Les tests manuels de synergie des tableaux à damier sont une méthode à forte intensité de main-d’œuvre et sujette aux erreurs. En revanche, notre méthode automatisée de damier à jet d’encre améliore considérablement la vitesse, la précision et le débit. La méthode de damier automatisé permet de filtrer un grand nombre de médicaments pour les combinaisons synergiques, tandis que la méthode de temps-tuer peut confirmer et explorer davantage l’activité de ces combinaisons.
La découverte d’antibiotiques nouveaux ne suit pas le rythme de la propagation de la résistance, mais l’étude des combinaisons synergiques offre une possibilité de sauver les médicaments existants pour traiter les bactéries résistantes. Bien que nous démontrons cette technique avec les antibactériens, elle pourrait également être utilisée avec d’autres classes d’antimicrobiens ou même pour différents types de médicaments combinés ou de tests composés. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode automatisée de tableau de damier et une méthode manuelle de mise à mort du temps.
Nous suggérons d’effectuer des études de tableau de damier d’abord pour identifier des combinaisons prometteuses, puis d’étudier ces plus loin avec des études de temps-tuer. Pour commencer, faire des solutions de stock antimicrobien de colistine et de minocycline, puis effectuer un contrôle de la qualité sur les solutions de stock tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, ajoutez environ un millilitre de chlorure de sodium de 0,9 %, salin, à des tubes de culture en verre rond de 12 millimètres par 75 millimètres.
Sélectionnez une ou deux colonies à partir d’une plaque de bactéries pendant la nuit et placez-les dans les tubes de culture. Vortex les tubes doucement pour suspendre les bactéries dans la solution. Vérifiez la concentration de bactéries à l’aide d’un lecteur McFarland.
Ajustez la concentration en ajoutant plus de bactéries salines ou plus pour obtenir une lecture de turbidité McFarland de 0,5. Ensuite, diluer la bactérie d’un à 300 en ajoutant 100 microlitres de la suspension à 30 millilitres de bouillon Mueller-Hinton ajusté à la cation dans un tube conique de 50 millilitres pour atteindre une densité cellulaire finale de cinq fois 10 aux cinquièmes unités de formation de colonies par millilitre. Maintenant, préparez les antimicrobiens pour l’impression en suivant le protocole texte qui l’accompagne.
Enregistrez le protocole, puis cliquez sur le bouton Exécuter en haut à gauche, suivi du bouton Démarrer. Chargez une plaque de 384 puits dans le support de la plaque et appuyez sur Loaded under the Load Plate 1 Synergy prompt. Ensuite, placez une cassette T8+dans la fente de cassette, et appuyez sur Loaded sous la charge d’une invite T8+Cassette.
Lorsque cela est demandé, ajouter une solution de stock d’antibiotiques aux réservoirs indiqués sur la cassette. Après l’ajout de chaque solution, appuyez sur le bouton Rempli. Une fois que le distributeur D300 a ajouté du stock d’antibiotiques dans des volumes appropriés à chaque puits et que la boîte Run Completed apparaît, cliquez sur Fermer, retirer la plaque et éteindre le D300.
Ensuite, versez la suspension bactérienne préalablement préparée dans un réservoir stérile de reagent. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de la suspension à tous les puits du tableau de damier. Ajouter ensuite 50 microlitres de bouillon Mueller-Hinton ajusté à la cation sans bactéries à un puits vide.
Ce sera le contrôle négatif bien pour confirmer la stérilité des médias. Incuber dans un incubateur d’air ambiant de 35 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. Pour analyser le test, suivez le protocole texte qui l’accompagne.
Pour le test de synergie time-kill, préparez à nouveau les solutions de stock antimicrobien décrites dans le protocole texte. Ensuite, faire une suspension 0,5 McFarland de l’organisme d’essai en solution saline stérile. Ajouter 100 microlitres de la suspension 0,5 McFarland à cinq millilitres de CAMHB dans un tube de culture ronde en verre de 25 x 150 millimètres avec fermeture en acier inoxydable, et vortex doucement mélanger.
