La construction des membranes bicouches lipidiques décrites dans ce protocole peut être utilisée pour obtenir des informations cruciales sur les interactions membranaires avec les agents pharmaceutiques, les toxiques environnementaux et même les composés biologiques. Ces techniques peuvent être utilisées pour fabriquer des membranes de complexité liquide variable et pour évaluer la perméabilité, l’absorption et l’incorporation des composés dans les membranes. Pour commencer, ajoutez le volume approprié de solution mère lipidique dans un verre propre vile pour obtenir une concentration finale de vésicules de 2,5 milligrammes par millilitre après réhydratation.
Éliminer le chloroforme de la solution lipidique à l’aide d’un flux d’azote gazeux. Pour assurer l’élimination complète du chloroforme, connectez le film lipidique séché au vide pendant au moins quatre heures. Réhydrater le film lipidique séché avec un volume requis de tampon de chlorure de sodium Tris pour obtenir la concentration finale de vésicules de 2,5 milligrammes par millilitre, et vortex pendant environ 15 à 30 secondes.
Transférer la suspension de vésicule dans un récipient avec de la glace carbonique jusqu’à ce qu’elle soit congelée pendant environ 30 minutes. Une fois l’échantillon complètement congelé, décongeler la suspension dans un bain-marie de 30 à 40 degrés Celsius. Vortex la suspension de vésicule décongelée.
Pour faire un millilitre ou moins de vésicules, procurez-vous une mini extrudeuse. Pré-mouillez un support de filtre avec de l’eau ultra pure, puis placez-le sur la surface de support de membrane à l’intérieur du joint torique. Répétez l’opération pour le deuxième support de membrane interne.
Positionnez un support de membrane interne dans le boîtier extérieur de l’extrudeuse. Placez une membrane en polycarbonate de 100 nanomètres sur le support de membrane interne directement sur le support du filtre. Placez le deuxième support de membrane interne dans le boîtier extérieur de l’extrudeuse avec le joint torique et le côté du support du filtre face à la membrane en polycarbonate.
Fixez le roulement en polytétrafluoroéthylène dans le nœud de retenue et vissez-le fermé avec le boîtier extérieur de l’extrudeuse. Clipsez l’extrudeuse dans le bloc chauffant. Chargez la suspension de vésicule lipidique dans l’une des seringues et positionnez la seringue dans le bloc thermique de l’extrudeuse, en insérant complètement l’aiguille dans une extrémité de l’extrudeuse.
Insérez la deuxième seringue vide dans le côté opposé et verrouillez les deux seringues à l’aide des clips de bras sur le bloc chauffant. Poussez lentement la suspension de vésicule dans la seringue vide, puis dans la seringue d’origine. Répétez 20 fois de plus pour un total de 21 passages à travers la membrane en polycarbonate.
Transférez les vésicules lipidiques dans un verre propre vile pour le stockage. Pour extruder cinq à 50 millilitres de vésicules, assemblez la grande extrudeuse en plaçant le support de l’écran à grand trou, le disque centré, les disques de drainage et la membrane en polycarbonate dans l’espace du support inférieur de l’extrudeuse. Connectez les supports supérieur et inférieur de l’extrudeuse à l’aide des quatre vis et serrez.
Fixez l’unité d’extrusion au cylindre d’échantillon en la frottant vers le bas et en la serrant avec une clé à fixer. Remplissez le cylindre d’échantillon avec de l’eau ultrapure et extrudez l’eau à travers l’unité d’extrusion avant d’ajouter l’échantillon dans le cylindre d’échantillon. Ajouter la suspension de vésicule lipidique dans le cylindre d’échantillon et visser le dessus fermé.
