Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 et NRF2015NRF-POC0001-19), le Conseil national de la recherche médicale (NMRC / CBRG / 0005/2012), et l&#39;Université technologique de Nanyang à CNM

1. Formation de prises en charge lipidique en deux couches sur un support solide hydrophile <ol><li> Préparer des solutions lipidique sous licence de 10 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et 1 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE) en dissolvant les poudres lipidiques respectifs (adéquatement pesé au préalable avec un bilan de masse analytique) dans une solution d&#39;isopropanol. </li><li> Diluer et mélanger les solutions d&#39;achat d&#39;actions à l&#39;isopropanol afin de préparer le mélange lipidique souhaité à la concentration finale. Pour les expériences de microscopie par fluorescence et FRAP, 0,5% en poids de Rh-PE doit être inclus dans le mélange de lipides. </li><li> Injecter le mélange de lipides dans de l&#39;isopropanol dans le canal microfluidique jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit rempli. </li><li> Incuber le mélange de lipides sur la surface en verre pendant environ 10 min. </li><li> Remplacer progressivement la solution lipidique avec une solution d&#39;eau ou un tampon en utilisant une pompe péristaltique à un débit très faible(10 à 50 pi / min). En variante, remplacer le mélange lipidique par pipetage répété. </li><li> Rincer le canal à fond avec le tampon en excès afin d&#39;éliminer l&#39;isopropanol résiduel. </li></ol> 2. Formation des membranes supportées enrichi en cholestérol Remarque: La surface solide (SiO 2) prend en charge la fusion des vésicules, mais la composition de la membrane (taux élevé de cholestérol) inhibe la fusion des vésicules parce vésicules enrichies en cholestérol ont haute rigidité à la flexion 30. <ol><li> Préparer une solution de réserve contenant 10 mg / ml DOPC lipides, 10 mg / ml de cholestérol, et de 1 mg / ml Rh-PE en dissolvant d&#39;abord les poudres respectives dans l&#39;isopropanol. </li><li> Répétez les étapes 1,2-1,6 en utilisant les solutions d&#39;achat d&#39;actions préparés à l&#39;étape 2.1. </li></ol> 3. Membrane Fluidity Assay <ol><li> Immerger la lame de verre dans du dodécyl sulfate (SDS) solution de sodium (1%) pendant 10 min. </li><li> Laver les lames avec de l&#39;eau déminéralisée et rincer l&#39;esprith éthanol. </li><li> Séchez diapositives à l&#39;aide d&#39;un faible courant d&#39;azote. </li><li> Exposer les lames à un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes à la puissance maximale de radiofréquence dans la chambre à plasma d&#39;oxygène. </li><li> Retirez la pellicule protectrice du fond commerciale chambre microfluidique (figure 1A) en utilisant une pince à épiler et fixer la lame de verre sur le côté collant de la chambre (figure 1B). </li><li> Assembler les connecteurs et tubes dans les positions d&#39;entrée et de sortie de la chambre et les placer sur le canal microfluidique la platine du microscope (Figure 1C). </li><li> Former une bicouche lipidique marqué par fluorescence supporté dans le canal microfluidique [répétition de l&#39;étape 1 en utilisant la composition lipidique souhaité (par exemple, 0,5 mg / ml DOPC) comprenant 0,5% en poids de Rh-PE dans un solvant organique]. </li><li> Localisez le plan de bicouche avec une immersion dans l&#39;huile objectif 60X (NA 1,49) afin de capturer des images. </li><li> Prenez deux images pré-blanchiment, puis de photo-301; m de large tache circulaire avec un faisceau de 532 nm, 100 mW laser. Avant photoblanchiment, réchauffer le laser jusqu&#39;à ce que son intensité est devenue stable. Immédiatement après photoblanchiment, capturer une série d&#39;images toutes les 1 sec pendant 2 minutes afin de suivre la reprise de l&#39;intensité de fluorescence à l&#39;endroit blanchi. </li></ol> 4. Cholestérol Quantification Assay <ol><li> Exposer la puce de capteur à cristal de quartz revêtu de dioxyde de silicium à un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes à la puissance