Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. Synthèse de l&#39;iridium (III) Complexe <ol><li> Peser 53,6 mg (50 pmol) de [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 et dissoudre dans 5 ml de chlorure de méthylène. Ajouter cette solution dans une fiole Erlenmeyer de 50 ml équipé d&#39;une barre d&#39;agitation. </li><li> Peser 26,2 mg (100 pmol) et de AgOTf dissoudre dans 5 ml de methanol. </li><li> Ajouter la AgOTf dissous à la [Ir (ppa) 2 Cl] 2 Solution et remuez pendant 1 heure. Remarque: Une couleur crème bouillie devrait en résulter. </li><li> Après 1 heure, on filtre la suspension à travers du gel de silice dans un flacon dram 25 x 95 mm et évaporer le solvant restant en utilisant un évaporateur rotatif (5-10 min). </li><li> Une fois la plupart du solvant est éliminée, vérifiez que un résidu huileux jaune reste dans le flacon. A ce résidu, ajouter 1 ml de methanol pour re-dissoudre le produit et lyophiliser 1-2 jours pour donner le produit solide jaune. </li><li> Caractériser l&#39;Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + produit (Ir1) par H &lt;sup&gt; 1 RMN (dans CDCl 3), ESI et UV-Vis comme décrit précédemment. 23 </li></ol> 2. Interactions de Ir1 avec divers acides aminés <ol><li> Préparer une solution à 2 mM de Ir1 dans du methanol (MW 537,10 g / mol). Vortex pour assurer la dissolution complète du solide. </li><li> Préparer 100 uM des solutions des acides aminés et des biomolécules suivantes dans une solution saline tamponnée de HEPES (HBS mM de HEPES, 100, 137 mM de NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val. </li><li> Introduire à la pipette 100 pi de chaque acide aminé dans une plaque de 96 puits noir. Ajouter 100 ul de HBS à la plaque pour servir de vide. </li><li> Ajouter 2,5 ul de la solution 2 mM Ir1 à chaque échantillon et agiter la plaque sur un agitateur de plaque pendant 10 min. </li><li> Après 10 min, d&#39;acquérir les spectres d&#39;émission des échantillons en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits (365 ex / em 400-700). <ol><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience. </li><li> Définissez le nouveau experiment à lire une analyse de fluorescence à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm et une largeur de fente de 9 nm avec le système optique à la position supérieure. </li><li> Lire l&#39;émission de 300 à 700 nm avec une taille de pas de 5 nm. </li><li> Exporter les données pour l&#39;analyse des données. </li></ol></li><li> Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l&#39;image de l&#39;émission en utilisant un transilluminateur UV. </li></ol> 3. Le titrage de Ir1 avec BNT-II <ol><li> Préparer une solution mère 1 mM de BNT-II (PM 8233,6 g / mol) dans du HBS, ainsi qu&#39;une solution à 2 mM de Ir1 dans du methanol. </li><li> De la solution mère, préparer 1 ml de 100 um BNT-II dans HBS. Vortex le tube à centrifuger pour assurer l&#39;échantillon est mélangé. </li><li> Diluer la série 100 uM BNT-II de moitié dans du HBS à une concentration finale de 1,56 uM BNT-II. </li><li> Ajouter 100 ul de chaque dilution, en triple exemplaire, avec HBS servant de blanc, pour les puits d&#39;une plaque à 96 puits. Pour chaque échantillon, ajouter 2,5 pi de 2 mM Ir1. </li><li> Shake la plaque pendant 10 min sur un agitateur de plaque. </li><li> Après agitation, lire l&#39;intensité d&#39;émission à 510 nm (excitation à 365 nm) en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits. <ol><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience. </li><li> Réglez la nouvelle expérience de lire un critère de fluorescence avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm de longueur d&#39;onde et l&#39;émission de 510 nm. Réglez la largeur de la fente pour les deux longueurs d&#39;onde à 9 nm, avec l&#39;optique à la position supérieure. </li><li> Lire la