Augmentez lentement la pression jusqu’à ce que l’échantillon commence à s’égoutter de l’unité d’extrusion à une vitesse d’environ deux à trois gouttes par seconde dans un verre propre vile. Une fois que tout l’échantillon a été extrudé, coupez l’alimentation en azote et relâchez la pression dans le cylindre d’échantillon en ouvrant lentement la soupape de surpression. Versez les vésicules lipidiques dans le cylindre d’échantillon et répétez l’étape précédente neuf fois de plus pour un total de 10 extrusions.
Chargez la suspension de vésicule dans la cuvette appropriée et insérez-la dans l’instrument de diffusion dynamique de la lumière, entrez les détails de l’échantillon et effectuez la mesure à l’aide du logiciel associé. Placez la cellule zêta dans la chambre d’échantillonnage, en vous assurant que les électrodes sont en contact, et fermez le couvercle du porte-échantillon. Dans le logiciel associé, entrez les détails de l’échantillon et collectez les mesures.
Insérez le capteur de cristal de quartz codé à la silice dans le module d’écoulement, en vous assurant que la forme en T sur le cristal s’aligne sur la forme en T sur le module et vissez le module d’écoulement fermé. Dans les instruments à chambres multiples, des bicouches supplémentaires peuvent être formées en parallèle. Connectez le tuyau d’entrée et de sortie au module de débit et à la pompe.
Placez le tube dans les protecteurs de maintien et fermez le couvercle du système d’analyse. Placez un conteneur à déchets à la sortie de la pompe pour collecter les solutions usées. Pour effectuer le nettoyage, allumez d’abord la pompe et réglez la vitesse d’écoulement à 400 microlitres par minute.
Insérez le tube d’entrée dans de l’eau ultra pure et faites couler cinq à 10 millilitres à travers le module. Basculez le tube dans la FDS et faites circuler cinq à 10 millilitres à travers le module. Retournez le tube dans de l’eau ultra pure et faites couler 10 à 20 millilitres à travers le module.
Enfin, faites circuler l’air à travers le module jusqu’à ce qu’aucune solution restante ne soit collectée. Retirez le capteur du module de débit et rincez-le à l’eau ultra pure. Entraînez le capteur et le module de débit avec un flux d’azote gazeux, en vous assurant que l’électrode reste toujours exempte de tout liquide.
Dans une hotte à fumée chimique, insérez le capteur de cristal de quartz revêtu de silice dans un instrument de nettoyage ultraviolet ou à l’ozone. Allumez l’instrument et laissez le traitement pendant au moins deux minutes. Retirez soigneusement les capteurs et retournez-les dans le module de flux.
Allumez l’instrument de l’analyseur pour connecter le logiciel associé et réglez la température à la valeur souhaitée pour former la bicouche lipidique de soutien. Laissez la température se stabiliser à l’entrée souhaitée. Configurez la mesure et recherchez toutes les fréquences de résonance du capteur et la dissipation pour les harmoniques trois, cinq, sept, neuf, 11 et 13 avant de commencer la mesure.
Laissez le chlorure de sodium Tris s’écouler à travers le module pendant cinq à 10 minutes, en veillant à ce que le changement de fréquence de base ou le changement de Delta F et de dissipation ou les valeurs Delta D dans le liquide restent stables. Arrêtez la pompe, retirez le tuyau d’entrée de la solution de chlorure de sodium Tris et insérez-le soigneusement dans la solution de vésicule lipidique. Refoulement pendant cinq secondes pour éliminer les bulles d’air du tuyau d’entrée, puis continuer le flux vers l’avant.
Redémarrez la mesure dans le logiciel pour mettre à zéro la ligne de base. Circulez les vésicules lipidiques jusqu’à ce que la formation de bicouches soit observée en temps réel dans le logiciel d’acquisition de données. Répétez ensuite cette étape pour changer le tube d’entrée des vésicules lipidiques en tampon de chlorure de sodium Tris.
Ajouter cinq microlitres de la solution lipidique au compartiment donneur, qui est une plaque filtrante poreuse en polyvinylidène difluorure 96 puits multi-écran avec une taille de pore de 0,45 micro mètre. Immergez immédiatement la plaque filtrante dans le compartiment accepteur, qui est une plaque réceptrice de transport contenant 300 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate. Ajouter 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate dans le compartiment donneur de transport.
