la chaîne peptidique naissante. Ribosomes multiples peuvent passer le long d&#39;un seul ARNm simultanément et le nombre de ribosomes associés a été démontré que la corrélation avec le taux de synthèse des protéines 5,6. Cela rend le chargement ribosomique une indication fiable pour translation et permet la séparation de la traduction des ARNm activement sur la base de la vitesse de sédimentation. En plus de la quantification de la traduction des ARNm, des informations de séquence peut être obtenue à identifier des motifs impliqués dans la régulation de la traduction. Aussi ARN des protéines de liaison et d&#39;autres facteurs de traduction peuvent être isolés à partir de différentes fractions, ce qui facilite l&#39;étude et à la découverte de protéines régulatrices associées. Dans le système nerveux, le contrôle traductionnel a été liée à des processus tels que le stockage de l&#39;ARNm, le transport et la synthèse des protéines local. cônes de croissance se sont avérés héberger un pool d&#39;ARNm spécifique localisée distinctes du reste de l&#39;axone 7. En outre, les axones possèdent la capacité de synthétiser localement des protéines 8,9. En conséquence, le contrôle local de la traduction est devenue un sujet crucial de l&#39;étude en neurobiologie. Le potentiel de polyribosome fractionnement pour traiter cela a été illustré dans plusieurs études, dans lequel la technique a été utilisée pourexaminer le guidage axonal dans le développement de la moelle épinière, et a démontré la traduction dépendante de l&#39;activité de BDNF dans le cerveau de 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Plusieurs processus sont impliqués dans l&#39;expression du gène y compris la transcription, la traduction et la stabilité des ARNm et des protéines. Chacune de ces étapes sont strictement réglementées, affectant la dynamique finales de protéines abondance. Divers mécanismes réglementaires existent à l&#39;étape de traduction, ce qui rend les taux d&#39;ARNm seul un indicateur fiable de l&#39;expression des gènes. En outre, la réglementation locale de la traduction des ARNm a été particulièrement impliquée dans les fonctions neuronales, décalage »translatomics» au centre de l&#39;attention en neurobiologie. La méthode présentée peut être utilisée pour la transcriptomique de pont et de la protéomique. Nous décrivons ici des modifications essentielles à la technique de fractionnement polyribosome, qui interroge le translatome basée sur l&#39;association d&#39;ARNm traduits activement à plusieurs ribosomes et leur sédimentation différentielle dans des gradients de sucrose. Traditionnellement, travailler avec des échantillons in vivo, en particulier de la central Système nerveux central (SNC), s&#39;est avérée difficile en raison des montants limités de matériel et la présence de composants de tissus gras. Pour résoudre ce problème, le protocole décrit est spécifiquement optimisé pour une utilisation avec une quantité minimale de matière CNS, comme en témoigne l&#39;utilisation de simple moelle épinière et le cerveau de souris. En bref, les tissus du système nerveux central sont extraites et ribosomes traduisant sont immobilisés sur des ARNm avec cycloheximide. Myéline flottation est ensuite effectuée pour éliminer les composants riches en lipides. Le fractionnement est effectué sur un gradient de saccharose où les ARNm sont séparés selon leur chargement ribosomique. Fractions isolées sont adaptés à une gamme d&#39;essais en aval, y compris les nouvelles technologies d&#39;analyse du génome entier.

La figure 2 montre les profils de polyribosome représentatifs après fractionnement. Les profils de cerveau et la moelle épinière montrent les courbes d&#39;absorption caractéristiques comme décrit précédemment pour les lignées cellulaires. ARNm liés à de petites sous-unités ribosomiques (40S) de sédiments à des fractions plus légères et apparaissent d&#39;abord comme un pic sur le profil, suivie par la grande sous-unité ribosomique (60S) et monosome (80S) __gVirt_NP_NNS_NNPS&lt;__ ARNm liés. ARNm liés à plusieurs ribosomes sédiments à des fractions plus lourdes, avec des pics plus tard en indiquant l&#39;augmentation du nombre de ribosomes liés. Traduction globale peut être évaluée à partir du profil. A titre d&#39;exemple, le tissu cérébral a une polyribosome supérieur à monosome rapport que le tissu de la moelle épinière, ce qui indique une traduction plus actif. ARN extrait à partir de fractions individuelles ont été évaluées par bioanalyser, montrant la distribution de rARN 18S et 28S. 18S rRNA apparaît plus tôt dans le profil, en conformité avec les petites sous-unités ribosomiques sédimentation dans sucr briquet<html> fractions d&#39;oses. Les rendements typiques d&#39;ARN total sont de 10-20 mg pour le cerveau et 2-4 pg de la moelle épinière. Les rendements d&#39;ARN à partir de fractions individuelles sont jusqu&#39;à 4 pg et 0,8 pg pour le cerveau et la moelle épinière, respectivement, en fonction de la fraction. Un gradient de saccharose flan montre déjà une certaine absorption de fond à 260 nm, en raison de la présence de DTT. Ce fond peut être soustraite au cours de l&#39;analyse des données afin de normaliser les valeurs d&#39;échantillon. traitement EDTA effondré les pics de polyribosome, démontrant le profil de sédimentation est due à la traduction. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Flux de travail et les applications potentielles de in vivo polyribosome fractionnement.&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Profils Figure 2. (A) des profils de polyribosome typiques de cerveau et la moelle épinière, à l&#39;évaluation de l&#39;ARN extrait par bioanalyser. (B) de distribution de l&#39;ARNm GAPDH sur fractions par qRT-PCR. (C) polyribosome de gradient vide et le cerveau avec et sans traitement de l&#39;EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Tampon de gradient 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM de MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml de cycloheximide (CHX), 2 mM de dithiothréitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 17,5% </td><td> 8,67 g de saccharose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 25,6% </td><td> 12,8 g de sucrose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 33,8% </td><td> 16,9 g de sucrose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 41,9% </td><td> 20,95 g de saccharose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose à 50% </td><td> 25 g de saccharose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogénéisationUn tampon </td><td> 0,25 M de saccharose, 50 mM de Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 pg / ml CHX, inhibiteur de la protéase complète 1x Roche, DTT 1 mM, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Solution de saccharose 2M </td><td> 68,4% de saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inhibiteur de protéase complet 1x Roche, 1 mM de DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1,1 M solution de saccharose </td><td> 38,5% de saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inhibiteur de protéase complet 1x Roche, 1 mM de DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 M solution de saccharose </td><td> 30,8% de saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inhibiteur de protéase complet 1x Roche, 1 mM de DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampon B </td><td> 0,25 M de saccharose, 50 mM de Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, le désoxycholate de sodium à 1% </td><td> 200 pg / ml CHX, inhibiteur 1x Roche complète de la protéase, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des tampons et des solutions.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d&#39;étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l&#39;isolement et la comparaison de l&#39;ARN total à ribosome fractions d&#39;ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K vues.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d'étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l'isolement et la comparaison de l'ARN total à ribosome fractions d'ARN liés. 

Vidéo: In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Recherche

Neurosciences

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Evaluation fonctionnelle des neurotoxines biologique dans les cultures en réseau de cellules souches dérivées neurones système central nerveux

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...