Les auteurs tiennent à remercier Technologies Inc Zoiray, un partenaire co-sponsor et la commercialisation, pour son soutien.

1. Préparation du support <ol><li> Manteau couches de silicium SiO 2 substrats avec l&#39;auto-adsorbant copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Synthèse de copolymère, la structure chimique et procédé de revêtement sont publiés dans: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caractérisation d&#39;un revêtement polymérique adsorbées des diapositives ADN Microarray de verre. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> En bref, préparer la solution de polymère par ajout de 100 mg de polymère à 5 mL d&#39;eau désionisée (DI) d&#39;eau et ajoutez 5 ml de sulfate d&#39;ammonium saturé à 40% ((NH 4) 2SO 4) solution pour atteindre une concentration finale de 0,92 M. </li><li> Plonger dans une solution de puces pendant 30 min sur un agitateur, puis rincer abondamment à l&#39;eau DI. Séchez soigneusement à l&#39;Argon / gaz N 2. </li><li> Cuire les puces à 80 ° C pendant 15 min. </li></ol></li><li> Boutique revêtu de polymère substrats / chips dans un environnement sec (dessiccateur à vide) pour un maximum de 3 mois jusqu&#39;à la sonde spotting procédure. </li></ol> 2. Préparation du réseau de sondes: anticorps, des antigènes, ss / dsADN, ARN, etc <ol><li> Diluer la sonde (s) à la concentration appropriée dans le tampon désiré. Cette étape peut être varier considérablement, mais une expérience typique utilise un antigène ou d&#39;IgG à une concentration de 0,5 mg / mL (plage de 0,1 -1 mg / ml) en tampon phosphate salin (PBS) à pH ≈ 7,4. </li><li> Placer les solutions dans un 96 - ou 384 puits (ou de la plaque source standard pour l&#39;observateur est utilisé) </li><li> Configuration des paramètres pour repérer array imprimées souhaité: déterminer les paramètres appropriés de repérage pour la surface et des solutions utilisées (temps de séjour, les vitesses d&#39;approche, etc.) Déterminer le nombre de répétitions de chaque condition par grille, la disposition en grille, le nombre de grilles de reproduire, et l&#39;emplacement désiré taches sur la puce. Placer la plaque et de substrats source dans les endroits appropriés, vérifiez bouteilles déchets et l&#39;approvisionnement sont prêts, et de commencer à lancer l&#39;impression. </li><li> Après avoir repéré est terminé substrats lieu dans un environnement très humide durant la nuit (4-18 heures) pour permettre processus d&#39;immobilisation et la désactivation de procéder. </li><li> Lavez substrats: les placer dans les solutions suivantes pour trois minutes pour trois lavages distincts: PBS avec 0,1% de Tween (PBST), PBS, et enfin déminéralisée (DI) de l&#39;eau. Selon le type d&#39;expérience (humide vs sec), la puce sèche soigneusement avec du gaz argon et de commencer l&#39;incubation ou de placer la puce dans une chambre d&#39;écoulement et à assembler. </li><li> Désactiver autres groupes du NHS sur la surface de copolymère en submergeant les puces dans une solution de 50 mM d&#39;éthanolamine avec le pH ajusté à 7,4 pendant 30 minutes tandis que sur une plaque shaker. Un premier composé aminé tels que l&#39;hydroxylamine ou Tris peut également être utilisé, tant la solution préparée est sûr à utiliser avec des protéines. Rincer soigneusement la solution en utilisant la désactivation du PBS, puis de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Étape facultative (en fonction de la chimie de surface étant employé): surface du bloc en utilisant une solution de BSA, caséine, ou de lait réhydraté pendant 30 minutes. Pour la chimie de surface polymérique actuelles que nous utilisons, nous ne sommes pas effectuer cette étape que le squelette du polymère agit pour empêcher la protéine de liaison non-spécifique. </li></ol> 3. Acquisition de données et d&#39;incubation de procédure: le format Endpoint <ol><li> Faire une solution de la cible d&#39;intérêt dans le tampon désiré. Ici, ce sera une solution de la concentration appropriée de l&#39;anti-BSA dans du PBS (ex: faire ml 1-10 de 10 ng une / ml, solution d&#39;anti-BSA en PBS). Aussi, assurez-vous d&#39;avoir une quantité équivalente de tampon (sans cible) pour l&#39;incubation de contrôle négatif. </li><li> Prenez un miroir de balayage de silicium pour normaliser toutes les données recueillies par la suite. </li><li> Analyser le réseau de sondes préparées avec le système IRIS avant l&#39;étape d&#39;incubation pour déterminer la hauteur initiale optique (de masse) à chaque endroit. Cela permettra une analyse correcte des variations de la masse à la surface, c&#39;est à dire le niveau de la liaison, après l&#39;incubation. Ici, quelques paramètres seront ajustés pour l&#39;expérience actuelle, comme le temps d&#39;exposition, champ de vision, en se concentrant prospèrent, etc </li><li> Immergez puce (s) dans la solution préparée pendant 1 heure sur une plaque shaker. Le temps d&#39;incubation peut varier considérablement selon le niveau d&#39;agitation, la concentration de la cible étant détectée, les caractéristiques de transport de la chambre de circulation (si un mode de détection en temps réel est utilisée), les affinités de la paire cible-sonde, etc . </li><li> Après l&#39;incubation, répéter la procédure de lavage décrite à l&#39;étape 2.5) </li><li> Balayage du tableau même sonde en utilisant le système IRIS et d&#39;obtenir des images post-incubation pour la pré-incubation de comparaison. </li><li> Répétez ce processus pour différentes étapes d&#39;incubation, si nécessaire, par exemple dans un format de dosage sandwich où un anticorps secondaire est utilisé. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Monter les images recueillies pour chaque balayage de l&#39;iris (séquence d&#39;images d&#39;intensité), en utilisant le logiciel développé pour laboratoire Produire une image de la matrice de la sonde contenant des informations épaisseur optique. Une rapide analyse qualitative de liaison peut être effectuée en soustrayant (enregistrée) post-et pré-incubation des images. Reliure apparaîtra comme un changement dans l&#39;intensité à ces endroits où les changements de masse ont été observées. Pour l&#39;analyse quantitative, déterminer la densité de masse de chaque spot par rapport à l&#39;arrière-plan en faisant la moyenne des informations épaisseur optique pour chaque pixel dans un endroit et une couronne de l&#39;extérieur de l&#39;endroit et de faire une comparaison directe de ces deux domaines. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La figure 1 montre un schéma de l&#39;exemple de couches Si-SiO 2 substrat IRIS repéré avec une gamme d&#39;anticorps représentant. Chaque ensemble d&#39;anticorps est repéré dans répliquer avec une spécificité pour un épitope différent ciblant différentes protéines. Deux différents virus entier et une protéine virale sont représentés comme des cibles par exemple. Anticorps de contrôle négatif dépend du dosage et peut être non spécifiques et / ou spécifiques du virus. La figure 2 montre la liaison de l&#39;albumine sérique humaine (HSA) des anticorps spécifiques à un tableau d&#39;repéré HSA et IgG de lapin (contrôle) des taches. Comme vu ici, après le montage et la détermination des épaisseurs optiques pour les images pré-et post-incubation, une image de différence pour le tableau de liaison peut être créée pour évaluer qualitativement contraignant. L&#39;analyse quantitative révèle que 2,05 et 0,13 nanomètre modification moyenne hauteur optique a été observée pour le HSA et le lapin taches IgG, respectivement, pour une concentration d&#39;incubation anti-SAH de 500 ng / mL. La figure 3 montre une mesure de la dépendance en protéines IRIS fourrure contraignant sur la concentration de protéines et de la longueur d&#39;oligomères ADN double brin. Le graphique supérieur montre les mesures de hauteur absolue optique pour initiales immobilisé hauteurs de sonde oligomère et contraignant fourrure post-incubation. Des concentrations croissantes de la fourrure (50, 100, 200 nM) a entraîné liaison accrue aux sondes ADN. La longueur des oligomères impacts lie également la fourrure avec des séquences plus longues résultant en plus contraignantes. Ici, les barres d&#39;erreur représentent un écart-type de la moyenne. L&#39;intrigue du bas montre calculée dimère protéique fourrure contraignante par brin ADN double brin. Dimer liaison était significativement plus élevée à une concentration protéique de la fourrure du 200 nM suggérant un haut niveau de la liaison non spécifique. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma d&#39;un tableau par exemple la sonde normalement utilisés dans une expérience pour détecter les virus et composants spécifiques d&#39;une manière virale multiplexées avec le système IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Image de différence post-incubation de liaison de l&#39;albumine sérique humaine des anticorps spécifiques aux repéré HSA recueillies grâce à ce système sans étiquette, à une concentration de 500 ng / mL. La masse volumique biomatériau pour chaque spot est déterminée par la moyenne informations épaisseur optique dans un endroit et puis en comparant cela avec la moyenne d&#39;un anneau autour de la tache représentant le fond. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Parcelle de liaison de données pour les interactions entre protéines Fur avec repéré double brin oligomères avec une séquence consensus connue basée sur la longueur oligomère, l&#39;emplacement de la séquence consensus au sein de l&#39;oligomère et la concentration de protéines Fur. Informations sur le montant absolu de la protéine Fur liée à chaque séquence repérée (en haut) peuvent être utilisés pour estimer le nombre de dimères fourrure liés à chaque type d&#39;oligomère (en bas).