Suivez les étapes précédentes consistant à arrêter la pompe et à remplacer le tube d’entrée par une solution de vésicule lipidique et à observer la formation de bicouches, puis remplacez le tube d’entrée par la solution alpha hélicoïdale ou peptidique AH. Introduisez la solution dans le module d’écoulement jusqu’à ce qu’un changement de fréquence et un changement de dissipation soient observés à partir de l’ajout de la nouvelle solution. Arrêtez la pompe et laissez le peptide AH incuber avec les vésicules pendant 10 minutes.
Changez le tube d’entrée en chlorure de sodium Tris et commencez le flux pour éliminer le peptide AH des vésicules rompues, ce qui conduit à la formation réussie d’une bicouche lipidique. Tout d’abord, faites couler le solvant de la molécule, puis basculez le tuyau d’entrée dans la solution contenant la molécule d’intérêt et faites couler pendant au moins cinq minutes. Si vous le souhaitez, arrêtez l’écoulement et laissez le liquide contenant la molécule désirée incuber avec la bicouche.
Remplacez le tuyau d’entrée par le solvant moléculaire seul. Débitez pendant au moins cinq minutes, puis basculez le tuyau d’entrée en chlorure de sodium Tris et faites couler pendant au moins cinq minutes. Dans le logiciel, arrêtez la mesure, enregistrez le fichier et arrêtez la pompe.
Immédiatement après les étapes précédentes pour une bicouche en suspension unilipidique ou pour une bicouche suspendue multilipidique, retirez le PBS du compartiment de la plaque filtrante du donneur et remplacez-le par 200 microlitres de la solution d’essai. Immergez-vous immédiatement dans une nouvelle plaque réceptrice de transport avec 300 microlitres de PBS. Après incubation avec un balancement doux pendant deux heures à 25 degrés Celsius, prélever 150 microlitres de la solution dans les compartiments donneur et accepteur.
Mesurer la concentration de la molécule dans les deux échantillons en utilisant une méthode appropriée basée sur les propriétés de cette molécule. La taille, la polydispersité et le potentiel zêta des vésicules PC de l’œuf unilipidique, ainsi que deux compositions de vésicules multilipidiques ont été comparées. La distribution granulométrique des vésicules PC de l’œuf et des vésicules multilipidiques était presque identique.
Les vésicules multilipidiques de l’œuf et du PC ont été chargées négativement, tandis que les vésicules multilipidiques ont été chargées positivement. Les vésicules PC d’oeuf unilipidique facilement absorbées à la surface, comme le montre la diminution du changement de fréquence et l’augmentation du changement de dissipation, suivie d’une rupture spontanée. Les vésicules multilipidiques sont absorbées à la surface, mais nécessitent l’ajout de peptide AH pour rompre les vésicules, ce qui entraîne la formation de bicouches lipidiques.
Avec les bicouches lipidiques prises en charge, le changement de fréquence et le changement de dissipation peuvent être analysés avant et après l’introduction d’un composé d’intérêt. Par exemple, les interactions du DEHP et du toxique environnemental avec l’uni et le multicouche supporté par couches ont été étudiées. Des niveaux similaires d’absorption du DEHP ont été observés pour les deux types de bicouches lipidiques.
Cependant, des différences dans le changement de dissipation ont été observées entre les bicouches avec un changement de dissipation plus important observé pour la bicouche PC de l’œuf par rapport à la bicouche multilipidique une. Peu de perméation a été observée pour les bicouches uni-lipidiques et multi-lipides. À la suite de cette procédure, une variété de bicouches lipidiques imitant les cellules peut être développée pour permettre le criblage sans cellule des interactions moléculaires avec des composés allant des produits pharmaceutiques aux toxiques environnementaux.