maximale de radiofréquence dans la chambre à plasma d&#39;oxygène. Retirez la puce de la chambre et montez immédiatement la puce dans la chambre de mesure. </li><li> Avant l&#39;expérience, la première fréquence d&#39;acquérir et de dissipation de la puce de capteur dans l&#39;air afin d&#39;assurer un montage correct. <ol><li> Pour l&#39;instrument Q-Sense E1 ou E4 QCM-D commerciale, exécutez le logiciel Q-Soft et cliquez sur &quot;Acquisition&quot; et sélectionnez &quot;Mesure de configuration&quot;. </li><li> Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, cochez la 3, 5, 7, 9, 11 et 13 harmoniques et puis cliquez sur Find and Run afin de vérifier les spectres de résonance. Réglez la température à 24 ° C. Si une ou plusieurs fréquences de résonance ne sont pas d&#39;accord avec les valeurs attendues, vérifiez la puce de montage et re-exécuter cette étape jusqu&#39;à ce qu&#39;un accord soit atteint. </li></ol></li><li> Démarrer la pompe péristaltique et le débit de solution tampon (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) dans la chambre de mesure à un débit de 100 ul / min. </li><li> Dans le logiciel, cliquez sur &quot;Acquisition&quot; et sélectionnez &quot;Redémarrer mesure&quot; afin d&#39;enregistrer les signaux de dissipation de la fréquence de résonance et de l&#39;énergie. Répétez cette étape jusqu&#39;à ce qu&#39;une ligne de base stable pour la fréquence et de dissipation des changements. Remarque: Pour les étapes ci-après, il y aura des décalages de fréquence et de dissipation supplémentaires qui peuvent être enregistrés en fonction du temps. </li><li> Injecter de l&#39;isopropanol (sans lipides) pendant 10 min. </li><li> Injecter le mélange de lipides DOPC / cholestérol aurapport molaire désiré avec une concentration totale en lipides de 0,5 mg / ml dans de l&#39;isopropanol pendant 10 min. </li><li> Injecter tampon pendant 20 min à un débit de 100 ul / min. </li><li> Injecter une solution de 1 mM de méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) préparé dans un tampon (débit 100 pl / min) jusqu&#39;à ce que le signal de fréquence atteint une valeur stable. </li><li> Mesurer les décalages de fréquence positifs relatifs qui est causée par l&#39;étape de traitement MβCD et calculer la masse de cholestérol et DOPC lipides en convertissant les valeurs de Af cho et Af DOPC à des valeurs de masse à l&#39;aide de l&#39;équation Sauerbrey [Δm = - (C / N) × Af, où C = 17,7 ng / cm 2, n: harmonique]. </li><li> Calculer la fraction molaire de cholestérol dans le SLB, en prenant en compte les poids moléculaires des lipides DOPC (786,1 g / mol) et de cholestérol (386,6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Dans ce travail, un protocole solvant d&#39;échange est présenté dans laquelle les lipides dans de l&#39;alcool (isopropanol, l&#39;éthanol ou le n-propanol) sont incubées avec un support solide et ensuite l&#39;alcool est progressivement remplacé par une solution tampon aqueuse de manière à conduire une série des transitions de phase finalement produire des bicouches lipidiques de phases lamellaires-24. Il est démontré que le procédé permet la fabrication de bicouches lipidiques supportées sur des surfaces telles que l&#39;or, qui est insoluble à la vésicule procédé de fusion. Une plage optimale de la concentration de lipides (de 0,1 à 0,5 mg / ml) a été déterminé pour la formation de bicouche complète dans des formats standards expérimentaux testés jusqu&#39;à présent. A des concentrations inférieures à 0,1 lipidiques mg / ml, discrètes, des correctifs microscopiques de bicouches formé. D&#39;autre part, à des concentrations supérieures à 0,1 mg / ml et inférieure à 0,5 mg / ml, une bicouche complet et uniforme est formée. A des concentrations de lipides au-dessus de cette plage, une bicouche fluide a été formé comme toujours vérified par analyse de FRAP, cependant, la microscopie par fluorescence révèle la présence de structures lipidiques supplémentaires au-dessus de la bicouche. Frappant de constater que la morphologie de