À l’aide d’une boucle stérile d’inoculation, l’isolement strie une goutte de la suspension diluée sur une plaque d’agar sanguin, et incuber la plaque à 35 degrés Celsius dans l’air ambiant pour confirmer la pureté de l’inoculum. Remplacez la fermeture du tube et incubez-la dans un support de tube à essai sur un shaker à 35 degrés Celsius dans l’air ambiant pendant au moins 3 heures, jusqu’à ce que la croissance de la phase logarithmique soit atteinte. Pendant que la culture initiale est en incubation, ajoutez 10 millilitres de bouillon Mueller-Hinton ajusté à la cation à cinq tubes de culture en verre autoclavés.
Pour une étude de synergie time-kill, au moins un médicament devrait être à une concentration qui n’affecte pas la courbe de croissance individuellement. Cela peut être déterminé en évaluant les effets des concentrations individuelles de médicaments avant l’étude de synergie. Au premier tube, ajouter 10 microlitres de stock de colistine d’un milligramme par millilitre pour obtenir une concentration finale de colistine d’un microgramme par millilitre, car il s’agit d’une concentration inefficace par rapport à la souche utilisée dans cet exemple.
Pour le deuxième tube, ajouter 10 microlitres de stock de minocycline d’un milligramme par millilitre pour obtenir une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Cette concentration est également inefficace par rapport à la souche utilisée dans cet exemple. Au troisième tube, ajouter 10 microlitres de stock de minocycline d’un milligramme par millilitre et 10 microlitres de stock de colistine d’un milligramme par millilitre.
Il s’agit de la même quantité de colistine et de minocycline utilisée dans les tubes un et deux. Dans les quatrième et cinquième tubes, n’ajoutez pas d’antibiotiques. Ce sera le contrôle de la croissance et les tubes de contrôle négatifs, respectivement.
Ensuite, préparez 96 plaques de polypropylène puits profonds avec des puits de deux millilitres pour les dilutions en série en ajoutant 900 microlitres de solution saline stérile aux rangées B à H des colonnes un à quatre avec une pipette multicanal. Lorsque la culture est en phase de croissance logarithmique, retirez le tube de culture du shaker et vortexez-le doucement. Transférez un millilitre de suspension dans un tube de culture de verre de 12 par 75 millimètres et vérifiez la densité avec un lecteur McFarland.
Si la densité est inférieure à 1,0 McFarland, remettre le tube au shaker et incuber plus longtemps. S’il est supérieur à 1,0 McFarland, ajouter le bouillon Mueller-Hinton ajusté à la cation au tube, vortex doucement et réé échantillonner jusqu’à ce que la suspension soit à 1,0 McFarland. Il est important que la culture soit en phase de croissance logarithmique lors de la préparation de l’inoculum de départ.
Vous pouvez construire une courbe de croissance pour déterminer quand un organisme atteint cette phase. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la suspension 1.0 McFarland aux tubes un à quatre, et vortexez-les doucement. Immédiatement après le mélange et à une, deux, quatre, six et 24 heures, retirez un aliquot de 150 microlitres de chaque tube de culture en inclinant le tube de sorte que seule la pointe stérile de pipette entre dans le tube et non l’arbre stérile de pipettor pendant le retrait d’aliquot.
Ajouter des aliquots, respectivement, à des puits consécutifs dans la première rangée de la plaque de puits 96 précédemment préparée. Remettre les tubes dans un support de tube à essai sur un shaker dans un incubateur d’air ambiant de 35 degrés Celsius immédiatement après avoir enlevé les aliquots à chaque point de temps. À l’aide d’une pipette multicanal, retirer 100 microlitres de la rangée A de la plaque et l’ajouter à la rangée B, contenant 900 microlitres de solution saline, créant une dilution d’un à 10.