plaque et d&#39;exporter les données pour l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l&#39;image de la titration en utilisant un transilluminateur UV. </li></ol> 4. temps réel Kinetic Analyse du système Ir1 / BNT-II utilisant l&#39;interférométrie couche biologique <ol><li> Ajouter 200 pi de tampon cinétique (KB; phosphate 1x solution saline tamponnée avec 0,02% de Tween-20) à 8 puits dans la première colonne d&#39;une plaque de 96 puits noir et insérer la plaque dans le capteur en plastiquetitulaire. Transférer soigneusement 8 Ni (II) biocapteurs NTA à la première colonne dans le support de matière plastique de telle sorte que les pointes sont mises en suspension dans les puits de tampon. Placer le support de matière plastique sur le côté gauche de l&#39;instrument d&#39;interférométrie. </li><li> Préparer un 2 ml d&#39;une solution 0,5 M de BNT-II en Ko. </li><li> Préparer 500 ul d&#39;une solution 10 uM de Ir1 kb, et on dilue en série par la moitié vers le bas à 0,156 pM en Ko. </li><li> Pour une nouvelle plaque et noir 96, pipette 200 pi de Ko à tous les 8 puits dans la colonne A et C. </li><li> De la même plaque, une pipette 200 ul de la solution 0,5 uM BNT-II dans les puits dans la colonne B. </li><li> Introduire à la pipette 200 ul de chaque dilution de Ir1 dans la colonne D, en commençant par KB comme dans l&#39;ébauche ainsi D1. Ajouter les dilutions de sorte que les puits augmentation de la concentration Ir1 long de la colonne. </li><li> Placez cette plaque dans l&#39;instrument à la droite de la plaque contenant les capteurs de pré-mouillage. </li><li> Dans le logiciel biocouche d&#39;interférométrie, mettre en place une base Kinetic expérience en définissant les conseils plaque, le dosage, et de capteurs. <ol><li> Pour définir la plaque, sélectionnez une colonne sur l&#39;écran, faites un clic droit et choisissez la définition appropriée pour les puits. Sélectionnez &quot;tampon&quot; pour les colonnes A et C, &quot;Load&quot; pour la colonne B, et «échantillon» pour la colonne D. </li><li> Définir le dosage dans l&#39;onglet suivant en ajoutant les étapes suivantes (Cliquez sur &quot;Ajouter&quot;): équilibration (Custom), 60 sec; Chargement en cours, 120 s; Ligne de base, 60 sec; Association, 120 s; et de dissociation, 300 sec. Sélectionnez l&#39;étape d&#39;équilibrage et double-cliquez sur la colonne A. Répétez l&#39;opération pour Chargement (colonne B), Baseline (colonne C), Association (colonne D) et de dissociation (colonne C). Sélectionnez les capteurs Ni (II) NTA. </li><li> Déplacer vers l&#39;onglet suivant et confirment que les capteurs sont dans la colonne A sur le support de capteur de plastique. </li><li> Confirmer l&#39;expérience est décrite correctement, insérez un nom de fichier, veiller à ce que «l&#39;expérience de retard&quot; est cochée, et appuyez sur «Go». Note: En raison de la nature de l&#39;instrument automatisé, une fois l&#39;expérience cinétique est décrit, les étapes se produira comme programmé. </li></ol></li><li> Une fois la course cinétique est complète, traiter les données dans le logiciel de traitement prévu. <ol><li> Double-cliquez sur le dossier avec le nom de l&#39;intérêt dans la partie inférieure du panneau sur la gauche. Ensuite, double-cliquez sur le dossier correspondant à la rubrique «Kinetics&quot; dans la partie supérieure du panneau. Allez sur l&#39;onglet de traitement. </li><li> Cochez la case de soustraction sur la gauche pour ouvrir l&#39;écran de sélection du capteur. Faites un clic droit sur le bien A4 et modifier le type de bien de bien référencer. </li><li> Cochez la case à côté de Aligner l&#39;axe Y, et de veiller à l&#39;étape sélectionnée est Baseline. Spécifiez la plage de temps pour être les cinq dernières secondes de la ligne de base (environ 55-60 secondes). </li><li> Cochez la case pour l&#39;Inter-étape Correction et sélectionnez Aligner à la dissociation. Vérifiez que la case Savitzky-Golay filtrage est cochée et appuyez sur &quot;Process Data! ̶1; </li><li> Allez sur l&#39;onglet Analyse. Assurez-vous que &quot;Association et dissociation» est la sélection pour les étapes pour analyser et que le modèle est de 1: 1. Sélectionnez un ajustement complet local et appuyez sur &quot;Courbes Fit!