ces structures lipidiques supplémentaires, comme déterminé par analyse QCM-D, dépendait de l&#39;alcool qui a été utilisée lors de l&#39;étape d&#39;incubation. Dans le cas de l&#39;éthanol, les variations Δ f et D ô relativement élevées ressemblent à la signature QCM-D pour obtenir une couche de la vésicule adsorbé. Lorsque l&#39;isopropanol ou le n-propanol a été utilisé à la place, le Δ f est légèrement supérieure à la valeur attendue pour une bicouche (f Δ finale entre -30 à -40 Hz), tandis que le Δ D était sensiblement plus élevé. De telles réponses QCM-D seraient attendus pour de longues structures lipidiques (par exemple, des micelles en forme de vers en saillie vers l&#39;extérieur à partir de) la surface de la membrane (comme visible par microscopie de fluorescence dans certains cas). Le taux de change solvant est un autre paramètre important qui peut être critique, especially lorsque les concentrations de lipides inférieurs (par exemple, 0,1 mg / ml) sont utilisés. Rapid échange de solvant à faible concentration en lipides peut conduire à la formation de bicouches incomplets. Dans la chambre de mesure standard utilisée pour les mesures QCM-D dans le présent document (chambre de mesure Q-Sense E4), les taux de l&#39;ordre de 100 pi / min de débit, sont appropriés pour la formation de bicouche complète hautement reproductible. Pour les cellules d&#39;écoulement avec d&#39;autres geometries et le volume, le débit optimal peut varier et doit être déterminée empiriquement sur la base des étapes proposées ici. En plus de former des bicouches lipidiques supportées sur des surfaces qui sont insolubles à la fusion des vésicules, la SALB peut être utilisée pour contourner le besoin de vésicules lipidiques qui peuvent se rompre, ce qui ouvre la porte à la fabrication de membranes supportées par des compositions complexes. A titre d&#39;exemple illustratif de composition, des mélanges de lipides avec une fraction élevé de cholestérol ont été examinés. Le cholestérol est une composante importante de mammalian Les membranes cellulaires, et peuvent approcher sa fraction de 45 à 50% en moles de la composition lipidique membranaire (par exemple, dans les globules rouges). Ainsi, même un modèle simple d&#39;une bicouche lipidique qui représente une membrane cellulaire humaine devrait comprendre cholestérol. Bien que la fusion des vésicules peut être utilisé pour fabriquer des bicouches lipidiques fluides ne contenant que 10 à 15% de cholestérol, le procédé SALB permet la formation de bicouches lipidiques fluides contenant des fractions élevées de cholestérol (jusqu&#39;à 57% en moles, telle que quantifiée par des mesures QCM-D) 36. Toutefois, lorsque le taux de cholestérol a été encore élevée (jusqu&#39;à 63% en moles), en forme de bande domaines ont été observés 37. Les domaines de co-existantes étaient liquide, rappellent ceux observés dans la région de β dans le diagramme de phase du cholestérol / phospholipides monocouche à l&#39;interface air-eau. Dans l&#39;ensemble, la méthode SALB se révèle être une approche simple et efficace pour former des bicouches lipidiques supportées, notamment in cas au-delà du champ d&#39;application de la méthode de vésicule fusion classique. Jusqu&#39;à présent, la technique de microscopie par fluorescence et de QCM-D ont été principalement utilisées pour caractériser les bicouches lipidiques supportées formés par le procédé SALB. Pour l&#39;avenir, un large éventail de mesures analytiques techniques de surface sensible, y compris la résonance plasmonique de surface (SPR) 38, la microscopie à force atomique (AFM) 39,40, Fourier-spectroscopie infrarouge à transformée 41, X-ray 42 et réflectivité de neutrons 43, peut être utilisés pour caractériser et étudier les configurations de bicouches simples et complexes à préparer par le procédé SALB plus loin. Ces capacités émergentes ouvrent la porte à un plus grand nombre de scientifiques qui peuvent explorer les membranes cellulaires artificiels en profitant d&#39;un protocole expérimental simple et robuste.

