Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour leurs conseils, discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Nous aimerions également remercier particulièrement Marta Koch et Bassem Hassan pour la suggestion excellente que nous attendre 1,5 heures CSA avant la dissection des cerveaux pour la culture dans les expériences de rénovation. Nous remercions également le centre d&#39;imagerie NHGRI pour l&#39;utilisation de leur microscope confocal. Ce travail a été soutenu par le Programme des neurosciences fondamentales du programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS003106).

A. Préparation des médias <ol><li> Préparez le support complets par le filtre-stérilisation Drosophila de Schneider médias supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Les médias devraient être préparées à chaque fois. Alternativement, une partie aliquote de la pré-congelés médias peuvent être décongelés avant chaque utilisation. </li><li> Avant la mise en culture, ajouter 10 g / ml d&#39;insuline et 2 pg / ml ecdysone aux médias. Les médicaments ont été préparés comme les stocks de concentrés et congelés dans de petites aliquotes. Aliquotes décongelées ne sont pas recongeler. </li><li> Toutes les solutions de travail doit être maintenue à 25 ° C. </li></ol> La culture de Brains larvaires 1. Sélection et dissection des cerveaux des larves <ol><li> Ajouter 500 ul de médias pour un insert de 12 mm Millicell culture cellulaire. Les cerveaux disséqués sera placé dans ces inserts pour faciliter immunomarquage facile. </li><li> Ajouter une petite quantité de milieu préparé à un verre de montre de dissection. </li><li> Uchanter une petite spatule, ramasser les larves de troisième stade errance et de les placer dans le verre de montre. (Nous présumons que la méthode culture ex vivo s&#39;appliquerait aussi bien pour les larves de premier stade larvaire ou la deuxième, mais nous n&#39;avons pas testé cela.) </li><li> Tenir l&#39;extrémité postérieure de la larve avec une paire de pince, ouvrir avec précaution jusqu&#39;à l&#39;extrémité antérieure avec une deuxième paire de pince n ° 5. </li><li> Rapidement disséquer le cerveau, en gardant la corde nerveuse ventrale intacte. </li></ol> 2. La culture ex vivo de disséqués Brains larvaires <ol><li> En utilisant des pointes de pipette pré-humides, de transférer le cerveau avec précaution dans les inserts de culture cellulaire, les pré-remplis avec les médias. </li><li> Cerveaux de transfert, dans les médias, à un incubateur à 25 ° C jusqu&#39;à ce que le temps désiré-point est atteint. Cette méthode fonctionne efficacement pour un maximum de 48 heures dans la culture. </li><li> Remplacer les médias à 8 heures. Au-delà de ce que, remplacer la moitié des médias toutes les 5-6 heures. </li></ol> 3. La manipulation pharmacologique deBrains larvaires Cette méthode de culture ex vivo peuvent être utilisés pour corroborer pharmacologiquement interactions génétiques déjà démontré dans notre laboratoire 1. <ol><li> Ajouter 100 roscovitine uM et 100 uM olomoucine aux médias préparés. </li><li> Transfert cerveaux disséqués à ce média. </li><li> Cerveaux Culture à 25 ° C pendant 24 heures. </li><li> Remplacer les médias à 8 heures. Au-delà de ce que, remplacer la moitié des médias (avec des médicaments) toutes les 5-6 heures. </li></ol> La culture de Brains chrysalides 1. Sélection des pupes pour la dissection <ol><li> Marquer les pupes blanc sur les bouteilles ou flacons. </li><li> Ne choisissez que les nymphes sont complètement blancs. Les pupes avec n&#39;importe quelle sorte de coloration ne devrait pas être inclus. </li><li> Cette étape est 0 heures après la formation Pupe (APF). </li><li> Ces nymphes sera prêt pour la dissection de 1,5 heures après le marquage. Cette étape est cruciale pour assurer que la taille pour le développement survient dans l&#39;ex vivo </em&gt; la culture. </li></ol> 2. Dissection de pupes <ol><li> Ajouter 500 ul de médias pour un insert de 12 mm Millicell culture cellulaire. (Les cerveaux disséqués sera placé dans ces inserts pour faciliter immunomarquage facile). </li><li> Une fois le temps désiré-point a été atteint, ajouter une petite quantité de milieu préparé à un verre de montre de dissection. </li><li> En utilisant une petite spatule humide, ramasser les pupes préalablement marqué pour la dissection et les placer dans le verre de montre. </li><li> Tenir l&#39;extrémité postérieure de la pupe avec une paire de pince, ouvrir avec précaution l&#39;extrémité antérieure de l&#39;affaire nymphe avec une deuxième paire de pince n ° 5. </li><li> Rapidement disséquer le cerveau, en gardant la corde nerveuse ventrale intacte et fixée. </li></ol> 3. La culture ex vivo de disséqués Brains chrysalides <ol><li> Transfert du cerveau avec précaution dans les inserts de culture cellulaire, les pré-remplis avec les médias. </li><li> Cerveaux de transfert, dans les médias, à un incubateur à 25 ° C jusqu&#39;à la désirée de temps point est atteint. Nous avons utilisé cette méthode pour un maximum de 10 heures dans la culture de l&#39;expérience le montre, mais il peut être étendu à de plus longues périodes d&#39;observation et de traitement, si nécessaire. </li><li> Pour le temps des points de plus de 8 APF heures, remplacer le support toutes les 5-6 heures. </li></ol> A partir de cette