&quot; </li><li> Mettez en surbrillance toutes les courbes dans le tableau et cliquez sur la droite pour régler toutes les courbes à une couleur. Ensuite, sélectionnez un mondial (complet) apte, regroupés par couleur et Rmax Unlinked par capteur. Appuyez sur &quot;Courbes Fit!&quot; Pour obtenir des données cinétiques mondiaux. </li></ol></li></ol> 5. Sur-perle Détection de BNT-II et rcHRP-II avec Ir1 <ol><li> Préparer 1 ml de chaque solution de 1 pM de BNT-II-II et rcHRP dans du HBS avec Tween (HBST; HBS avec 0,025% de Tween 20). </li><li> Diluer en série chaque protéine par moitié dans HBST à une concentration finale de 15,6 nM. </li><li> Pipette 100 pi de chaque dilution, en triple exemplaire, dans une plaque blanche à 96 puits, avec les dilutions dans l&#39;ordre de la plus faible à la plus forte concentration sur une colonne. </li><li> Pipette 10 ul de 50 um Ni (IINTA) des particules magnétiques agarose dans chaque dilution ainsi. <ol><li> Vortex le tube à centrifuger contenant les particules magnétiques après chaque pipetage pour assurer les particules restent en suspension. </li></ol></li><li> Placer la plaque sur un agitateur de plaque pendant 15 min à incuber les échantillons avec les particules. </li><li> Après cette période d&#39;incubation, placer la plaque sur un aimant de plaque de 96 puits et attendre 30 secondes pour les particules de tirer hors de la solution. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirer l&#39;échantillon original et jeter comme des déchets. Retirer la plaque de l&#39;aimant. </li><li> Ajouter 200 pi de HBST à chaque puits en utilisant la pipette multicanaux. Pomper le tampon de haut en bas plusieurs fois pour laver les particules magnétiques. </li><li> Placer la plaque arrière sur l&#39;aimant et attendre 30 secondes pour les particules de tirer hors de la solution. </li><li> Utilisation de la pipette multicanaux, retirer les 200 pi de tampon et le jeter comme un déchet. Retirer la plaque de l&#39;aimant. </li><li> Répétez les étapes 5,8 throug5.10 h deux fois pour terminer trois lavages des particules. </li><li> Ajouter 100 pi de HBST à chaque puits contenant des particules magnétiques suivie par 2,5 pi de 2 mM Ir1. </li><li> Incuber les particules avec IR1 sur un agitateur de plaque pendant 1 heure. </li><li> Après 1 heure, lire l&#39;intensité d&#39;émission à 510 nm (excitation à 365 nm) en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits. <ol><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience. </li><li> Réglez la nouvelle expérience de lire un critère de fluorescence avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm de longueur d&#39;onde et l&#39;émission de 510 nm. Réglez la largeur de la fente pour les deux longueurs d&#39;onde à 9 nm, avec l&#39;optique à la position supérieure. </li><li> Lire la plaque et d&#39;exporter les données pour l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l&#39;image de la titration en utilisant un transilluminateur UV. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium(iii)+complex+for+determination+of+antibiotics.">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Comme outils de diagnostic basés microparticules viennent à la pointe de la technologie moderne de diagnostic, la détection de biomolécules cibles directement sur la surface de la particule est un atout majeur. Les méthodes de détection moléculaires classiques, tels que ELISA et PCR, sont avantageux en ce qu&#39;ils peuvent atteindre de très faibles limites de détection 25. Cependant, ces tests nécessitent de vastes et longs protocoles réactifs. Cet essai a été conçu pour imiter les interactions en sandwich de type ELISA sans le temps et des exigences de réactif (Figure 5). En outre, le coût de la sonde Ir1 par échantillon a été estimé à environ un centime, alors que le coût d&#39;anticorps pour un ELISA typique est 0,20-0,30 $ par échantillon. Depuis les méthodes décrites ci-dessus reposent sur ​​une sonde iridium cyclometalated pour la détection du biomarqueur du paludisme, cette sonde ne serait pas sensible aux modes de défaillance communs à d&#39;autres méthodes de détection (ie. Fluorophore de quenching et la dégradation anticorps / enzyme). Histidine est unique dans ses propriétés de fixation métalliques. Le travail présenté profite de ce phénomène en remplaçant les anticorps dans un sandwich typique ELISA avec des complexes contenant des métaux. Ni (II) de NTA capture rcHRP-II sur la surface de la particule et Ir1 signale la présence de la protéine. L&#39;étape la plus critique dans l&#39;essai est de permettre aux particules magnétiques de se mélanger avec l&#39;échantillon et la sonde. Dans une plaque à 96 puits ELISA, les biomolécules et les réactifs atteindre l&#39;équilibre avec la surface à deux dimensions du fond du puits. Les particules magnétiques ont tendance à s&#39;installer hors de la solution en raison de leur base d&#39;oxyde de fer dense, ce qui réduirait les sites de liaison disponibles. Ainsi, les particules doivent être mélangées pendant le temps d&#39;essai pour assurer la liaison maximale. Lors de la conception d&#39;un réactif pour le diagnostic de la maladie, il faut garder à l&#39;esprit la forme d&#39;échantillon du patient ainsi que la concentration physiologique du biomarqueur. Pourle paludisme, la concentration de pf HRP-II dans le sang d&#39;un patient peut varier de faible à élevé picomolaire nanomolaire. Bien que ce test est cliniquement pertinente pour les niveaux plus élevés d&#39;infection, la limite de détection doit être améliorée afin de détecter les patients asymptomatiques avec une faible circulation picomolaire pf HRP-II. Dans les procédés décrits ci-dessus, la &quot;mise en marche&quot; signal généré par Ir1 se produit en présence d&#39;histidine. Alors que le biomarqueur paludisme est riche en histidine, d&#39;autres protéines sériques, comme l&#39;albumine sérique humaine et riche en histidine glycoprotéine, seraient provoquent une réponse de signal avec la sonde. Ce serait à son tour conduire à des diagnostics faux positifs. Cela rend la capture de la protéine sur la surface de la particule une étape bénéfique, en ce que la protéine d&#39;intérêt peut être extrait rapidement à partir d&#39;un échantillon de patient. En outre, la conception d&#39;une sonde bifonctionnelle, qui couple un peptide riche en histidine à un élément de reconnaissance moléculaire solide (ie. Aptamère), Pourrait ajouter une autre couche de la spécificité de l&#39;essai. Le peptide serait chargé avec l&#39;iridium avant accouplement afin de l&#39;aptamère. Dans une telle conception, la sonde Ir1 stable peut encore être utilisé, tout en réalisant une spécificité de cible avec l&#39;aptamère. Cela permettrait d&#39;application de la sonde pour détecter la HRP-II natif dans une matrice complexe (p. De plasma ou sang total) et de réduire les effets de liaison non spécifiques. Afin d&#39;améliorer encore le signal de tests de diagnostic rapide, le test pourrait être incorporé dans un système électrochimiluminescent (ECL), où pf HRP-II peut être détecté sur le TDR comme lecture électrochimique 26. Cette sonde d&#39;iridium de la prochaine génération améliorerait grandement notre bourrelet sur-dosage ELISA pour la détection de marqueurs biologiques de la maladie.