La bicouche lipidique sur support solide 1 (SLB) est une plate-forme polyvalente qui conserve les caractéristiques de base des membranes biologiques tels que l&#39;épaisseur de la bicouche, diffusivité lipidique à deux dimensions, et la capacité d&#39;accueillir des biomolécules associées à la membrane. En raison de la complexité des membranes cellulaires naturelles, cette plate-forme simple a été montré pour fonctionner comme une plate-forme efficace pour les études in vitro de processus liés à la membrane tels que la formation radeau 2, protéine de liaison 3, virus et contraignant particules virus-like 4,5 , et la signalisation cellulaire 6. Formé à proximité à un support solide, la plate-forme SLB est compatible avec une gamme de techniques de mesure en surface sensible comme totale microscopie de réflexion interne (FRBR), microbalance à cristal de dissipation de quartz (QCM-D), et la spectroscopie d&#39;impédance. Plusieurs méthodes ont été développées pour produire différents types de SLBS, y compris bulle d&#39;aireffondrement 7 et dip-pen nanolithographie 8 pour les taches lipidiques submicroniques, spin-coating 9 pour les piles bicouches et de Langmuir-Blodgett (LB) 10 et la fusion des vésicules (VF) 11 pour l&#39;ensemble de découpage, simples revêtements bicouches lipidiques. Procédé VF consiste en l&#39;adsorption de petites vésicules unilamellaires à un support solide et la rupture spontanée subséquente et de fusion pour former une bicouche lipidique continue. Toutefois, dans des conditions physiologiques, vésicule rupture spontanée est principalement limitée à des matériaux à base de silicium tels que le dioxyde de silicium, le verre et le mica. En outre, les vésicules rupture ne se produit pas spontanément des vésicules lipidiques de compositions complexes, tels que ceux contenant des fractions ou élevés de cholestérol des lipides chargés négativement. Selon le système, vésicule rupture peut être provoquée par la couture en outre les conditions expérimentales telles que la température 12, pH de la solution 13, 14 et de la salinité, un choc osmotique 15 </sup&gt; ou pression 16, ou l&#39;ajout d&#39;ions divalents tels que Ca2 + 17. Alternativement, l&#39;AH peptide de membrane-actif peut être introduit dans le but de déstabiliser une couche de vésicules adsorbées, conduisant à des vésicules rupture et la formation de bicouche sur une gamme de surfaces 18-22. En outre, la formation de bicouche réussie nécessite la préparation d&#39;une population bien contrôlé de petites vésicules unilamellaires qui peut être fastidieuse et difficile à réaliser pour certaines compositions de membrane. Par conséquent, en dépit de sa grande efficacité dans le meilleur des cas (par exemple, après une vaste prétraitement de gel-dégel de vésicules 23), l&#39;application générale de la fusion des vésicules est limité par la portée des substrats appropriés et des compositions membranaires. Le procédé assisté par solvant-24-28 bicouche lipidique (SALB) est une technique de fabrication de rechange qui ne nécessite pas des vésicules lipidiques. Le procédé est basé sur le dépôt of molécules lipidiques sur une surface solide en présence d&#39;un solvant organique miscible à l&#39;eau suivi d&#39;un échange progressive de ce solvant avec une solution aqueuse de tampon afin de déclencher la formation SLB. Au cours de l&#39;étape de solvant échange, le mélange ternaire de lipides, de solvant organique et de l&#39;eau subit une phase de série de transitions avec l&#39;augmentation de la fraction d&#39;eau, ce qui conduit à la formation de structures de phases lamellaires dans la solution en vrac et une SLB sur le substrat solide. Fait important, cette voie d&#39;auto-assemblage contourne la nécessité d&#39;une rupture des vésicules, qui est habituellement l&#39;étape limitante pour la transformation de vésicules adsorbées dans un SLB. Le protocole est applicable à une grande variété de surfaces, y compris le dioxyde de silicium, l&#39;oxyde d&#39;aluminium, le chrome, l&#39;indium oxyde d&#39;étain, et l&#39;or. Dans le présent document et dans la vidéo d&#39;accompagnement, une comparaison de dépôt de lipides par la vésicule SALB et méthodes de fusion est présentée. En particulier, l&#39;influence de paramètres expérimentaux, y compris la concentration de lipides, Vitesse d&#39;écoulement, et le choix du solvant organique miscible à l&#39;eau, sur la qualité de la double couche formée par le procédé SALB sont discutés. Caractérisation analytique des SLBS fabriqués est effectuée par le QCM-D, de microscopie par fluorescence, et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) techniques. Suivi QCM-D est une technique de mesure de la masse de surface sensible qui, depuis le travail de pionnier réalisé par Keller et Kasemo 29, a été largement utilisé pour étudier quantitativement la formation de