<ol>
	<li>&#214;zkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications.">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li><li>&#214;zkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches.">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li><li>&#214;zkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed,+high-throughput,+label-free,+and+dynamic+biosensing+platform.">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li><li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., &#214;zkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging.">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li></ol>

La plateforme IRIS est un système simple et rapide à utiliser pour la collecte à haut débit de liaison de données dans un format de biopuces. En immobilisant covalente différentes sondes fonctionnelles des protéines ou d&#39;ADN sur une surface, les antigènes cibles / biomarqueurs / etc. peuvent être capturés de la solution, comme dans un dosage immunologique. La mesure de ces interactions entre les conditions de sonde dans un terminal ou en temps réel de format avec le système IRIS permet d&#39;informations hautement sensibles et quantitatives à recueillir pour chaque interaction. L&#39;expérience représentative détaillé ici est juste un exemple des types d&#39;interactions qui peuvent être étudiés avec cette technique. La détection des facteurs de transcription, des antigènes viraux, et les virus tout entier a été démontré précédemment, et ne représente que quelques exemples des types d&#39;analyses que l&#39;iris peut facilement manipuler.

<ol><li> Plaquettes de silicium de 500 nm de dioxyde de silicium thermiquement grandi, la Silicon Valley Microelectronics, commande personnalisée <li> Poudre de sulfate d&#39;ammonium, Sigma-Aldrich chat. # A5132 <li> Tampon phosphate salin (PBS) concentré 10X prêt, Fisher Scientific chat. # BP665-1 <li> Anticorps à la sérum albumine humaine (anti-SAH), Sigma-Aldrich chat. # A0433 <li> L&#39;albumine sérique humaine (HSA), Sigma-Aldrich chat. # A9511 <li> Argon ou d&#39;azote gazeux (ultra-haute pureté), le chat Airgas. # Ou # AR UHP300 NI UHP300 <li> Boîtes de Pétri de 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific cat. # 0875713A <li> Scienceware ® sous vide dessiccateur, Sigma-Aldrich chat. # Z119016 <li> Microtubes Fisher Scientific chat. # 05-408-120 <li> Plaques de 96 puits, liaison cellulaire bas, Nalgene Nunc International chat. # 145399 <li> BioOdyssey Calligraphe MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Éthanolamine, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hydroxylamine, Thermo Scientific chat. # 26103 <li> Multi-usage des rotateurs, Thermo Scientific (Barnstead International), le modèle # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R appareil, chat QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> Source d&#39;illumination ACULED, PerkinElmer, commande personnalisée <li> Les composants optiques (lentilles, objectifs, des ouvertures, des rails, poteaux, etc), Thorlabs </ol>

biomolecular detection employing the interferometric reflectance imaging sensor (iris)