Étiquetage colorimétriques et fluorescente est une méthode importante pour la détection et le suivi des molécules biochimiques et traite 1,2. Les marqueurs fluorescents plus courantes sont de faible poids moléculaire colorants organiques 3,4, mais ces molécules ne disposent pas toujours des propriétés optiques idéales. Les colorants fluorescents sont sujettes à photoblanchiment, ont souvent des petits déplacements de Stokes, et peut avoir excitation se chevauchant et des spectres d&#39;émission. Marquage colorimétrique est souvent obtenue par l&#39;utilisation de marqueurs enzymatiques, qui ont un signal amplifié utile dans la quantification immunologique 5,6. Ces enzymes ont aussi leurs inconvénients, y compris la photosensibilité, des conditions de réaction, et la durée de conservation courte du substrat. Ces propriétés ont tendance à exiger des dosages immunologiques et des méthodes d&#39;étiquetage des protéines à faire dans des conditions bien contrôlées en utilisant des réactifs coûteux. Complexes de métaux de transition émissives ont été explorés comme une approche d&#39;étiquetage alternatif for détection biochimique. En particulier, cyclometalated Ir (III) a été étudiée dans le contexte de diodes électroluminescentes organiques (OLED) 7-9 oxygène de détection 10, la catalyse 11, et de protéines / cellule coloration 12-14. Photostabilité élevée et l&#39;efficacité quantique font de cette classe de sondes un bon candidat pour la détection de biomolécules 15,16. Il a déjà été constaté que cyclometalated Ir (III) complexes, de la forme [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, se lie irréversiblement histidine et provoquer une réponse de signal bleu-vert 12,17. Ces complexes sont non-émissif dans l&#39;état de solvento, mais lorsque l&#39;histidine déplace les molécules de solvant et se lie au centre métallique, ils libèrent un signal intense phosphorescent après irradiation UV à ondes longues. Ce signal se produit uniquement après substitution de ligand, et est le résultat d&#39;un électron à l&#39;état triplet de détente à l&#39;état du sol à travers l&#39;activation du transfert de charge métal-ligand (3 MLCT) et le ligand transfert centrée (3 LC) 8,15 voies. Ces complexes peuvent potentiellement être utilisés en tant que sondes de détection pour les protéines riches en histidine. protéines riches en histidine et leurs niveaux de régulation sont importants dans de nombreuses maladies, y compris la cirrhose du foie, le cancer et les troubles thrombique. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II) en particulier, est un biomarqueur bien validé de l&#39;infection du parasite du paludisme. Cette protéine est de 67 kDa et contient 34% d&#39;histidine, la plupart du temps au sein de caractéristiques AHHAHHAAD répétant des motifs 19. Ces répétitions histidine peuvent lier les ions métalliques libres 19 et 20 des complexes hème dans le sang de l&#39;hôte. Pf HRP-II est couramment détectée dans les milieux à faibles ressources en utilisant des tests de diagnostic rapide (TDR) immunochromatographiques, mais ces tests sont souvent inexactes en raison de conditions échantillons, la concentration de biomarqueurs bas, des normes de fabrication pauvres, et la dégradation des anticorps 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; sondes phosphorescents à base de métaux tels que le cyclometalated Ir (III) décrits ci-dessus sont des options intéressantes pour la détection de Pf HRP-II en raison de leur liaison sélective de l&#39;histidine et leurs propriétés stable et efficace émission. Dans ce document, l&#39;utilisation de [Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) pour détecter BNT-II, un peptide mimétique ramifié de Pf HRP-II est exploré 22. Cinétique de cette interaction ont été surveillées en temps réel en utilisant des techniques d&#39;interférométrie biocouche. Le test a également été adapté à un format de type ELISA sur-perle, où les limites de nanomolaires de détection ont été atteints. Ce dosage possède des avantages par rapport ELISA classiques, car il peut être réalisé en moins de deux heures avec des réactifs d&#39;anticorps libre, à la place de la 4-5 h et avec des réactifs biologiques nécessaires ELISA typiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