bicouche. La microscopie à fluorescence permet l&#39;inspection de l&#39;homogénéité de la membrane ainsi que la visualisation des domaines membranaires. La technique de FRAP est un outil standard pour déterminer la mobilité latérale de molécules lipidiques dans une SLB, qui est une propriété essentielle des membranes fluidiques. La première partie de cette étude consiste à analyser QCM-D de la SALB et des procédés de fusion des vésicules appliqué à la formation de bicouche tenter de dioxyde de silicium et d&#39;or. Dans la deuxième partie,la préparation et la caractérisation de membranes supportées contenant une gamme de concentrations de cholestérol avec le procédé SALB sont mises en évidence et les résultats sont comparés à ceux obtenus par la méthode de fusion de vésicules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Afin d&#39;imiter les membranes cellulaires, la bicouche lipidique supportée (SLB) est une plate-forme qui permet attrayant dans l&#39;investigation in vitro des processus liés à la membrane, tout en conférant à la biocompatibilité et la biofonctionnalité des substrats solides. L&#39;adsorption spontanée et la rupture des vésicules de phospholipides est la méthode la plus couramment utilisée pour former SLBS. Toutefois, dans des conditions physiologiques, la fusion des vésicules (VF) est limitée à seulement un sous-ensemble de compositions lipidiques et des supports solides. Ici, nous décrivons un procédé général une étape appelée la méthode de formation assistée par solvant-lipide bicouche (SALB) afin de former SLBS qui ne nécessite pas de vésicules. Le procédé implique le dépôt SALB de molécules de lipides sur une surface solide en présence de solvants organiques miscibles à l&#39;eau (par exemple l&#39;isopropanol) et ultérieur solvant d&#39;échange avec une solution tampon aqueuse de manière à déclencher la formation SLB. L&#39;étape d&#39;échange de solvant continu permet l&#39;application de laProcédé selon une configuration d&#39;écoulement à travers convenant à la formation de la bicouche de surveillance et modification ultérieure en utilisant une large gamme de biocapteurs de surface sensible. La méthode SALB peut être utilisé pour fabriquer SLBS sur un large éventail de surfaces hydrophiles solides, y compris ceux qui sont insolubles à la fusion des vésicules. En outre, il permet la fabrication de composés de SLBS compositions lipidiques qui ne peuvent être préparés en utilisant le procédé de fusion de vésicules. Ici, l&#39;on compare les résultats obtenus avec les méthodes et la fusion des vésicules SALB classiques d&#39;illustration sur deux surfaces hydrophiles, du dioxyde de silicium et d&#39;or. Pour optimiser les conditions expérimentales pour la préparation de bicouches de bonne qualité préparés par le procédé SALB, l&#39;effet de divers paramètres, notamment le type de solvant organique dans l&#39;étape de dépôt, la vitesse d&#39;échange de solvant, et la concentration en lipides est traité en même temps que des conseils de dépannage . Formation des membranes supportées contenant fractions élevés de cholestérol est aussi démonstré avec la méthode SALB, soulignant les capacités techniques de la technique SALB pour une large gamme de configurations de membranes.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Nous présentons un protocole expérimental pour former une bicouche lipidique supporté sur des substrats solides, sans utiliser des vésicules lipidiques. Nous démontrons un procédé en une étape pour former une bicouche lipidique de dioxyde de silicium et l&#39;or ainsi que des membranes supportées par domaine enrichi en cholestérol pour diverses applications biologiques.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K vues.  Nanyang Technological University.  Nous présentons un protocole expérimental pour former une bicouche lipidique supporté sur des substrats solides, sans utiliser des vésicules lipidiques. Nous démontrons un procédé en une étape pour former une bicouche lipidique de dioxyde de silicium et l'or ainsi que des membranes supportées par domaine enrichi en cholestérol pour diverses applications biologiques. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant procédé d&#39;extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

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Bio-ingénierie

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymère Microneedle tableau Fabrication par photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d&#39;un Thin Film Polydiméthylsiloxane

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Une méthode de fabrication simple et évolutive pour les dispositifs électroniques organiques sur les textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Fabrication d’échafaudages Decellularise dérivé de Cartilage Matrix

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...