La mesure sensible des interactions biomoléculaires a une utilisation dans de nombreux domaines et secteurs tels que la biologie et la microbiologie de base, le suivi environnemental / agricole / biodéfense, la nanobiotechnologie, et plus encore. Pour les applications de diagnostic, de surveillance (détection) la présence, absence, ou une expression anormale de biomarqueurs protéomiques humaines ou des cibles génomiques trouvées dans les échantillons de patients peut être utilisée pour déterminer les approches de traitement ou de l&#39;efficacité thérapeutique. Dans le domaine de la recherche, des informations sur des affinités et spécificités moléculaires sont utiles pour caractériser complètement les systèmes de l&#39;enquête. Bon nombre des systèmes actuels utilisés pour déterminer les concentrations moléculaires ou des affinités reposent sur l&#39;utilisation d&#39;étiquettes. Des exemples de ces systèmes comprennent immunoessais tels que le dosage immuno-enzymatique (ELISA), la réaction en chaîne polymérase (PCR), des dosages électrophorèse sur gel, et la spectrométrie de masse (MS). Généralement, ces étiquettes sont fluorescentes, radiologiques ou colorimétrique de la nature et sont attachés directement ou indirectement à la cible moléculaire de l&#39;intérêt. Bien que l&#39;utilisation d&#39;étiquettes est largement acceptée et a quelques avantages, il ya des inconvénients qui sont la stimulation du développement de nouveaux sans étiquette méthodes pour mesurer ces interactions. Ces inconvénients sont multiples facettes pratiques telles que le coût accru de dosage, durée de vie de réactifs et des préoccupations convivialité, de stockage et de sécurité, les pertes de temps et d&#39;efforts à l&#39;étiquetage et la variabilité entre les différents réactifs en raison des processus d&#39;étiquetage ou les étiquettes elles-mêmes. Sur une base de recherche scientifique, l&#39;utilisation de ces étiquettes peuvent également introduire de telles difficultés en ce qui concerne les effets sur la fonctionnalité des protéines / structure en raison de la présence des étiquettes apposées et l&#39;impossibilité de mesurer directement les interactions en temps réel. Présentée ici est l&#39;utilisation d&#39;un nouveau label sans biocapteur optique qu&#39;il se prête à des études de microréseaux, appelé capteur de réflexion interférométrique Imaging (IRIS), pour détecter les protéines, l&#39;ADN, le matériel antigénique, les agents pathogènes entiers (virions) et autre matériel biologique. Le système IRIS a été démontré que la sensibilité élevée, la précision et la reproductibilité des interactions biomoléculaires différentes [1-3]. Les avantages comprennent la capacité d&#39;imagerie multiplexe, en temps réel et des capacités de mesure d&#39;extrémité, et d&#39;autres haut-débit des attributs tels que la consommation de réactifs réduites et une réduction du temps de dosage. En outre, la plateforme IRIS est simple à utiliser, nécessite un matériel peu coûteux, et utilise à base de silicium massif composants de l&#39;essai de phase rend compatible avec de nombreuses approches contemporaines chimie de surface. Ici, nous présentons l&#39;utilisation du système IRIS de la préparation des réseaux de sondes à l&#39;incubation et la mesure des cibles contraignantes pour l&#39;analyse des résultats dans un format point final. Le système modèle sera la capture d&#39;anticorps cibles qui sont spécifiques pour l&#39;albumine sérique humaine (HSA) sur HSA repéré substrats.

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Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Quantitatives à haut débit, en temps réel, et sans étiquette de détection biomoléculaire (ADN, protéines, etc) sur SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Les surfaces peuvent être obtenus en utilisant une technique simple qui repose sur l&#39;interférométrie éclairage LED, un minimum de composants optiques, et une caméra. Le capteur de réflexion interférométrique Imaging (IRIS) est peu coûteux, simple à utiliser, et prêtent à puces formats.

Détection biomoléculaire employant le capteur interférométrique Réflectance Imaging (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

14.5K vues.  Boston University. Quantitatives à haut débit, en temps réel, et sans étiquette de détection biomoléculaire (ADN, protéines, etc) sur SiO 2 Les surfaces peuvent être obtenus en utilisant une technique simple qui repose sur l'interférométrie éclairage LED, un minimum de composants optiques, et une caméra. Le capteur de réflexion interférométrique Imaging (IRIS) est peu coûteux, simple à utiliser, et prêtent à puces formats.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

MICRO-creux à base de capteur pour multiplexée transdermique Sensing électrochimique

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

Conception et fabrication d&#39;une unité élastomère pour Soft robots modulaires en chirurgie mini-invasive

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Synthèse entraînée par micro-ondes de l&#39;oxyde de fer Nanoparticules pour la détection rapide de l&#39;athérosclérose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

Méthanol Expression indépendante de Pichia Pastoris employant des Technologies de la répression

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

D’imagerie intégrine Tension et Force cellulaire à résolution submicronique avec un capteur de Tension intégrative

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Évaluation des comportements photosynthétiques par des mesures simultanées de la réflectance des feuilles et des analyses de fluorescence de la chlorophylle

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...