Ce travail décrit la synthèse d&#39;un non-émissive, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), qui déclenche un signal phosphorescent rapide, longue durée de vie quand elle est coordonnée à une histidine contenant une protéine immobilisée sur la surface d&#39;une particule magnétique. Synthèse de Ir1, avec des rendements élevés, est complet O / N et implique le fractionnement du parent cyclometalated Ir (III) dimère de chloro-ponté dans deux équivalents de complexe solvaté. Pour confirmer la spécificité, plusieurs acides aminés ont été sondés pour l&#39;activité de coordination lorsqu&#39;il est ajouté à la sonde synthétisée, et seulement histidine ont provoqué une réponse de signal. Utilisation BNT-II, un peptide mimétique ramifié du biomarqueur paludisme Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II), la sonde de l&#39;iridium a été validé comme un outil pour la détection HRP-II. Effets de trempe ont été notées dans le titrage BNT-II / Ir1 par rapport à la L-histidine / Ir1, mais ceux-ci ont été attribués à encombrement stérique et triPlet état trempe. Biocouche interférométrie a été utilisé pour déterminer la cinétique en temps réel de l&#39;interaction avec des Ir1 BNT-II. Une fois que le système a été optimisé, la limite de détection de rcHRP-II au moyen de la sonde a été trouvé que 12,8 nM en solution. Lorsque cette protéine est immobilisée sur la surface d&#39;une particule magnétique agarose 50 pm, la limite de détection était de 14,5 nM. La réponse robuste du signal de cette sonde inorganique, ainsi que sa souplesse d&#39;utilisation en solution ou immobilisé sur une surface, peuvent se prêter à l&#39;égard d&#39;une variété d&#39;applications, depuis l&#39;utilisation de l&#39;imagerie diagnostique.