Pipette la solution de haut en bas quatre à cinq fois pour mélanger, puis jeter les conseils. Tout d’abord, étiquetez les plaques d’agar Mueller-Hinton avec les conditions antibiotiques et la dilution à plaquer. Ensuite, plaquez les échantillons dilués pour le dénombrement des colonies à l’aide de la méthode de la plaque de chute, à l’aide d’une pipette multicanal avec des pointes extra-longues.
Retirez 10 microlitres de chaque puits dans la colonne 1 et distribuez-les soigneusement dans une rangée sur la plaque étiquetée de façon appropriée. Continuer jusqu’à ce que toutes les lignes soient distribuées sur les plaques. En outre, au point de temps de 24 heures, placez une baisse de 10 microlitres prise directement du tube de commande négatif sur l’endroit dédié pour cela afin de tester la stérilité.
Puis, inverser toutes les assiettes, et les incuber pendant la nuit à 35 degrés Celsius dans l’air ambiant. Ensuite, comptez le nombre de colonies sur chaque zone et calculez la densité cellulaire. Marquer les colonies avec un marqueur permanent à pointe fine au verso de la plaque pour éviter le double comptage ou les colonies manquantes.
Pour chaque série de dilution, identifier les gouttes avec trois à 30 colonies. Comptez les colonies dans ces gouttes, et enregistrez le nombre avec le facteur de dilution. On y voit une grille d’une expérience de synergie de table à damier dans laquelle la minocycline dans des concentrations de zéro à 32 microgrammes par millilitre a été combinée avec de la colistine à des concentrations de zéro à 16 microgrammes par millilitre et testée contre une souche d’E.coli.
Les puits dont les valeurs d’OD600 sont inférieures à 07 ne représentent aucune croissance et sont gris ombragés, tandis que les puits dont les valeurs oD600 sont supérieures ou égales à 07 représentent la croissance et sont vert ombragé. Pour chaque médicament, la concentration inhibitrice minimale est la plus faible concentration de médicaments qui inhibe la croissance bactérienne. Pour la minocycline, c’est 32 microgrammes par millilitre, et pour la colistine, c’est huit microgrammes par millilitre.
L’ombrage est conservé ici, mais les valeurs dans les puits dans lesquels la croissance est inhibée sont remplacées par la concentration inhibitrice fractionnelle, ou FIC, valeurs de l’indice. Dans chaque puits, l’indice FIC de chaque médicament est calculé en divisant la concentration d’antibiotiques dans ce puits par la concentration inhibitrice minimale du médicament. Les puits dont l’indice FIC est inférieur ou égal à 0,5, ce qui est considéré comme le seuil de synergie, sont indiqués avec une bordure de ligne brisée, et le puits ayant l’indice FIC le plus bas est en gras.
Étant donné que la valeur FIC minimale se trouve dans la plage synergique, la combinaison est considérée comme synergique. Un exemple d’un cas qui ne démontre pas la synergie est montré ici, car l’indice FIC minimum auquel la croissance est inhibée est un, qui est supérieur à 0,5. Enfin, dans cet exemple, plusieurs puits sautés se sont produits, ce qui représente une croissance bactérienne inhibée, malgré la présence d’une croissance bactérienne dans les puits adjacents avec des concentrations plus élevées d’antibiotiques.
Si plus d’un puits sauté s’est produit dans un tableau de damier, les résultats doivent être jetés et l’analyse répétée. Un exemple d’un graphique démontrant les résultats d’un essai de synergie time-kill est présenté ici. Veuillez consulter le protocole texte qui l’accompagne pour plus de détails sur l’interprétation de l’analyse de synergie time-kill.
De plus amples informations sur l’activité des combinaisons synergiques peuvent être obtenues grâce à des évaluations de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamique et par des études in vivo avec des modèles animaux. Suivez toujours les procédures de sécurité appropriées, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle, lorsque vous travaillez avec des bactéries. Si vous générez des aérosols ou utilisez des agents pathogènes à risque élevé, effectuez tous les travaux dans une armoire de biosécurité.