étape, le protocole reste inchangé pour les larves et les nymphes. B. Fixation Brains disséqués <ol><li> Une fois le temps désiré-point est atteint, retirer le support et ajouter 500 ul de formaldéhyde à 4% dans du PBS 1X avec 0,5% de Triton X-100 (PBST) pendant 30 minutes, en remplacement de frais avec du formaldéhyde après 15 minutes. </li><li> Assurez-vous de ne pas laisser le cerveau à sécher tout en remplaçant les médias avec un fixateur. </li><li> Laver formaldéhyde avec quatre 10 lavages minute de 1x PBS avec 0,5% TritonX-100 (PBST). </li></ol> C. La coloration Brains fixes <ol><li> Après le formaldéhyde a été lavé, bloquer les cerveaux pendant 1 heure dans une solution de blocage de 1x PBS avec 1% normalDu sérum de chèvre et 1% de sérumalbumine bovine. </li><li> Ajouter anticorps primaires réalisées dans une solution de blocage. </li><li> Cerveaux incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain matin, laver les anticorps primaires avec quatre 10 lavages minute de PBST. </li><li> Ajouter Anticorps secondaires faites dans une solution de blocage. </li><li> Laisser à température ambiante pendant 4 heures. </li><li> Laver Anticorps secondaires avec quatre 10 lavages minute de PBST. </li></ol> D. Montage Brains fixées et colorées pour la microscopie <ol><li> Equilibrer les cerveaux dans les médias Vectashield de montage pendant 1 heure. </li><li> Montez les cerveaux sur lames de verre en utilisant les médias Vectashield de montage. </li><li> Placez les éclats de verre de chaque côté du cerveau avant de monter la lamelle. Cela empêche le cerveau d&#39;être écrasé, tout en gardant l&#39;échantillon suffisamment mince pour analyser tous les plans focaux avec un microscope confocal. Brains étaient à peu près orientée lors du montage pour faciliter la visualisation des points d&#39;intérêt. Lorsque cela est nécessaire,des images du cerveau ont été mis en rotation avec le logiciel Imaris pour fournir une vue optimale de la documentation et la mesure. </li><li> Couvercle d&#39;étanchéité glisse avec du vernis à ongles transparent. </li><li> Magasin glisse abri de la lumière. </li></ol> E. Les résultats représentatifs La figure 1 montre un panel de troisième stade larvaire de cerveaux (A) de type sauvage mouches et (B) les mouches qui expriment un dérivé dominant négatif de Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Les deux expriment l&#39;actine-GFP (green) dans les neurones gamma MB. Comme décrit précédemment (Trunova et al., 2011), il ya une région dans les axones proximaux de neurones gamma de type sauvage qui ne parvient pas à accumuler des actine-GFP, ce qui apparaît-elle comme une «zone claire» (A, support), et fasciclin 2 protein (rouge) s&#39;accumule dans les axones que jusqu&#39;à la frontière de cette zone ventrale (ligne blanche horizontale). La ligne en pointillé dans le troisième panneau de la figure 1 (A) indique la position de la MB, en soulignant l&#39;actedans la «zone claire» et son bord ventral. Dans exprimant mouches Cdk5DN, la zone claire est absent actine (B) et deux Fasciclin (FasII) immunoréactivité s&#39;étend à travers cette région dorsale. (Notez que des nombres variables de FasII positif du projet axones horizontalement à travers le Mo; ce ne sont pas pertinentes pour le phénotype). La barre d&#39;échelle représente 20 um. Grâce à notre méthode de culture ex vivo, nous avons traité des mouches de type sauvage avec une combinaison de roscovitine et olomoucine, des inhibiteurs pharmacologiques de Cdk5 activité. La figure 2 montre un panel de troisième stade larvaire cerveaux de contrôle (A) et traités par le médicament (B ) de type sauvage. mouches Semblable à mouches exprimant un dominant négatif Cdk5 construction, les cerveaux traités avec des inhibiteurs de cdk5 pour 24 heures, montrent la perte caractéristique de l&#39;actine zone claire et une rupture dans la limite FasII (entre crochets). Des lignes blanches montrent la position de type sauvage limite FasII. La barre d&#39;échelle représente 20 um. Figure 3 montre une série représentative de corps pédonculés drosophile de 0-10 heures du CSA, marqué par une membrane-cible mCD8-GFP (green). Les parenthèses indiquent le calice, qui est, les projections dendritiques de la MB. Avant la métamorphose, on peut voir les axones MB coursing dorso-ventralement en faisceaux épais, ainsi que d&#39;une «brume» du signal fluorescent provenant de la dendritique dense arbre (support). Panneau de cerveaux A spectacles disséqués à l&#39;heure indiquée. Notez la taille des dendrites dans la région indiquée par les parenthèses, de telle sorte que par 6-8 heures CSA, la brume du signal dendritique est parti (si le signal n&#39;est pas affecté axonale). Brains dans le panneau B ont été disséqués à 0 heures CSA, avant le pic interne ecdysone (Truman et Riddiford, 2002), et cultivés ex vivo comme indiqué. Ceux-ci révèlent pas d&#39;élagage de développement des dendrites, mais plutôt le signal dendritique persiste à 10 heures du CSA. Pour contourner cela, les nymphes sont marqués à 0 APF heures, mais disséqués à 1,5 heures CSA et cultivé. Vitrel C montre une série représentative de ces corps pédonculés drosophile de 0-10 APF heures. Comme dans les échantillons non-cultivées, le signal dendritique est indétectable par 8 heures CSA. La barre d&#39;échelle représente 20 um.