Comme le montre la Figure 1, la synthèse de complexes de fractionnement impliquer la Ir1 du pont de chlorure dans le dimère de parent par précipitation du chlorure sous la forme de AgCl insoluble et d&#39;association de molécules d&#39;eau par rapport au centre métallique. La formation de Ir1 a été confirmée par RMN H 1 et ESI. En outre, des bandes caractéristiques de transfert de charge métal-ligand UV-visible et π-π * transitions ont été assignés au spectre, la validation en outre la formation de Ir1. Ce solvaté complexe présente aucun caractère émissive lorsqu&#39;il est excité à 365 nm. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Figure 1:.: Synthèse et caractérisation de pont Ir1 réaction de chlorure de fendage de Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phényl) diiridium (III) pour créer le complexe aquo Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 </sub&gt; + (Ir1). Lors de l&#39;addition de L-His à la aquo complexe dans un tampon aqueux, le signal luminescent est activé. Une fois que le complexe a été synthétisé et caractérisé, la sélectivité pour l&#39;acide aminé a été analysée comme décrit précédemment en utilisant une iridium analogique 17 similaire. La figure 2A montre que seule l&#39;histidine a déclenché une réponse de signal à 510 nm, lorsqu&#39;il est excité à 365 nm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figure 2: Acide aminé sélectivité et titrage avec de Ir1 Peptides riche en histidine (A) Interaction de 200 uM de différents acides aminés (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) avec 50 uM. Ir1 dans HBS. Scans spectrales ont été prises 400-700 nm à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm dans une plaque de 96 puits noir. Signal en unités relatives de fluorescence (RFU) à partir de tous les acides aminés butre histidine (trace noire en pointillés) était négligeable. Concentrations (B) nanomolaires de BNT-II (▪) et rcHRP-II (♦) ont été titrés avec Ir1 dans HBS. Les peptides riches en histidine ont été incubées avec la sonde pendant 15 min dans une solution avant la lecture de l&#39;émission à 510 nm après excitation à 365 nm de la lumière. La limite de détection a été calculé comme la valeur de x lorsque y = 3σ vide. Cet &quot;interrupteur marche-&quot; de la phosphorescence de la sonde d&#39;iridium se produit parce que l&#39;état excité singulet (1 MLCT / 1 LC) de l&#39;Ir (III) bioconjugué subit croisement intersystème à l&#39;état excité triplet (3 MLCT), lorsque l&#39;histidine est coordonné au centre métallique. Cette sonde a été appliqué à BNT-II un peptide mimétique du biomarqueur du paludisme Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pf HRP-II). Dans un titrage de BNT-II avec IR1, une réponse de signal dépendant de la concentration a été observée ( <strong&gt; Figure 2B). Recombinant HRP-II (rcHRP-II) a également présenté une réponse similaire en solution. Les limites de détection des BNT-II et rcHRP-II de la solution étaient de 54,8 nM et 12,8 nM, respectivement. En utilisant des techniques d&#39;interférométrie biocouche, le K D de Ir1 lier à BNT-II immobilisé sur une surface Ni (II) NTA a été jugée 2,05 uM (figure 3). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Figure 3: cinétique en temps réel d&#39;analyse de Ir1 avec BNT-II interférométrie couche biologique pour l&#39;analyse cinétique de diverses concentrations de liaison à Ir1 BNT-II sur la surface d&#39;un capteur de verre (II) Ni NTA.. Après équilibrage des capteurs kb (région A), les capteurs sont chargés avec 0,5 uM BNT-II (région B). Une fois que le peptide est chargé sur les capteurs, une ligne de base est établie (région C) avant de mesurer l&#39;association de Ir1 au BNT-II (région D). Aprèsune période d&#39;association, les capteurs sont placés de nouveau dans KB pour mesurer dissociation (Région E). L&#39;ensemble du processus d&#39;analyse cinétique prend moins de 30 minutes. Lors d&#39;une transition à partir d&#39;un essai à base de solution à une plate-forme de particules magnétiques, la complexité accrue de la particule dans le système doit être prise en compte. Il était connu de travaux antérieurs, que ces particules se lient efficacement le paludisme biomarqueur pf HRP-II. 24 plaques fluorescentes noires ont bien travaillé pour le dosage de la solution décrit ci-dessus, mais les plaques blanches étaient mieux adaptés à la plate-forme de détection sur-particules, comme vu dans la figure 4A. Dans une assiette blanche, la lumière est réfléchie dans l&#39;échantillon, ce qui permet une meilleure absorption par le Ir1 lié à la surface de la particule. Dans l&#39;essai sur-particules, la limite de détection de rcHRP-II a été déterminée à 14,5 nM (figure 4B). La limite de détection pour rcHRP-II en solution et sur-talon sont statisquement la même basée sur une test t non apparié (p = 0,731). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Figure 4:. Sur-perle Détection de BNT-II et HRP-II (A) différence entre le signal détecté à partir Ir1 lié à BNT-II sur la surface de 50 um Ni particules agarose (II) NTA magnétiques dans un noir 96- ainsi plaque (trait plein) par rapport à une plaque de 96 puits blanc (ligne pointillée). Les particules ont été excités avec lumière à 365 nm, et l&#39;émission a été mesurée à 510 nm. (B) Le titrage de rcHRP-II immobilisé sur des particules magnétiques et détecté en utilisant Ir1. La limite de détection a été calculé comme le VALue de x lorsque y = 3σ vide. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Figure 5: Représentation schématique de la détection sur-cordon de rcHRP-II avec Ir1 régime général de HRP-II se lier à la surface de Ni (II) NTA Les particules et marqué avec Ir1.. Les particules sont incubées avec un peptide riche en histidine pendant 15 min. Après cette période d&#39;incubation, les particules sont lavées à l&#39;aide d&#39;un aimant HBST, afin de tirer les particules hors de la solution. Enfin, les particules de peptide lié sont incubées avec Ir1 pendant 1 heure avant la lecture de l&#39;émission à 510 nm après excitation à 365 nm de la lumière.

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IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Iridium (III) luminescent sonde pour la détection de la protéine riche en histidine Malarial biomarqueurs protéines-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.0K vues.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

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LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

LabVIEW fonctionnant Osmomètre nanolitre Novel des enquêtes de glace Binding Protein

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Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

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Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

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Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthèse des bioconjugués protéiques<em&gt; via</em&gt; Cystéine-maléimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

Couleur Test ponctuel comme un outil présomptif pour la détection rapide des Cathinones de synthèse

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

Collection de souffle auprès des enfants pour la découverte de biomarqueurs de la maladie

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

Préparation et application d’un nouveau Biocapteur bactérien pour la détection présumée de résidus de balles

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...