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	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<html> Chroniques les manipulations génétiques de la structure des tissus et la fonction, y compris les mutations et l&#39;expression des transgènes, produisent typiquement une combinaison d&#39;effets immédiats et tardifs conséquences indirectes qui peuvent être très difficiles à séparer. En complément des méthodes génétiques à la pharmacologie peut faciliter les interrogatoires de l&#39;évolution dans le temps derrière un phénotype. Par exemple, cela a été une approche puissante pour disséquer les c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Drosophila de Schneider médias </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (inactivé par la chaleur) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdysone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 um </td></tr><tr><td> Lolomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 um </td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Inserts de culture cellulaire Millicell </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 et </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n ° 5 Pince </td><td> Outils belle science </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Couverture de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

Nous décrivons une méthode pour la culture ex vivo du cerveau chez la drosophile entiers. Ceci peut être utilisé comme un contrepoint à des manipulations génétiques chroniques pour étudier la biologie cellulaire et le développement des structures cérébrales centrales en permettant des interventions pharmacologiques aigus et d&#39;imagerie en direct des processus cellulaires. Comme un exemple de la technique, avant de travailler à partir de notre laboratoire 1 a montré que d&#39;un compartiment non comptabilisé antérieurement subcellulaire se situe entre les compartiments axonaux et somato d&#39;axones du cerveau chez la drosophile centrale. Le développement de ce compartiment, appelé le segment initial de l&#39;axone (AIS) 2, a été montré génétiquement dépendre de la kinase spécifique des neurones cycline-dépendantes, Cdk5. Nous montrons ici que le traitement ex vivo du cerveau chez la drosophile de type sauvage larvaires avec la roscovitine Cdk5-pharmacologique spécifique et les inhibiteurs de olomoucine 3 provoque des changements dans l&#39;organisation aigus actine, etdans la localisation de la protéine de surface cellulaire Fasciclin 2, qui imitent les changements observés chez les mutants qui n&#39;ont pas Cdk5 activité génétiquement. Un deuxième exemple de la technique de culture ex vivo est prévu pour le remodelage des connexions du corps champignons embryonnaire (MB) des neurones gamma lors de la métamorphose de la larve à l&#39;adulte. Le corps du champignon est le centre de l&#39;apprentissage olfactif et de la mémoire chez la mouche 4, et ces neurones gamma élaguer leurs branches axonales et dendritiques au cours du développement nymphal et puis re-branches s&#39;étendent à un instant plus tard, pour établir le modèle innervation adulte 5. La taille de ces neurones de la MB a été démontré que la dégénérescence se produire via des branches locales neurites 6, par un mécanisme qui est déclenchée par l&#39;ecdysone, une hormone stéroïde, agissant au niveau du récepteur d&#39;ecdysone B1 7, et qui dépend de l&#39;activité de la système ubiquitine-protéasome 6. Notre méthode de culture ex vivo peut be utilisé pour interroger davantage le mécanisme de remodelage de développement. Nous avons constaté que dans le cadre de la culture ex vivo, les neurones gamma de la MB a récapitulé le processus d&#39;élagage de développement avec une évolution similaire à celle in vivo. Il était essentiel, cependant, attendre 1,5 heures après la formation puparium avant explantation du tissu pour que les cellules de commettre de façon irréversible à la métamorphose; la dissection des animaux au début de la nymphose a conduit à la métamorphose peu ou pas dans la culture. Ainsi, moyennant des modifications appropriées, l&#39;approche ex vivo de la culture peut être appliquée à l&#39;étude dynamique ainsi que les aspects de l&#39;état d&#39;équilibre la biologie du cerveau central.

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Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Cet article décrit une méthode par laquelle on peut imiter<em&gt; In vivo</em&gt; Le développement de la<em&gt; Drosophila</emCorps pédonculé&gt; dans un<em&gt; Ex vivo</emSystème de culture&gt;.

La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

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Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

13.0K vues.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Cet article décrit une méthode par laquelle on peut imiter In vivo Le développement de la Drosophila dans un Ex vivo.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Recherche

Neurosciences

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Alignement du fibergramme OCT de la rétine de la souris avec des images confocales

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès de l’imagerie rétinienne in vivo et ex vivo pour améliorer le diagnostic et le traitement du glaucome 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...